自制中草藥油對大鼠深度燒傷創(chuàng)面的療效評價

[摘要]目的：經(jīng)過建立Wister大鼠深度燒傷模型，探討自制中草藥油機制及促進深度燒傷創(chuàng)面愈合的臨床療效。方法：選取清潔健康雄性Wister大鼠60只為研究對象，將建模成功的大鼠依據(jù)治療方式分為對照組30只和觀察組30只。對照組使用生理鹽水予以清創(chuàng)后，將凡士林紗布遮蓋包裹創(chuàng)面，并用敷貼穩(wěn)固；觀察組采用自制中草藥油涂抹，涂抹均勻后予以紗布進行固定，每日進行換藥1次。對比兩組治療后第3、7、14、21天創(chuàng)面愈合情況與創(chuàng)面愈合率、HE染色法觀察大鼠燒傷創(chuàng)面皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)及毛細(xì)血管數(shù)，免疫組化染色法檢測大鼠燒傷創(chuàng)面皮膚組織表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）水平。結(jié)果：治療后第3、7、14、21天，兩組創(chuàng)面愈合率均升高，且觀察組明顯高于對照組（P＜0.05）；觀察組創(chuàng)面愈合面積和滲出液均小于對照組；兩組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)均上升，且觀察組明顯高于對照組（P＜0.05）；兩組EGF、VEGF水平均上升，且觀察組比對照組高（P＜0.05）。結(jié)論：利用自制中草藥油治療大鼠深度燒傷創(chuàng)面，可有效增加創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)，提高創(chuàng)面EGF、VEGF水平，促進了創(chuàng)面愈合情況，為臨床深度燒傷創(chuàng)面用藥提供有力理論價值。

[關(guān)鍵詞]自制中草藥油；大鼠；深度燒傷；創(chuàng)面愈合；療效評價

[中圖分類號]R285.5 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2024）09-0045-04

Evaluation of Curative Effect of Self-made Chinese Herbal Oil on Deep Burn Wound in Rats

DU Xian1， CAI Xia1， REN Jizhen1， SU Lu'an2， CHEN Zhenyu1

（ 1.Department of Plastic Surgery， Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266000， Shandong， China; 2.Department of Burn Surgery， Qingdao Junliang Burn Hospital， Qingdao 266000， Shandong， China ）

Abstract： Objective To explore the mechanism of self-made Chinese herbal oil and the clinical efficacy of promoting deep burn wound healing by establishing a Wister rat model of deep burn. Methods Sixty clean and healthy male Wister rats were selected for the study， and the modeled rats were divided into 30 control rats and 30 observation rats according to the treatment. After debridement with normal saline， the wound of control group was covered with vaseline gauze and fixed， the observation group was smeared with self-made Chinese herbal oil and fixed with Vaseline gauze after evenly smearing， the dressing was changed once every other day. The wound healing conditions and wound healing rates of the two groups at the 3rd， 7th， 14th and 21st days after treatment were compared， the number of fibroblasts and capillaries on the burn wound of rats was observed by HE staining method， the epidermal growth factor （EGF） and vascular endothelial growth factor （VEGF） levels on the burn wound of rats was detected by immunohistochemical staining method. Results On the 3rd， 7th， 14th and 21st day after treatment， the wound healing rate of the two groups was increased， and the observation group was significantly higher than the control group （P＜0.05）， the wound healing area and exudate in the observation group were smaller than those in the control group. The number of fibroblasts and capillaries increased in the two groups， and the observation group was significantly higher than the control group （P＜0.05）， the levels of EGF and VEGF were increased in the two groups， and the observation group was higher than the control group （P＜0.05）. Conclusion The use of self-made Chinese herbal oil in the treatment of deep burn wounds in rats can effectively increase the number of fibroblasts and capillaries， improve the levels of EGF and VEGF， and promote the healing of wounds.

Key words： self-made Chinese herbal oil; rat; deep burn; wound healing; efficacy evaluation

