O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《締慰怪苽浼半p抗體夾心ELISA方法的初步建立

摘 要： 本研究旨在純化O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《究乖?，并制備單克隆抗體，為口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法純化O型口蹄疫Cathay毒株抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞，有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得2株能夠穩(wěn)定分泌特異性針對(duì)O型口蹄疫Cathay株病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為10E6與11C7。疊加試驗(yàn)表明，兩株單抗的疊加率為49.45%，識(shí)別不同的抗原表位。間接ELISA和IFA試驗(yàn)顯示，兩株單抗與O型口蹄疫Cathay株病毒具有良好的反應(yīng)性。單抗特異性檢測(cè)結(jié)果表明，2株單抗均能特異性識(shí)別Cathay株口蹄疫病毒，不與其他口蹄疫病毒毒株交叉反應(yīng)?？贵w亞型鑒定結(jié)果顯示，10E6單抗的輕鏈為Kappa鏈，11C7單抗的輕鏈為L(zhǎng)amda鏈，兩株單抗重鏈類型均為IgG2a。結(jié)果表明，本研究成功制備了兩株特異性結(jié)合O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《镜膯慰寺】贵w，兩株單抗均具有良好的反應(yīng)性與特異性。應(yīng)用兩株單抗建立O型口蹄疫Cathay病毒的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，該ELISA檢測(cè)方法特異性、重復(fù)性和敏感性良好，為O型口蹄疫Cathay毒株的快速診斷防控與研究建立了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： O型口蹄疫病毒；Cathay拓?fù)湫?；雜交瘤細(xì)胞；單克隆抗體；ELISA

中圖分類號(hào)： S852.659.6;S854.43

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4012-09

Preparation of Monoclonal Antibody against Cathay Topotype of FMDV Type O and Development

of Double Antibody Sandwich ELISA for Cathay Topotype of FMDV Type O

LIAO" Huancheng， SHI" Zhengwang， LUO" Juncong， WANG" Wanying， FENG" Lu， ZHOU" Jing， ZHANG" Fan， SHI" Xintai， TIAN" Hong*

（State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary Medicine，

Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000，" China）

Abstract：" This study aimed to purify the cathay topotype of foot-and-mouth disease virus （FMDV） type O and prepare monoclonal antibody to provide biological materials for the study of novel cathay strain of foot-and-mouth disease. The antigen of cathay strain of FMDV type O was purified by PEG precipitation method and immunized BALB/c mice. Hybridoma cells were prepared by fusion of spleen cells and SP2/0 cells. Positive cells were screened by indirect ELISA and subcloned by limited dilution method. Two hybridoma cells， named 10E6 and 11C7， which were able to secrete monoclonal antibodies specifically against O-type FMDV Cathay strain were obtained. Additivity assay showed that the additivity rate of the two mAbs was 49.45%， and different epitopes were identified.Indirect ELISA and IFA showed that the two strains had good reactivity with O-type FMDV Cathay strain. The results of monoclonal antibody detection showed that the two monoclonal antibodies could specifically recognize Cathay FMDV strains and did not cross-react with other FMDV strains. The results of antibody subtype identification showed that the light chain of 10E6 monoclonal antibody was Kappa chain， the light chain of 11C7 monoclonal antibody was Lamda chain， and the heavy chain type of both strains was IgG2a. The results showed that two monoclonal antibodies specifically binding to O-type FMDV Cathay topological strain were successfully prepared in this study. Both monoclonal antibodies had good reactivity and specificity. Two monoclonal antibodies were used to establish a double antibody sandwich ELISA method for detecting O-type FMDV Cathay strain. The ELISA method had good specificity， repeatability and sensitivity， which laid a foundation for the rapid diagnosis， control and research of O-type foot and mouth disease virus Cathay strain.

