基于離子對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用檢測(cè)牛肉中16 種氨基糖苷類(lèi)獸藥殘留

摘 要：建立同時(shí)測(cè)定牛肉中16 種氨基糖苷類(lèi)獸藥殘留的方法。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，調(diào)節(jié)pH值后，HLB固相萃取小柱凈化，Hilic Plus色譜柱分離，在電噴霧電離正離子模式下采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果表明，16 種氨基糖苷類(lèi)獸藥在25～750 μg/kg內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990，檢出限為0.006～0.609 μg/kg，定量限為0.02～1.83 μg/kg。在牛肉中加標(biāo)回收率為69.09%～115.50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%～16.58%（n＝6）。本方法靈敏度、準(zhǔn)確度高，適用于牛肉中16 種氨基糖苷類(lèi)獸藥的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞：離子對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合；牛肉；氨基糖苷類(lèi)獸藥；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Detection of 16 Aminoglycoside Residues in Beef Based on Ion Pair Competitive Binding

LIU Huawen， LIANG Feiyan*， XIN Lina， LI Minglu

（Guangxi-Asean Food Inspection and Testing Center， Nanning 530021， China）

Abstract： A method was established for simultaneous determination of 16 aminoglycoside （AG） residues in beef. Samples were extracted with phosphate buffered solution and the proteins were precipitated using trichloroacetic acid. After adjusting the pH， the target compounds were cleaned up on an HLB solid phase extraction （SPE） column， separated on a Hilic Plus column， and detected by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） in the positive ion electrospray ionization mode. The results showed that the calibration curves for the 16 AGs exhibited good linearity in the concentration range of 25–750 μg/kg with correlation coefficients greater than 0.990. The limits of detection （LOD） were 0.006–0.609 μg/kg and the limits of quantitation （LOQ） were 0.02–1.83 μg/kg. The average recoveries at three spiked levels were in the range of 69.09%–115.50%， with relative standard deviations （RSDs） of 1.04%–16.58%

（n = 6）. The method is sensitive， accurate， and suitable for simultaneous determination of the 16 AGs in beef.

Keywords： ion pair competitive binding; beef; aminoglycosides; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240531-130

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.3" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）08-0042-06

引文格式：

劉華文， 梁飛燕， 辛麗娜， 等. 基于離子對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用檢測(cè)牛肉中16 種氨基糖苷類(lèi)獸藥殘留[J]. 肉類(lèi)研究， 2024， 38（8）： 42-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240531-130." " http：//www.rlyj.net.cn

LIU Huawen， LIANG Feiyan， XIN Lina， et al. Detection of 16 aminoglycoside residues in beef based on ion pair competitive binding[J]. Meat Research， 2024， 38（8）： 42-47. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240531-130.

http：//www.rlyj.net.cn

氨基糖苷類(lèi)（aminoglycosides，AGs）抗生素是一類(lèi)細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，其抗菌譜較廣、抗菌活性強(qiáng)，對(duì)需氧革蘭氏陰性桿菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌變形桿菌屬、腸桿菌屬、志賀菌屬等有強(qiáng)大的殺菌作用，常用于防治畜禽呼吸道、腸道、泌尿道感染及敗血癥、禽霍亂等疫病，是防治需氧革蘭氏陰性桿菌感染的首選藥物[1-2]。AGs獸藥具有嚴(yán)重的腎毒性、耳毒性及造血系統(tǒng)毒性，可造成神經(jīng)肌肉阻滯、過(guò)敏等不良反應(yīng)[3]，長(zhǎng)期食用AGs獸藥殘留超標(biāo)的動(dòng)物源性食品會(huì)導(dǎo)致藥物在人體內(nèi)蓄積，同時(shí)引發(fā)相應(yīng)的毒副作用或出現(xiàn)耐藥性，損害人體健康。為此，監(jiān)控畜禽肉中AGs獸藥殘留對(duì)于保障畜禽肉質(zhì)量安全，以及消費(fèi)者飲食安全和身體健康具有重要意義。