燒傷為臨床外科常見的一種疾病，其程度一般分為淺度燒傷和深度燒傷，其中深度燒傷較淺度燒傷相比，燒傷創(chuàng)面愈合速度和感染程度更長、更嚴(yán)重[1-2]。燒傷創(chuàng)面是指伴有組織壞死的缺損性損傷，臨床處理燒傷創(chuàng)面主要以清潔創(chuàng)面、減少感染、及早封閉創(chuàng)面，極大限度恢復(fù)外形和功能為治療原則[3]。因為燒傷后創(chuàng)面暴露、細(xì)菌感染等因素，造成燒傷創(chuàng)面愈合緩慢，嚴(yán)重者會引起創(chuàng)面膿毒血癥而威脅患者生命安全。所以，深度燒傷創(chuàng)面愈合一直以來是臨床關(guān)注且重視的問題。因此，為深度燒傷創(chuàng)面愈合尋找更有效的治療方法非常重要。當(dāng)前，臨床中，對燒燙傷創(chuàng)面愈合尚未有特效藥物予以治療，西醫(yī)中較常利用銀鹽、抗菌藥等進行鎮(zhèn)痛、殺菌、消炎等，但由于近些年來抗生素用藥的泛濫、細(xì)菌耐受性的增強等情況發(fā)生，此類藥物的治療效果已大大降低，同時還有著一定程度副作用[4-5]。中成藥和其制劑在燒燙傷創(chuàng)面愈合中有著深厚文化底蘊，并在臨床廣泛使用，如康復(fù)新液、美寶濕潤燒傷膏、京萬紅軟膏等外用藥物，能有效促進燒燙傷創(chuàng)面組織生長因子的釋放與分泌，減少組織含水量，減輕水腫，抑制創(chuàng)面炎癥反應(yīng)；同時能有效調(diào)節(jié)膠原蛋白的代謝和合成，促進燒燙傷創(chuàng)面膠原含量的提升；中草藥還可以通過清除組織中氧自由基，抑制皮脂過氧化反應(yīng)，進一步促進燒燙傷創(chuàng)面的愈合，同時也體現(xiàn)xwg/jA0fGm4LoFn9XwWDMA==了中醫(yī)藥治療的優(yōu)點所在。本文經(jīng)過建立大鼠深度燒傷模型，在燒傷創(chuàng)面采用自制中草藥油擦抹治療，分析創(chuàng)面愈合情況并探討其機制，為臨床采用自制中草藥油促進深度燒傷創(chuàng)面愈合提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物：選取清潔健康雄性Wister大鼠30只為研究對象，體重190～220 g，平均體重（204.36±1.08）g，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2021-0006，實驗前飼養(yǎng)于恒溫、通風(fēng)、安靜環(huán)境中，定期進行更換墊料。本研究經(jīng)醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試驗藥物、材料和儀器：自制中草藥油（含羞草120 g，博落回100 g，千層塔100 g，藏紅花50 g，側(cè)柏葉30 g，苦參50 g，當(dāng)歸80 g，將上述中草藥材粉碎處理至100～150目的細(xì)粉，然后混合均勻，放入廣口玻璃瓶內(nèi)以備用。準(zhǔn)備4倍于中草藥總量的香油，加入事先準(zhǔn)備好的廣口玻璃瓶中，并攪拌均勻，確保中草藥粉末充分與香油混合。為保持制備過程的純凈性，使用瓶塞蓋嚴(yán)瓶口，并用濕潤的石膏繃帶將瓶口封閉。為了防止變質(zhì)，將瓶子移至陰涼處，進行3個月以上的浸泡儲存，有助于中草藥充分滲透香油，使藥物有效成分充分浸出。經(jīng)過儲存后，取出瓶中的上清油）。無菌生理鹽水，無菌紗布，凡士林紗布，流式細(xì)胞儀（美國BD公司），PCR定量分析儀（東林昌盛科技有限公司），easiSlicer振動切片機（廣州競贏化工科技有限公司），ES500生物組織包埋機（北京佳緣興業(yè)科技有限公司），XC-HD4K超清視頻顯微鏡（深圳星辰光學(xué)儀器有限公司），BIOCEN 22R微量臺式離心機（北京維根技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 燙傷模型構(gòu)建：大鼠飼養(yǎng)1周后，進行背部皮膚剪毛處置，使用苯巴比妥鈉注射液（哈藥集團三精制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H23021166，規(guī)格：2 ml∶0.2 g）以3.5 ml/kg用量進行麻醉，將小鼠放于俯臥位，固定大鼠四肢，暴露脫毛處理后背部皮膚，在大鼠背部設(shè)計2個大小相同的創(chuàng)面，直徑為2 cm，用透明的線格尺標(biāo)記創(chuàng)傷點。盡量做到每只大鼠背部的創(chuàng)面都是均勻分布，間隔大小相同。砝碼加熱法建模將直徑2 cm的50 g的砝碼放到熱水里煮沸加熱30 min，燙傷15 s。隨后為大鼠注射5 ml復(fù)方氯化鈉注射液（四川太平洋藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字：H51023960，規(guī)格：250 ml）以抗休克，等大鼠蘇醒。