Key words： foot-and-mouth disease virus type O; Cathay topotype; hybridoma cells; monoclonal antibody; ELISA

*Corresponding author：" TIAN Hong， E-mail： xibeitian0931@163.com

口蹄疫（foot-and-mouth disease virus， FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染的動(dòng)物疫病，可快速遠(yuǎn)距離傳播［1-4］。FMDV是小RNA病毒科（Picornaviridae）、口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）的成員之一，包括7個(gè)血清型，即O、A、C、亞洲1型（Asia I）、南非（Southern African Territories， SAT）1、2、3型［5］。FMDV具有極高的突變率，在復(fù)制和傳播到新地區(qū)時(shí)迅速分化，血清型間沒有免疫交叉現(xiàn)象，即便在同一血清型內(nèi)，不同毒株的抗原性仍相差較大［6-8］。FMDV的分型主要以VP1基因的相似性為標(biāo)準(zhǔn)，同一血清型在不同的地理區(qū)域獨(dú)立進(jìn)化，產(chǎn)生不同的遺傳譜系而被分為不同的拓?fù)湫停?，9-10］。其中，O型FMDV已經(jīng)被定義了11種拓?fù)湫停?1］，抗原的多樣性給口蹄疫防控工作帶來了巨大困難。

FMDV在國(guó)際上主要在非洲、亞洲及南美洲部分地區(qū)流行［12-14］。近年來，因境外毒株傳入，造成中國(guó)口蹄疫疫情多發(fā)、流行毒株復(fù)雜的態(tài)勢(shì)。2017—2022年，中國(guó)共報(bào)道口蹄疫疫情54次，其中，O型51次，A型3次，以O(shè)型口蹄疫為主［15］。在我國(guó)流行的O型FMDV主要是古典中國(guó)（Cathay）、泛亞（Pan Asia）及東南亞（SEA）3種拓?fù)湫?。其中，口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《驹?970年和2005年左右，曾在我國(guó)先后流行并逐漸平穩(wěn)，2010年，O/Mya-98流行后，O/Cathay毒株已經(jīng)很少出現(xiàn)。但2016年以來，該毒逐漸增多，并且上升為主要危害毒株。2018年，O型Cathay毒株引起8次疫情，2020與2021年，亦引起了疫情發(fā)生。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，2016年以來，流行的口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《鞠噍^于以前流行的病毒差異很大，是Cathay拓?fù)湫筒《疽粋€(gè)新的可以穩(wěn)定遺傳的進(jìn)化分支［16］。國(guó)際上口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《局饕跂|亞-東南亞循環(huán)存在并流行［17-19］，且國(guó)內(nèi)外毒株的相似性均低于95%，據(jù)此不足以認(rèn)定國(guó)內(nèi)新毒株是由國(guó)外傳入或由國(guó)內(nèi)演化而來。同時(shí)，越南2017—2019年不同省份分離的Cathay毒株和越南舊毒株的相似性也同樣較低［20］，變異后的O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《緩膰?guó)外傳入的風(fēng)險(xiǎn)仍然需要重視［21］。據(jù)相關(guān)研究表明，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有疫苗毒株與新Cathay毒株的r值已低于0.3，國(guó)內(nèi)O型疫苗對(duì)新毒株的保護(hù)力和匹配性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，現(xiàn)有疫苗已經(jīng)不能為新Cathay毒株提供保護(hù)。Cathay新毒株與國(guó)內(nèi)其他流行毒株差異大，存在抗原變異，國(guó)外流行情況復(fù)雜，對(duì)O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《镜难芯恳殉蔀镕MDV防治的重中之重。目前，對(duì)Cathay新毒株的認(rèn)識(shí)仍處于初步階段，應(yīng)臨床檢測(cè)的實(shí)際需求，需開發(fā)特異性針對(duì)Cathay新毒株的單抗，為口蹄疫Cathay新毒株的防控提供技術(shù)支撐。

本研究制備并鑒定了2株特異性識(shí)別O型口蹄疫Cathay病毒的單克隆抗體，并建立了O型口蹄疫Cathay病毒的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，為防治新Cathay株口蹄疫病毒建立監(jiān)控體系提供參考，并為進(jìn)一步研究Cathay新毒株的抗原變異提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究使用的骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、口蹄疫O/Cathay、O/MYA98、O/BY/2010、OZK/93、O/HNXX/2013、O/JX/2010、AF/72、A/GDMM/2013與A/WH/09毒株均由蘭州獸醫(yī)研究所家畜病原學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；所有細(xì)胞均于37℃、一定濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；SPF級(jí)雌性6～8周齡 BALB/c小鼠由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；動(dòng)物試驗(yàn)嚴(yán)格按照《中華人民共和國(guó)動(dòng)物倫理學(xué)程序和準(zhǔn)則》的規(guī)范進(jìn)行處理，并經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)耗材和試劑

