CPNE1、ZWILCH在肺腺癌進展及預后中的臨床意義

[摘要]目的分析鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白1（calciumdependentphospholipidbindingprotein1，CPNE1）、ZWILCH表達與肺腺癌進展及預后的相關(guān)性。方法收集2020年1月至2021年3月湖州市中心醫(yī)院首次確診的125例肺腺癌患者的癌組織、癌旁組織標本，免疫組織化學法檢測CPNE1、ZWILCH陽性表達強度，分析其在肺腺癌中的表達差異。隨訪并記錄肺腺癌患者的生存情況，分析影響其預后的危險因素，明確CPNE1、ZWILCH預測肺腺癌患者預后的效能。結(jié)果肺腺癌組織患者的CPNE1、ZWILCH陽性率均顯著高于癌旁組織（P<0.05）。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有胸膜侵犯、有脈管癌栓、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者的CPNE1、ZWILCH陽性率顯著升高（P<0.05）。CPNE1、ZWILCH陽性表達的肺腺癌患者的總生存率顯著低于CPNE1、ZWILCH陰性表達者（P<0.05）。Cox多因素分析顯示，家庭人均月收入、貧血、低蛋白血癥、臨床分期、分化程度、營養(yǎng)免疫與系統(tǒng)炎癥指標、免疫功能、CPNE1、ZWILCH均是影響肺腺癌患者預后的危險因素（P<0.05）。CPNE1聯(lián)合ZWILCH預測肺腺癌患者預后的曲線下面積為0.934，敏感度為91.09%，特異性為87.89%。結(jié)論CPNE1、ZWILCH表達隨肺腺癌進展逐漸升高，是影響患者生存的危險因素，或可作為預測患者預后的參考指標。

[關(guān)鍵詞]肺腺癌；鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白1；ZWILCH；預后

[中圖分類號]R734.2[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.25.001

ClinicalsignificanceofCPNE1andZWILCHintheprogressionandprognosisoflungadenocarcinoma

YEBei，LIUShunlin

DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，HuzhouCentralHospital，AffiliatedCentralHospitalofHuzhouUniversity，Huzhou313000，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToanalyzecorrelationofcalciumdependentphospholipidbindingprotein1（CPNE1）andZWILCHexpressionintheprogressionandprognosisoflungadenocarcinoma.MethodsCancertissueandparacancertissuespecimensof125patientsdiagnosedwithlungadenocarcinomaforthefirsttimeinHuzhouCentralHospitalfromJanuary2020toMarch2021werecollected.ThepositiveexpressionofCPNE1andZWILCHinlungadenocarcinomawasdetectedbyimmunohistochemistry，anddifferenceofitsexpressioninlungadenocarcinomawasanalyzed.Thesurvivaloflungadenocarcinomapatientswasfollowedupandrecorded，theriskfactorsaffectingtheprognosisofpatientswereanalyzed，andtheefficacyofCPNE1andZWILCHinpredictingtheprognosisoflungadenocarcinomapatientswasclarified.ResultsThepositiveratesofCPNE1andZWILCHinlungadenocarcinomatissuesweresignificantlyhigherthanthoseinparacancertissues（P<0.05）.ThepositiveratesofCPNE1andZWILCHwereincreasedinlungadenocarcinomapatientswithstageⅢ-Ⅳ，lowdifferentiation，pleuralinvasion，vascularcancerthrombus，andlymphnodemetastasis（P<0.05）.TheoverallsurvivalrateofpatientswithCPNE1andZWILCHpositiveexpressionwassignificantlylowerthanthatofpatientswithCPNE1andZWILCHnegativeexpression（P<0.05）.Coxmultivariateanalysisshowedthatpercapitamonthlyincome，anemia，hypoalbuminemia，clinicalstage，degreeofdifferentiation，nutritionalimmunityandsystemicinflammationindicators，immunefunction，CPNE1，andZWILCHwereriskfactorsaffectingtheprognosisoflungadenocarcinomapatients（P<0.05）.TheareaunderthecurveofCPNE1combinedwithZWILCHpredictedtheprognosisoflungadenocarcinomapatientswas0.934，thesensitivitywas91.09%，andthespecificitywas87.89%.ConclusionCPNE1andZWILCHexpressiongraduallyincreasewiththeprogressionoflungadenocarcinoma，whichareriskfactorsaffectingthesurvivalofpatients，andmaybeusedasareferenceindicatortopredicttheprognosisofpatients.