1.2.2 分組與給藥：對建模成功的每只大鼠背部上兩個創(chuàng)面，依據(jù)治療方式不同分為對照組30例和觀察組30例，對照組使用生理鹽水予以清創(chuàng)后，將凡士林紗布遮蓋包裹創(chuàng)面，并用敷貼穩(wěn)固；觀察組在進行生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，采用自制中草藥油涂抹，涂抹界限大于創(chuàng)面范圍2 mm，涂抹厚度0.5～1 mm，藥物抹勻后使用凡士林紗布進行穩(wěn)固，每天進行1次換藥。兩組大鼠正常飼養(yǎng)21 d，并在燒傷治療后的第3、7、14、21天，從兩組中選擇3只行CO2處死，加用標(biāo)尺垂直創(chuàng)口拍照，進行愈合范圍測量取材。

1.2.3 標(biāo)本的取材和處理：于燒傷后第3、7、14、21天用藥結(jié)束后，取大鼠燒傷部位的皮膚組織進行HE染色。取材：用手術(shù)刀和剪刀小心剪取燒傷創(chuàng)面及其周邊正常皮膚組織，避免損傷周圍組織。固定：將組織放入4%多聚甲醛中固定24～48 h。脫水：將固定后的組織依次放入梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）中脫水，每步約30 min。透明：將脫水后的組織放入二甲苯中透明，便于后續(xù)浸蠟。浸蠟：將透明后的組織放入熔化的石蠟中，浸蠟2～3 h。包埋：將浸蠟后的組織包埋于石蠟塊中，冷卻凝固。切片：使用切片機將石蠟塊切成薄片（一般厚度為5～8μm），并黏附于載玻片上。HE染色步驟如下。脫蠟至水：將切片依次放入二甲苯和梯度乙醇中脫蠟至水。蘇木素染色：將切片放入蘇木素染液中染色數(shù)分鐘，然后用自來水沖洗。分化：用1%鹽酸酒精分化，再用自來水沖洗。反藍：用氨水或弱堿性水反藍，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍色。伊紅染色：將切片放入伊紅染液中染色數(shù)分鐘，然后用自來水沖洗。脫水封片：將切片依次放入梯度乙醇和二甲苯中脫水透明，最后用中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察HE染色切片，評估燒傷創(chuàng)面的愈合情況、炎癥細(xì)胞浸潤、新生血管形成等指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 創(chuàng)面愈合情況與創(chuàng)面愈合率：選取兩只燒傷后Wister大鼠，由專業(yè)人員拍照并記錄燒傷后第3、7、14、21天兩只大鼠創(chuàng)面分泌物、愈合范圍、顏色等，且采納Image-pro plus 6.0圖像分析軟件計算創(chuàng)面愈合面積，創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-當(dāng)天創(chuàng)面面積）/原創(chuàng)面始面積×100%[6]。

1.3.2 HE染色法觀察大鼠燒傷創(chuàng)面皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)及毛細(xì)血管數(shù)：于燒傷后第3、7、14、21天用藥結(jié)束后，將大鼠進行麻醉后，在創(chuàng)面取中央0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm組織塊，作為標(biāo)本，用10%甲醛固定維持細(xì)胞本來結(jié)構(gòu)后，分步進行乙醇脫水，常規(guī)進行石蠟包埋、切片、染色，選擇5個高倍區(qū)域，在顯微鏡分析計算毛細(xì)血管數(shù)和成纖維細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 對比兩組免疫組化染色法檢測大鼠燒傷創(chuàng)面皮膚組織EGF、VEGF水平：于燒傷后第3、7、14、21天用藥結(jié)束后，將大鼠進行麻醉后，在創(chuàng)面取中央0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm組織塊，作為標(biāo)本，以10%甲醛固定，將石蠟包埋切片脫蠟水化后，用3% H2O2除去內(nèi)源性過氧化物酶，并在檸檬酸鹽緩沖液中高壓加熱對切片樣本行抗原修復(fù)，采納SP法按照試劑盒說明嚴(yán)格操作。在切片樣本中選取10個高倍視野，采納Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）水平測定，檢測累計光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 21.0軟件分析，計量資料使用（xˉ±s）描述，兩兩間使用t檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)使用n（%）表示，并使用χ2檢驗；將P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合情況與創(chuàng)面愈合率：隨著治療時間增長，兩組創(chuàng)面愈合率均升高，且治療后第3、7、14、21天觀察組明顯高于對照組（P＜0.05）；觀察組創(chuàng)面愈合面積和滲出液均小于對照組，見圖1～4、表1。

2.2 創(chuàng)面皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)及毛細(xì)血管數(shù)：隨著治療時間增長，兩組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)均升高，且治療后第3、7、14、21天觀察組明顯高于對照組（P＜0.05），見表2。