AGs獸藥是由氨基糖苷與氨基環(huán)醇形成的苷，結(jié)構(gòu)中含有氨基等堿性基團(tuán)和多個(gè)羥基，故此類(lèi)藥物呈堿性，水溶性較強(qiáng)，且紫外吸收弱，進(jìn)行食品中殘留檢測(cè)分析時(shí)存在提取難、保留弱、靈敏度低等難點(diǎn)問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外在解決其保留弱、靈敏度低等難題方面的報(bào)道較多。例如，為解決AGs獸藥在反相色譜柱上保留弱甚至無(wú)保留問(wèn)題，可在樣品進(jìn)樣溶液或流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑[4-7]，或采用親水性色譜柱[8-12]；若檢測(cè)靈敏度低，可采用適宜的樣品前處理凈化技術(shù)，如液-液萃取法[13-15]、固相萃取法[16-21]、基質(zhì)固相分散法[22]等，盡可能去除干擾雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高靈敏度。針對(duì)解決提取難問(wèn)題的報(bào)道甚少，相關(guān)報(bào)道多采用磷酸鹽緩沖液[23-24]，或加入蛋白沉淀劑如三氯乙酸[25-26]、高氯酸[27]、乙腈[28-29]等溶液，提取的同時(shí)沉淀蛋白，達(dá)到凈化目的。

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[30-31]和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AGs獸藥可與動(dòng)物源性食品中的蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，緩沖液提取或沉淀蛋白不能很好地將待測(cè)組分提取出來(lái)?；诖?，本研究擬通過(guò)離子對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性地與AGs獸藥結(jié)合，將AGs獸藥從牛肉樣品的蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)，同時(shí)對(duì)前處理方法和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，以期解決食品中AGs獸藥殘留檢測(cè)提取難、保留弱、靈敏度低的難點(diǎn)問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉樣品購(gòu)自廣西省內(nèi)各地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，獨(dú)立封裝后在－20 ℃下冷凍貯藏，待測(cè)時(shí)提前取出并于室溫下解凍，使用絞肉機(jī)處理為均勻肉泥以供前處理。

潮霉素B（純度90.2%）、雙氫鏈霉素（純度97.7%）、硫酸巴龍霉素（純度98.0%）、西索米星（純度95.0%）、硫酸異帕米星（純度98.6%） 天津阿爾塔有限公司；硫酸鏈霉素（純度97.7%）、硫酸卡那霉素（純度96.4%）、硫酸安普霉素（純度86.3%）、硫酸慶大霉素（純度89.2%）、妥布霉素（純度94.3%）、硫酸新霉素（純度80.1%）、鹽酸壯觀霉素（純度99.9%）、硫酸奈替米星（純度96.5%）、硫酸依替米星（純度59.9%）、辛烷磺酸鈉（分析純） 上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；丁胺卡那霉素（純度86.2%）、硫酸小諾霉素（純度80.0%） 廣州佳途科技股份有限公司；戊烷磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉（均為分析純） 上海麥克林生化科技股份有限公司；己烷磺酸鈉（分析純）"美國(guó)Sigma-Aldrich公司；庚烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Chemical公司；十二烷基磺酸鈉（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙二胺四乙酸二鈉（disodium ethylenediamine tetraacetic acid，Na2EDTA）（優(yōu)級(jí)純） 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；三氯乙酸、磷酸二氫鉀、鹽酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；甲酸（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 默克股份兩合公司；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 5500三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀"美國(guó)AB SCIEX公司；1290超高效液相色譜儀、Hilic Plus色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm） 美國(guó)Agilent公司；MS303TS電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī) 德國(guó)Millipore公司；MILTIFUGE X3R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式渦旋振蕩器"德國(guó)Heidolph公司；Genius NM32LA氮?dú)獍l(fā)生器 畢克氣體儀器貿(mào)易（上海）有限公司；TurboVap LV樣品自動(dòng)濃縮儀 瑞典Biotage公司；Oasis HLB固相萃取小柱（6 mL，200 mg） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取樣品2.0 g，加入10.0 mL提取劑（稱(chēng)取磷酸二氫鉀1.36 g，加水980 mL使之溶解，采用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，分別加入戊烷磺酸鈉8.70 g、己烷磺酸鈉9.41 g、Na2EDTA 0.15 g、三氯乙酸20 g使之溶解，以水定容至1 000 mL），渦旋5 min，超聲5 min，10 000 r/min、－10 ℃離心10 min，取上清液，采用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4～5，置于已活化HLB固相萃取小柱（6 mL，200 mg，活化：甲醇（5 mL）→水（5 mL）→提取液（5 mL）），用5 mL水淋洗，抽干，用10 mL 0.5%甲酸甲醇溶液洗脫，于40 ℃水浴氮?dú)獯抵两桑?%甲酸水溶液-乙腈（15∶85，V/V）溶解并定容至1.0 mL，渦旋振蕩5 min，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精密稱(chēng)取16 種AGs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，0～5 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別精密移取各單標(biāo)儲(chǔ)備溶液0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用水稀釋、定容，搖勻，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用水稀釋、定容，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