[Keywords]Lungadenocarcinoma;Calciumdependentphospholipidbindingprotein1;ZWILCH;Prognosis

肺癌是一種常見惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點，是人類惡性腫瘤死亡的首要原因[1]。肺腺癌為肺癌的主要組織學亞型，發(fā)病率逐年升高，極易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，預后較差[2-3]。Copines蛋白家族是新近發(fā)現(xiàn)的保守鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白（calciumdependentphospholipidbindingprotein，CPNE），CPNE1作為此家族的重要蛋白定位于第20號染色體，被認為是肺癌的原癌基因，其表達升高可引起細胞癌變、腫瘤細胞增殖、遷移，顯著縮短患者的生存期[4]。另外，肺腺癌的發(fā)生與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)基因改變密切相關(guān)，Zhang等[5]基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，ZWILCH高表達所介導的肺腺癌免疫微環(huán)境改變與低存活率相關(guān)。現(xiàn)階段對CPNE1、ZWILCH在肺腺癌發(fā)展過程中的表達變化報道較少。本研究擬探討CPNE1、ZWILCH在肺腺癌組織中的表達及與疾病發(fā)展、預后的相關(guān)性，以期為改善患者預后提供參考。

1資料與方法

1.1臨床資料

收集2020年1月至2021年3月湖州市中心醫(yī)院首次確診的125例肺腺癌患者的癌組織、癌旁組織標本，患者男68例，女57例，年齡33～75歲，臨床分期：ⅠA期24例、ⅠB期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期27例、Ⅳ期19例。納入標準：①病理證實為肺腺癌，為原發(fā)性病灶；②未接受任何抗腫瘤治療；③美國東部腫瘤協(xié)作組（EasternCooperativeOncologyGroup，ECOG）評分0～1分。排除標準：①肺鱗癌；②既往惡性腫瘤治療史；③合并其他類型惡性腫瘤；④重要臟器功能不全；⑤合并心腦血管疾??；⑥合并全身感染性疾病、自身免疫性疾病。所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)湖州市中心醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：202209022-01）。

1.2免疫組織化學檢測

癌組織、癌旁組織石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟，使用95%、85%、75%乙醇水化，0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）抗原修復，磷酸鹽緩沖液洗滌后加1∶2000的CPNE1、ZWILCH兔抗人單克隆抗體，4℃下過夜。磷酸鹽緩沖液洗滌加二抗孵育，30min后二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察。CPNE1陽性：胞質(zhì)或胞膜為棕褐色或棕黃色；ZWILCH陽性：胞質(zhì)棕黃色。進一步根據(jù)陽性細胞占比、細胞染色強度判斷CPNE1、ZWILCH陽性表達強度，陽性細胞占比≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；細胞染色強度：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；兩項乘積<2分為陰性，2～3分為弱陽性，4～9分為中等陽性，10～12分為強陽性。

1.3臨床特征及預后判斷

臨床特征包括腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、有無胸膜侵犯、有無脈管癌栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等?；颊咝g(shù)后定期隨訪，以電話或門診復查等方式連續(xù)隨訪3年，第1年每3個月隨訪1次，而后每6個月隨訪1次，以隨訪截止日期及全因死亡或失訪作為隨訪終點，評價患者的生存情況。統(tǒng)計不同預后患者的臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、受教育程度、家庭人均月收入、腫瘤家族史、吸煙史、飲酒史、有無貧血、有無低蛋白血癥、腫瘤臨床特征、營養(yǎng)免疫與系統(tǒng)炎癥指標[中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophiltolymphocyteratio，NLR）、血小板與淋巴細胞比值（platelettolymphocyteratio，PLR）、預后營養(yǎng)指數(shù)（prognosticnutritionalindex，PNI）、全身免疫炎癥指數(shù)（systemicimmuneinflammation，SII）]、免疫功能[T淋巴細胞亞群（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A、IgG、IgM]等。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗；繪制受試者操作特征曲線（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲線）分析CPNE1、ZWILCH判斷預后的截斷值，以曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）表示預測效能，AUC>0.7為預測效能較好。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗進行生存分析。單因素及多因素Cox回歸分析模型驗證影響患者預后的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1肺腺癌組織、癌旁組織的CPNE1、ZWILCH表達比較

肺腺癌組織的CPNE1、ZWILCH陽性率均顯著高于癌旁組織（P<0.05），見表1、圖1。

2.2CPNE1、ZWILCH在不同臨床特征肺腺癌中的表達

臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有胸膜侵犯、有脈管癌栓、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者的CPNE1、ZWILCH陽性率顯著升高（P<0.05），見表2。

2.3肺腺癌中CPNE1、ZWILCH陽性表達與預后的關(guān)系

根據(jù)肺腺癌患者的CPNE1、ZWILCH陽性表達情況將其分為CPNE1陽性組（n=89）、CPNE1陰性組（n=36）、ZWILCH陽性組（n=76）、ZWILCH陰性組（n=49）。進一步分析CPNE1、ZWILCH與肺腺癌患者預后的相關(guān)性，結(jié)果顯示CPNE1陽性組患者的總生存率顯著低于CPNE1陰性組[60.67%（54/89）vs.88.89%（32/36），χ2=8.942，P<0.05]，ZWILCH陽性組患者的總生存率顯著低于ZWILCH陰性組[59.21%（45/76）vs.83.67%（41/49），χ2=7.439，P<0.05]，見圖2、圖3。