2.3 創(chuàng)面皮膚組織EGF、VEGF水平：隨著治療時間增長，兩組EGF、VEGF水平均升高，且治療后第3、7、14、21天觀察組高于對照組（P＜0.05），見表3。

3 討論

燒傷后創(chuàng)面愈合是漫長且復(fù)雜的過程，對于輕度燒傷來說，正常情形下機體能利用自身調(diào)節(jié)進行愈合，而燒傷程度較為嚴(yán)重情形下，多由于細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)相互調(diào)節(jié)作用紊亂，造成燒傷創(chuàng)面愈合緩慢[7]。目前，臨床采用中醫(yī)治療創(chuàng)面愈合的機制主要集中于煨膿長肉，如去腐生肌膏、生肌紅粉膏等藥方，這些藥方在燒傷創(chuàng)面愈合中可經(jīng)過降低創(chuàng)面pH值，呈現(xiàn)微酸性環(huán)境，從而刺激纖維細(xì)胞繁殖，促進創(chuàng)面的愈合[8]。燒傷創(chuàng)面愈合包含細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和合成、局部組織凝血、細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)。燒傷處皮膚的細(xì)胞增殖常作為影響創(chuàng)面愈合的影響因素，當(dāng)燒傷創(chuàng)面愈合越晚，造成創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生成降低，組織生長因子的減少，從而延長創(chuàng)面愈合時間[9]。

既往有研究表明，在大鼠模型創(chuàng)面愈合中應(yīng)用中藥油劑愈潰油治療，能有效促進創(chuàng)面愈合[10]。本研究通過自制中草藥油對大鼠深度燒傷創(chuàng)面進行治療，結(jié)果顯示：兩組創(chuàng)面愈合率均升高，且觀察組明顯高于對照組；觀察組創(chuàng)面愈合面積和滲出液均小于對照組，與既往研究結(jié)果相似，表明中草藥油對燒傷創(chuàng)面愈合具有保護和促進作用。分析原因為，油劑聯(lián)合中草藥成分可以在燒傷創(chuàng)面上形成保護膜，以降低細(xì)菌對損傷表皮的侵襲，且同時能夠抑制創(chuàng)面毛細(xì)血管與滲出的亢進，縮減了燒傷創(chuàng)面愈合范圍，進一步提高了創(chuàng)面愈合效果。另外，深度燒傷創(chuàng)面細(xì)胞增殖中成纖維細(xì)胞不僅可影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，促進毛細(xì)血管生成，其新增的毛細(xì)血管，還能為成纖維細(xì)胞提供代謝，促進燒傷創(chuàng)面的愈合[11-12]。本研究中結(jié)果顯示，治療后，兩組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)均上升，且觀察組明顯高于對照組。分析原因，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，千層塔所含成分有著生肌消腫之效，且在油劑混合下，保護新生創(chuàng)面，維持肌膚張力；苦參所含提取物不僅具有解毒消腫之效，還有著斂瘡生肌的作用；側(cè)柏葉中成分具有散腫毒，生肌作用；諸藥所含提取物可刺激燒傷創(chuàng)面新毛細(xì)血管生成，增加成纖維細(xì)胞的增殖，從而改變燒傷創(chuàng)面的微循環(huán)狀態(tài)，促進創(chuàng)面上皮化，加速愈合。

另一方面，VEGF作為創(chuàng)面愈合參與中重要細(xì)胞因子，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，可使細(xì)胞增殖分化，增加血管通透性，在血管外形成細(xì)胞基質(zhì)，促進新血管生成，在創(chuàng)面愈合有著關(guān)鍵作用[13]。EGF由受損的角質(zhì)形成細(xì)胞和血小板釋放合成，可加速細(xì)胞分裂活性，刺激成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的分化增殖，加速傷口組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)生成，加速愈合[14]。本研究結(jié)果顯示，兩組EGF、VEGF水平均上升，且觀察組比對照組高，這與蔡德南等[15]學(xué)者研究中結(jié)果相似。表明自制中草藥油中藥材所含成分能調(diào)節(jié)組織中EGF、VEGF水平，促進表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖，進一步促使肉芽組織生長，促進燒傷創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，利用自制中草藥油治療大鼠深度燒傷創(chuàng)面，可有效增加創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)，提高創(chuàng)面EGF、VEGF水平，促進了創(chuàng)面愈合情況，為臨床深度燒傷創(chuàng)面用藥提供有力理論價值。

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[收稿日期]2023-12-15

本文引用格式：杜憲，蔡霞，任紀(jì)禎，等.自制中草藥油對大鼠深度燒傷創(chuàng)面的療效評價[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（9）：45-48.