稱(chēng)取牛肉空白基質(zhì)樣品，按1.3.1節(jié)處理后，得到空白基質(zhì)溶液。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.05、0.10、0.20、0.50、0.75 mL，混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10、0.12、0.15 mL，用空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、0.75、1.00、1.20、1.50 μg/mL的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)所需溶液。

1.3.3 分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Hilic Plus（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為1%甲酸溶液，B為乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；正離子掃描；電噴霧電壓5 500 V；碰撞室入口電壓10 V；碰撞室出口電壓12 V；霧化氣（氮?dú)猓毫?5 psi；輔助加熱氣壓力60 psi；氣簾氣（氮?dú)猓毫?5 psi；碰撞氣壓力9 psi；離子源溫度550 ℃；掃描時(shí)間60 ms。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算

按下式計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別利用Analyst軟件和MutiQuant 3.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理，采用Excel 2010軟件和Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

由于AGs獸藥含有多個(gè)氨基，電離作用強(qiáng)，在反相色譜分離柱中保留極弱甚至無(wú)保留。通過(guò)在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑，如戊烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、七氟丁酸等，使之與待測(cè)物離子結(jié)合，形成可在反相色譜柱中保留的分子，但離子對(duì)試劑會(huì)殘留在質(zhì)譜系統(tǒng)中，損壞質(zhì)譜系統(tǒng)，造成質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)負(fù)離子分析性能下降。通過(guò)在高純度、具有良好機(jī)械穩(wěn)定性的硅膠基質(zhì)表面鍵合高純度親水性基團(tuán)，可得到親水性反相分離柱，如HILIC柱、R柱、Gold柱等，可大大增強(qiáng)極性化合物在反相色譜柱上的保留能力和選擇性[32-35]。

本研究對(duì)比不同廠家、不同規(guī)格、不同型號(hào)的親水作用色譜柱（Sielc obelisk R（2.1 mm×100 mm，5 μm）、HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Hypersil Gold（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Hypersil Gold AQ（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Agilent Proshell 120 Hilic（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、Agilent Hilic Plus（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）、Agilent RRHD Hilic Plus（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters CORTECS UPLC Hilic（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters ACQUITY UPL BEH Hilic（2.1 mm×100 mm，1.6 μm））。結(jié)果表明，使用Agilent Hilic Plus色譜柱時(shí)，16 種AGs獸藥的保留效果較好，色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)性良好（圖1）。故最終選擇Agilent Hilic Plus色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

AGs獸藥分子結(jié)構(gòu)中含有氨基環(huán)醇、羥基和伯胺或仲胺基團(tuán)等堿性基團(tuán)，可與流動(dòng)相中甲酸的H＋結(jié)合，形成帶正電荷的[M＋H]＋，適宜采用正離子掃描模式，通過(guò)優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，選取響應(yīng)豐度較高、易得到、出峰穩(wěn)定的母離子和子離子，進(jìn)而獲得定量和定性離子對(duì)。具體質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2.3 提取劑優(yōu)化