PBS、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇（PEG） 1500溶液、HAT、HT均購(gòu)自Sigma公司；IPTG、氨芐青霉素、卡那霉素均購(gòu)自Solarbio公司；青霉素/鏈霉素/兩性霉素B溶液（三抗）、DMEM、RPMI 1640、FBS均購(gòu)自Gibco公司。ELISA酶標(biāo)反應(yīng)板購(gòu)自Costar公司；抗體稀釋液購(gòu)自百迪泰公司；TMB購(gòu)自SurModics公司；Hybridoma Feeder添加因子（CM-2001）購(gòu)自蘇州博奧龍公司；Goat Anti-Mouse IgG Hamp;L （HRP） （ab205719）與Goat Anti-Mouse IgG Hamp;L （FITC） （ab6785）購(gòu)自Abcam公司。小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒（PK20002）購(gòu)自Proteintech Group公司；HRP標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司；兔抗O型口蹄疫病毒多抗血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 單克隆抗體的制備

1.3.1 口蹄疫病毒粒子的富集純化

將收集好的滅活病毒懸液4℃，8 000 r·min-1離心90 min，除去病毒懸液中的細(xì)胞碎片；取上清加入8%的PEG6000，4 ℃攪拌過夜，沉淀病毒粒子；攪拌好的液體8 000 r·min-1離心60 min，棄去上清液，適量PBS （pH=7.6）緩沖液重懸沉淀，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 雜交瘤細(xì)胞制備及間接ELISA檢測(cè)

取純化后的口蹄疫Cathay病毒與弗氏完全佐劑1∶1混合乳化后，采用背部皮下分點(diǎn)注射的方法以100 μg·只-1的劑量免疫6～8周齡的BALB/c小鼠。用弗氏不完全佐劑以相同的方式乳化病毒并免疫小鼠進(jìn)行二免和三免，每次免疫間隔14 d。用間接ELISA對(duì)首免前以及三免后兩周的小鼠血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，以首免前血清為陰性對(duì)照，將免疫血清S/Ngt;2.1時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋度定為抗體效價(jià)。融合前3 d，對(duì)免疫效價(jià)最高的1只小鼠通過腹腔注射200 μg純化口蹄疫Cathay病毒粒子（未乳化）進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞，在融合前一周復(fù)蘇凍存的SP2/0細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在融合前使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合前對(duì)小鼠進(jìn)行眼球采血并分離陽(yáng)性血清；使用PEG1500融合小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，融合后的細(xì)胞分散至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于含20% FBS、1%三抗、2% HAT、10%生長(zhǎng)添加因子的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；融合后7～10 d觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞克隆群生長(zhǎng)至一定數(shù)量后每孔吸取50 μL細(xì)胞上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，選擇檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋法亞克隆。亞克隆后的細(xì)胞在含20% FBS、1%三抗、2% HT、10%生長(zhǎng)因子的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；為保證克隆后的細(xì)胞群來源于單個(gè)細(xì)胞且遺傳穩(wěn)定，共亞克隆三次仍為陽(yáng)性細(xì)胞后定株。

使用兔抗捕獲O型口蹄疫Cathay病毒粒子進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)：1）將兔抗O型口蹄疫病毒多抗1∶2 000稀釋至碳酸包被緩沖液（pH 9.6）中，50 μL·孔-1，4 ℃包被聚苯乙烯板12 h。棄液，PBST洗板4次并拍干；2）將純化后的口蹄疫Cathay病毒粒子1∶1 000稀釋至PBS （pH=7.6）緩沖液中，50 μL·孔-1加入ELISA板中4℃捕獲12 h。棄液，洗滌方法同上；3）每孔加入120 μL 1% BSA封閉液4℃封閉10 h，棄液，洗滌方法同上；4）加入50 μL雜交瘤細(xì)胞上清，37℃孵育30 min，棄液，同上方法洗滌；5）加入50 μL HRP標(biāo)記的鼠二抗（1∶15 000），37℃孵育30 min，棄液，同上方法洗滌；6）每孔加入50 μL TMB，37℃避光孵育12 min；7）每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)，OD450 nm讀值。

1.3.3 疊加試驗(yàn)

為確定單抗識(shí)別的抗原表位是否一致，使用雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行間接ELSIA疊加試驗(yàn)。按照以下公式計(jì)算疊加系數(shù)（additvity index， AI）：