2.4影響肺腺癌患者預后的危險因素分析

Cox單因素分析顯示，體質(zhì)量指數(shù)、受教育程度、家庭人均月收入、貧血、低蛋白血癥、臨床分期、分化程度、胸膜侵犯、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、NLR、PLR、PNI、SII、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgG、IgM、CPNE1、ZWILCH均是肺腺癌患者預后的影響因素（P<0.05），見表3。Cox多因素分析顯示，家庭人均月收入、貧血、低蛋白血癥、臨床分期、分化程度、NLR、PLR、PNI、SII、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgG、IgM、CPNE1、ZWILCH均是影響肺腺癌患者預后的危險因素（P<0.05），見表4。

2.5CPNE1、ZWILCH預測肺腺癌患者預后的效能分析

ROC曲線顯示，CPNE1聯(lián)合ZWILCH預測肺腺癌患者預后的AUC為0.934，敏感度為91.09%、特異性為87.89%，見表5、圖4。

3討論

肺癌是癌因性死亡的第一惡性腫瘤。目前，肺癌的致病機制尚未完全明確。CPNE1作為最先發(fā)現(xiàn)的Copines蛋白家族成員，可編碼537個氨基酸，在N端有一對C2結(jié)構(gòu)域，具有鈣離子依賴的磷脂結(jié)合活性，可影響鈣與磷酸結(jié)合，其C端有一個A結(jié)構(gòu)域，主要通過促進CPNE1與多種細胞內(nèi)蛋白結(jié)合來發(fā)揮相應生物學功能[6-8]。一旦組織癌變，CPNE1表達升高，經(jīng)多條信號通路參與包括肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生進展[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌發(fā)展過程中CPNE1陽性率逐漸升高，即CPNE1高表達于Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有胸膜侵犯、有脈管癌栓、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示CPNE1可能參與肺腺癌的進展。研究證實CPNE1在泛素-蛋白酶體、自噬-溶酶體途徑中參與細胞癌變，認為泛素連接酶神經(jīng)前體細胞表達的發(fā)育下調(diào)樣基因4可通過介導CPNE1泛素化和降解來引起肺癌細胞異常增殖和轉(zhuǎn)移[11]。此外，CPNE1還可通過與活化蛋白激酶C受體1相互作用和激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子信號傳導來促進肺癌進展[12]。通過分析CPNE1影響非小細胞肺癌細胞增殖、遷移的機制，認為其可能通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體信號通路、蛋白激酶B信號通路發(fā)揮作用[13]。以上均證實CPNE1參與肺腺癌進展，或可作為肺腺癌患者預后的評估指標。本研究發(fā)現(xiàn)，CPNE1陽性患者總生存率處于較低水平，提示CPNE1與患者預后有一定關(guān)聯(lián)，CPNE1高表達經(jīng)上述信號通路誘導癌細胞增殖、遷移從而影響預后。

隨著對惡性腫瘤研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)有絲分裂異常是引起細胞癌變的主要原因，在有絲分裂過程中每對姐妹染色體著絲與兩極微管連接以保證遺傳信息平均分配，臨床認為此過程由動粒蛋白中RZZ[Roughdeal（Rod）、Zeste-white10（Zw10）和ZWILCH]復合體等紡錘體組裝檢驗點的重要組分實時監(jiān)控[14-16]。ZWILCH作為一種新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，主要通過RZZ復合體將Mad1-Mad2、dynein/dynactin募集至著絲粒，以避免細胞提前退出有絲分裂，確保動粒-微管連接裝置的穩(wěn)定[17]。研究發(fā)現(xiàn)，當ZWILCH突變后紡錘體組裝檢驗點失活，無法實時監(jiān)控有絲分裂過程，極易引起染色體錯誤分離，誘導細胞異常增殖癌變[18]。現(xiàn)階段對ZWILCH在肺癌中的作用機制尚不可知，但孫亞敏等[19]發(fā)現(xiàn)，ZWILCH升高可誘導腦膠質(zhì)瘤細胞異常增殖。Blatkiewicz等[20]研究證實ZWILCH上調(diào)不僅與腫瘤細胞有絲分裂率和患者生存率有關(guān)，還參與細胞增殖的基因激活和與免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，ZWILCH在肺腺癌組織中陽性率升高，并隨著疾病的進展而加劇，且ZWILCH陽性患者的總生存率明顯降低，提示ZWILCH可能通過某一途徑參與肺腺癌的進展和預后轉(zhuǎn)歸。

本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者的預后受多種因素影響，除家庭人均月收入、貧血、低蛋白血癥、臨床分期、分化程度、營養(yǎng)免疫與系統(tǒng)炎癥指標、免疫功能等因素外，CPNE1、ZWILCH同樣是影響肺腺癌患者預后的危險因素，提示CPNE1、ZWILCH陽性者死亡風險更高，且二者聯(lián)合預測肺腺癌患者預后的效能較優(yōu)，臨床可通過檢測肺腺癌組織中CPNE1、ZWILCH的表達情況評估死亡風險。

綜上所述，CPNE1、ZWILCH參與肺腺癌的進展，其高表達是引起患者死亡的獨立危險因素，與患者預后密切相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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