AGs獸藥具有弱堿性、帶正電，可與細(xì)胞中的金屬離子螯合，同時(shí)牛肉中含有大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)含有羰基（C＝O），可與AGs獸藥分子結(jié)構(gòu)中的N—H鍵形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，給樣品提取和凈化帶來(lái)巨大困難。現(xiàn)階段去除蛋白質(zhì)的方法有酸性沉淀劑鹽析、有機(jī)溶劑脫水、生物酶酶解、加熱等。本研究采用三氯乙酸沉淀蛋白、Na2EDTA螯合金屬離子、Tris溶液-磷酸鹽緩沖液提取、蛋白酶水解蛋白質(zhì)等方式，通過(guò)調(diào)節(jié)提取劑的酸堿度、水解蛋白質(zhì)等方式，提取液出現(xiàn)不同程度的渾濁，且存在提取不完全、目標(biāo)物丟失等現(xiàn)象，均不能取得滿(mǎn)意效果。由此可知，單純地沉淀蛋白質(zhì)并不能破壞蛋白質(zhì)與AGs獸藥之間的結(jié)合力，在沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)，AGs獸藥也同時(shí)沉淀而被去除。

離子對(duì)試劑具有強(qiáng)親水性和結(jié)合力，可與電離能力較強(qiáng)的化合物結(jié)合[4-5]。而AGs獸藥為陽(yáng)離子化合物，電離能力強(qiáng)，易與陰離子離子對(duì)試劑配對(duì)[7]。為此，本研究考察陰離子離子對(duì)試劑烷基磺酸鹽類(lèi)（0.1 mol/L戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉溶液）對(duì)AGs獸藥的提取效果。結(jié)果表明，在提取過(guò)程中，離子對(duì)試劑碳鏈越長(zhǎng)（癸烷磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉），產(chǎn)生的泡沫越多，難以消除，導(dǎo)致無(wú)法渦旋振蕩提取，固相萃取凈化時(shí)過(guò)柱慢，且在濃縮時(shí)有白色殘?jiān)龀?，提取回收率較低（＜35%）；采用戊烷磺酸鈉溶液提取時(shí)，所有組分均能出峰，除潮霉素B回收率（＜45%）偏低外，其余組分回收率（60%～120%）良好；采用己烷磺酸鈉溶液提取時(shí)，所有組分亦均能出峰，除鏈霉素、雙氫鏈霉素、壯觀霉素、奈替霉素和小諾霉素回收率（10%～60%）偏低外，其余組分回收率（60%～120%）良好。因此，為保證所有組分能達(dá)到更好的提取效果，本研究采用戊烷磺酸鈉和己烷磺酸鈉組合溶劑作為提取劑。

比較不同濃度的組合溶劑（0.02 mol/L戊烷磺酸鈉-0.02 mol/L己烷磺酸鈉溶液、0.05 mol/L戊烷磺酸鈉-0.05 mol/L己烷磺酸鈉溶液、0.1 mol/L戊烷磺酸鈉-0.1 mol/L己烷磺酸鈉溶液、0.2 mol/L戊烷磺酸鈉-0.2 mol/L己烷磺酸鈉溶液）對(duì)AGs獸藥的提取效果。結(jié)果表明，隨著提取劑濃度的升高，各組分的回收率也升高，提取劑濃度大于0.05 mol/L時(shí)，各組分回收率良好，提取效果較理想。因此，本研究采用組合溶劑0.05 mol/L戊烷磺酸鈉-0.05 mol/L己烷磺酸鈉溶液，通過(guò)離子對(duì)與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合待測(cè)組分，將AGs獸藥從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)。此外，為更好地降低基質(zhì)效應(yīng)，減小蛋白質(zhì)對(duì)待測(cè)組分的干擾，本研究加入三氯乙酸沉淀蛋白，提供酸性環(huán)境，更有利于AGs獸藥提取。