AI=2A（1+2）/（A1+A2）- 1

A1、A2和A（1+2）分別為單抗1、單抗2和單抗1疊加單抗2分別進(jìn)行間接ELISA的OD450nm值。當(dāng)疊加率AI%的值大于40%時(shí)，判定為兩株單抗識(shí)別不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。

1.3.4 腹水制備及單抗純化

將定株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后腹腔注射弗氏不完全佐劑預(yù)處理10 d的小鼠體內(nèi)，注射7 d后采集腹水，并用正辛酸-飽和硫酸銨法沉淀純化抗體，純化后的抗體透析至PBS （pH=7.6）緩沖液中，-40 ℃保存。純化后的單抗使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)單抗純度。

1.3.5 單抗效價(jià)檢測(cè)

將腹水純化的單克隆抗體作為一抗，從1∶1 000開始連續(xù)2倍稀釋至1∶2 048 000，將一個(gè)無關(guān)單抗設(shè)為陰性對(duì)照進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。當(dāng)陰性對(duì)照OD450 nmlt;0.2，S/Ngt;2.1時(shí)將對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)作為單抗效價(jià)。

1.3.6 單抗特異性鑒定

將腹水純化后的單抗分別與O型口蹄疫Cathay病毒、O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，鑒定獲得單抗的特異性。

1.3.7 間接免疫熒光（IFA）

為驗(yàn)證單抗與O型口蹄疫Cathay株病毒的反應(yīng)性，對(duì)感染Cathay株病毒的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗(yàn)，使用未感染病毒的細(xì)胞作為對(duì)照組。在試驗(yàn)組感染48 h后，用4%多聚甲醛冷凍固定細(xì)胞20 min，然后，用0.1% Triton通透細(xì)胞膜并用5% BSA封閉。每個(gè)步驟之間用PBS洗滌3次。用PBS 1∶1 000稀釋純化單抗，37 ℃避光孵育2 h。洗滌后，用PBS 1∶200稀釋FITC標(biāo)記的鼠二抗，37℃孵育1 h。細(xì)胞核用DAPI （1∶2 000， Beyotime Biotechnology， China）染色，使用EVOS FL熒光顯微鏡（賽默飛世爾科學(xué)公司）進(jìn)行成像。

1.3.8 單抗亞類鑒定

按照抗體亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行亞類鑒定。

1.4 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

1.4.1 酶標(biāo)單抗的制備

將純化的11C7單克隆抗體按照HRP標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。

1.4.2 包被單抗與檢測(cè)單抗稀釋度的確定

將純化的10E6單抗作為包被單抗，分別以25、50、100、150 ng·孔-14個(gè)包被濃度4℃包被酶標(biāo)板過夜。將HRP標(biāo)記的11C7單抗作為檢測(cè)單抗分別以1∶8 000、1∶12 000、1∶16 000、1∶20 000 4個(gè)稀釋度進(jìn)行稀釋，以O(shè)/Cathay滅活病毒懸液作為檢測(cè)抗原，以未接毒細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的OD450 nm值計(jì)算P/N值，確定最佳單抗包被濃度與最佳單抗檢測(cè)稀釋度。

1.4.3 最佳反應(yīng)條件的確定

用最佳包被單抗與檢測(cè)單抗稀釋度，在不同反應(yīng)條件下，對(duì)包被條件（37℃包被2 h、4℃包被過夜）、封閉條件（37℃封閉60、90、120 min和4 ℃封閉10 h）、檢測(cè)樣品孵育時(shí)間（15、30、45 min）、底物（TMB）孵育時(shí)間（8、10、12、15 min）進(jìn)行篩選，檢測(cè)單抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為30 min，檢測(cè)方法同上，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的OD450 nm值計(jì)算P/N值，確定最佳反應(yīng)條件。

1.4.4 敏感性試驗(yàn)

按照已經(jīng)確立的雙抗體夾心ELISA方法的操作程序，對(duì)2×、4×、8×、16×、32×、64×、128×、256×、562×稀釋后的O/Cathay病毒懸液（TCID50=10-6.0·0.1 mL-1）進(jìn)行檢測(cè)，PBS作為空白對(duì)照組，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.4.5 特異性試驗(yàn)

按照已經(jīng)確立的雙抗體夾心ELISA方法的操作程序，分別對(duì)FMDV O/Cathay、O/MYA98、AF/72、A/WH/09病毒懸液（10×稀釋）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取不同批次的酶標(biāo)板各4個(gè)，分別檢測(cè)8×、16×、32×稀釋的FMDV O/Cathay病毒抗原和8×、16×、32×稀釋的FMDV O/MYA98病毒抗原，每個(gè)稀釋度設(shè)置4個(gè)重復(fù)，在同一塊酶標(biāo)板上進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)，不同酶標(biāo)板間進(jìn)行批間重復(fù)，測(cè)定OD450 nm，計(jì)算變異系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫效價(jià)的檢測(cè)

滅活后的O型口蹄疫Cathay病毒抗原經(jīng)過PEG沉淀法純化。純化后的抗原乳化并免疫小鼠，三免后用間接ELISA對(duì)3只小鼠的血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，1號(hào)小鼠免疫后的抗體效價(jià)最高，可達(dá)1∶128 000，故選用1號(hào)小鼠脾用作細(xì)胞融合。

2.2 雜交瘤陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選

用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株上清，3次亞克后獲得10E6、11C7兩株穩(wěn)定分泌抗O型口蹄疫Cathay病毒的雜交瘤細(xì)胞株。間接ELISA結(jié)果顯示，2株單抗均與O型口蹄疫Cathay病毒有良好的反應(yīng)性（圖1）。

2.3 抗原結(jié)合位點(diǎn)分析

疊加試驗(yàn)顯示（表1），10E6單抗與11C7單抗的AI%在40%以上，說明兩株單抗識(shí)別不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 單抗特異性鑒定

應(yīng)用間接ELISA對(duì)單抗細(xì)胞上清與不同的口蹄疫毒株進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果顯示（圖2），兩株單抗均與O型口蹄疫Cathay毒株有良好的反應(yīng)性，而不與口蹄疫O/MYA98、O/BY/2010、OZK/93、O/HNXX/2013、O/JX/2010、AF/72、A/GDMM/2013、A/WH/09毒株發(fā)生反應(yīng)，表明兩株單抗均具有良好的特異性。

2.5 腹水單抗純化及效價(jià)測(cè)定

用SDS-PAGE鑒定純化的腹水單抗，結(jié)果顯示，在50和25 ku左右分別出現(xiàn)單抗的重鏈和輕鏈（圖3），且純度均較高。腹水純化獲得的單抗經(jīng)間接ELISA測(cè)定效價(jià)，10E6單抗效價(jià)達(dá)到1∶2 048 000，11C7單抗效價(jià)達(dá)到1∶512 000。

2.6 單抗的IFA檢測(cè)

使用純化后單抗對(duì)O型口蹄疫Cathay病毒感染后的細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖4），兩株單抗均與病毒感染后的細(xì)胞有良好反應(yīng)，制備的單克隆抗體可用于O型口蹄疫Cathay病毒的IFA檢測(cè)。

2.7 單抗亞類鑒定

根據(jù)抗體亞類鑒定試劑盒說明書對(duì)純化單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，10E6單抗的輕鏈為Kappa鏈，11C7單抗的輕鏈為L(zhǎng)amda鏈，兩株單抗重鏈類型均為IgG2a。

2.8 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

最佳單抗包被濃度為50 ng·孔-1（10E6），最佳單抗檢測(cè)濃度為1∶12 000（11C7-HRP）；最佳包被條件為4 ℃過夜；最佳封閉條件為4℃封閉10 h；最佳樣品孵育時(shí)間為30 min；檢測(cè)單抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)為30 min；最佳底物反應(yīng)時(shí)間為12 min。

2.9 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

按照已經(jīng)確立的雙抗體夾心ELISA操作程序，對(duì)FMDV O/Cathay、O/MYA98、AF/72、A/WH/09毒株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明（表2），建立的ELISA檢測(cè)方法與其他FMDV病原均無交叉反應(yīng)，而與O/Cathay病毒抗原反應(yīng)，特異性良好。

2.10 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的雙抗體夾心ELISA操作程序，對(duì)O/Cathay病毒抗原（TCID50=10-6.0·0.1 mL-1）進(jìn)行2倍倍比稀釋后檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法的最低檢出稀釋比例為1∶256。本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELSIA檢測(cè)方法的批間與批內(nèi)重復(fù)性均小于10%，證明試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的重復(fù)性良好（表3）。