2.4 凈化條件優(yōu)化

目前，最常用的獸藥殘留檢測(cè)前處理凈化方法為固相萃取法和QuEChERS方法。AGs獸藥極易溶于水，宜采用水溶液進(jìn)行提取，若采用QuEChERS方法凈化，水溶液難以濃縮，而獸藥殘留檢測(cè)為痕量分析，未經(jīng)濃縮的樣品溶液可導(dǎo)致方法檢出限偏低，達(dá)不到檢測(cè)靈敏度要求。因此，本研究擬采用固相萃取法。AGs獸藥為弱堿性有機(jī)物，宜采用反相固相萃取法或陽(yáng)離子交換固相萃取法。本研究以16 種AGs獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg/mL）考察不同品牌、不同填料、不同規(guī)格固相萃取柱的凈化效果。如表3所示，Oasis MCX柱（150 mg，6 mL）、Bond Elut-Pba柱（100 mg，3 mL）對(duì)所有組分均無(wú)保留，Oasis WCX柱（500 mg，6 mL）對(duì)其中9 種組分（潮霉素B、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、壯觀霉素、巴龍霉素、異帕霉素）有保留；Bond Elut-C18柱對(duì)其中11 種組分（雙氫鏈霉素、卡那霉素、安普霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素、巴龍霉素、小諾霉素、西索米星、奈替米星、依替米星）有保留；HLB填料對(duì)16 種AGs獸藥均有保留，當(dāng)填料規(guī)格200 mg、柱容量6 mL時(shí)，各組分回收率良好。故本研究采用Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）作為AGs獸藥凈化的固相萃取柱。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)分析

本研究通過(guò)空白基質(zhì)加標(biāo)法對(duì)牛肉中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖2所示，牛肉基質(zhì)中，只有丁胺卡那霉素表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為8.5%，其他AGs獸藥均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為－77.2%～－23.7%，其中潮霉素B、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、壯觀霉素、奈替米星和依替米星基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值均小于50%，而鏈霉素、雙氫鏈霉素、安普霉素、妥布霉素、巴龍霉素、小諾霉素、西索米星和異帕米星基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值大于50%。因此，本研究采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，以消除基質(zhì)效應(yīng)影響，提高定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限和定量限

采用陰性牛肉樣品制備空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，按優(yōu)化條件進(jìn)行測(cè)試，以目標(biāo)物定量離子的質(zhì)譜圖峰面積（y）為縱坐標(biāo)、相應(yīng)的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到16 種AGs獸藥的線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，分別以信噪比（RSN）＝3和RSN＝10計(jì)算檢出限和定量限，如表4所示。結(jié)果表明，16 種AGs獸藥在25～750 μg/kg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.990，檢出限為0.006～0.609 μg/kg，定量限為0.02～1.83 μg/kg，滿(mǎn)足AGs獸藥的檢測(cè)要求。

2.6.2 準(zhǔn)確度和精密度

在空白牛肉基質(zhì)樣品中，進(jìn)行3 個(gè)水平（100、250、375 μg/kg）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6 次。如表5所示，16 種AGs獸藥的平均加標(biāo)回收率為69.09%～115.50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.04%～16.58%（n＝6），方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

在廣西省內(nèi)隨機(jī)選取牛肉樣品100 批次，采用本方法對(duì)樣品中16 種AGs獸藥進(jìn)行檢測(cè)，100 批次樣品中均未檢出AGs。

3 結(jié) 論

本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了牛肉中16 種AGs獸藥殘留的測(cè)定方法。通過(guò)選擇合適的色譜柱，采用三氯乙酸沉淀蛋白，以組合溶劑0.05 mol/L戊烷磺酸鈉-0.05 mol/L己烷磺酸鈉溶液作為提取劑，HLB固相萃取柱富集凈化，實(shí)現(xiàn)了16 種AGs獸藥的有效提取、保留和準(zhǔn)確定量分析。本方法提取效率高、凈化效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度良好，適用于牛肉中16 種AGs獸藥的同時(shí)測(cè)定。

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