3 討 論

口蹄疫是偶蹄動(dòng)物易感的急性、高度傳染性疾病，被列為我國(guó)重大動(dòng)物傳染病。我國(guó)對(duì)口蹄疫采用疫苗免疫、持續(xù)監(jiān)測(cè)的防控手段。O型口蹄疫Cathay毒株是近年來危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要口蹄疫病毒流行毒株，且病毒存在較大變異，其主要表現(xiàn)：1）以VP1基因?yàn)橹鞯暮塑账嵝蛄信c其他流行毒株的差異較大，已形成新的進(jìn)化分支；2）疫苗免疫豬血清對(duì)O/Cathay毒株的田間分離毒株中和效價(jià)低，甚至出現(xiàn)不匹配現(xiàn)象；3）動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明O型口蹄疫疫苗對(duì)O/Cathay毒株保護(hù)力出現(xiàn)下降趨勢(shì)。而毒株特異單抗的研究可以為FMDV型內(nèi)不同毒株的臨床診斷以及病毒抗原變異研究提供生物材料，對(duì)新毒株的防控有重要意義。

雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)與亞克隆是單抗細(xì)胞株制備的關(guān)鍵［22］，由于選擇培養(yǎng)后的細(xì)胞的抗逆性差且分裂活性低，往往需要提前采取動(dòng)物腹腔巨噬細(xì)胞制備飼養(yǎng)層細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞提供增殖環(huán)境。但飼養(yǎng)層細(xì)胞需多次從活體動(dòng)物體內(nèi)采取，其制備繁瑣、質(zhì)量具有隨機(jī)性且容易增加細(xì)胞污染的概率。有研究表明飼養(yǎng)層細(xì)胞的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用可能來源于飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的以細(xì)胞生長(zhǎng)因子為主的細(xì)胞因子［23］，胎牛血清提供的營(yíng)養(yǎng)成分的多少對(duì)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞同樣重要［24］，本研究在細(xì)胞選擇培養(yǎng)和亞克隆階段采用人為添加生長(zhǎng)因子和增加血清濃度的方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)飼養(yǎng)層細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞存活率明顯提升且由單個(gè)細(xì)胞分裂為足量細(xì)胞群落的時(shí)間從兩周縮短為一周，有效提升了單克隆細(xì)胞株制備的效率。

目前，O型口蹄疫Cathay病毒單克隆抗體的制備與ELISA檢測(cè)方法未見報(bào)道。本研究純化了O型口蹄疫Cathay毒株抗原，并制備篩選了2株針對(duì)O/Cathay毒株的單克隆抗體（10E6、11C7）。間接ELISA與IFA試驗(yàn)顯示，2株單克隆抗體均與口蹄疫Cathay毒株具有良好的反應(yīng)活性；單抗特異性鑒定顯示，兩株單抗與其他不同型的口蹄疫病毒毒株均不存在交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。疊加試驗(yàn)表明，兩株單抗識(shí)別不同的抗原識(shí)別位點(diǎn)，其中，10E6單抗的輕鏈為Kappa鏈，11C7單抗的輕鏈為L(zhǎng)amda鏈，兩株單抗的重鏈類型均為IgG2a。本研究通過兩株單克隆抗體分別作為包被單抗與檢測(cè)單抗建立了O型口蹄疫Cathay病毒的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。使用本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)O型口蹄疫Cathay病毒的敏感性和重復(fù)性好，通過本試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)其他血清型的口蹄疫病毒未發(fā)生交叉反應(yīng)，證明該方法具有良好的特異性。使用HRP標(biāo)記檢測(cè)單抗，和預(yù)包被捕獲單抗并封閉的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，只需72 min即可得出結(jié)果，有利于快速檢測(cè)O型口蹄疫Cathay病毒。

4 結(jié) 論

本研究成功制備了2株特異性針對(duì)O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《镜膯慰寺】贵w，并建立了O型口蹄疫Cathay病毒的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為O型口蹄疫Cathay拓?fù)湫筒《镜姆乐蔚於嘶A(chǔ)，為研究O/Cathay株口蹄疫病毒的抗原變異提供了潛在工具。

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（編輯 白永平）