紫花地丁對熱應激下肉雞生長性能、肉品質(zhì)和腸道菌群的改善作用

摘 要：本研究旨在評估紫花地?。╒iola yedoensis Makino，VYM）對熱應激下AA肉雞生長性能、肉品質(zhì)和腸道菌群的改善作用。將60只1日齡雄性AA肉雞隨機分為6個組，分別為：對照組（NT組），高劑量紫花地丁組（NT+VYM-H組）；熱應激組（HS組），低、中、高劑量紫花地丁熱應激組（HS+VYM-L、HS+VYM-M和HS+VYM-H組，紫花地丁添加量分別為0.5%、1.5%、4.5%），2～42d，熱應激組肉雞暴露于高溫中，紫花地丁組全程飼喂添加相應劑量紫花地丁的日糧。所有肉雞均在42日齡時屠宰，對日增重、剪切力、肉色和PH值等進行檢測生長性能、血清生化指標、肉品質(zhì)、十二指腸形態(tài)、酶活性相關基因表達水平以及腸道菌群組成等進行檢測。結(jié)果顯示，在熱應激條件下，與熱應激組相比，1.5%紫花地丁組肉雞29～42d平均日增重顯著升高，料重比顯著降低（Plt;0.05）；熱應激條件下，添加0.5%和1.5%紫花地丁顯著降低肉雞35d血清HSP70水平（Plt;0.05），添加0.5%紫花地丁顯著提高十二指腸脂肪酶活性（Plt;0.05），與肉雞胸肌生肌因子相關的Pax3、Pax7、Myog、Myod、Myf5mRNA表達顯著上調(diào)（Plt;0.05），與十二指腸消化吸收功能相關的Pparα、Fatp1、B⁰at1、Pept1、Cat1、Eaat3mRNA表達顯著上調(diào)（Plt;0.05）；在熱應激條件下，添加1.5%的紫花地丁顯著增加降低了肉雞的肌肉剪切力、肉色和pH（Plt;0.05）；盲腸中，紫花地丁顯著提高了腸道菌群的豐富度和多樣性（Plt;0.05），在門水平上，增加了擬桿菌門的豐度，且與肌肉pH（45min）呈顯著正相關；屬水平上，降低了Subdoligranulum屬豐度，且與十二指腸淀粉酶活性呈顯著負相關。綜上，在本試驗條件下，日糧中補充1.5%和4.5%紫花地丁可有效減輕熱應激導致的肉雞生長性能和肉品質(zhì)的降低，并能夠調(diào)節(jié)其腸道菌群的平衡。本研究為紫花地丁在肉雞生產(chǎn)中的應用提供了科學依據(jù)，對家禽養(yǎng)殖臨床中熱應激的防治具有參考意義。

關鍵詞：紫花地??；熱應激；肉雞；生長性能；肉品質(zhì)；腸道菌群

中圖分類號：S831.5；S858.316.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2761-14

收稿日期：2023-08-23

基金項目：湖南創(chuàng)新型省份建設專項經(jīng)費資助（2020NK2032）；橫向課題：生豬產(chǎn)業(yè)前沿關鍵科學和技術(shù)研究項目（2019xny-js044）

作者簡介：王 吉（1990-），男，湖南邵陽人，博士，主要從事獸醫(yī)內(nèi)科學研究，wangjics@163.com；周馨妍（1998-），女，遼寧本溪人，碩士生，主要從事獸醫(yī)內(nèi)科學研究，zxy1085082373@163.com。王吉和周馨妍為同等貢獻作者

*通信作者：鄔 靜，主要從事獸醫(yī)內(nèi)科學研究，E-mail：wujing@hunau.edu.cn

Viola yedoensis Makino Improves the Growth Performance，Meat Quality，

and Gut Microbiota of Broilers Exposed to Heat Stress

WANGJi^1，2，ZHOU Xinyan¹，GUOFangrui¹，XUQiurong¹，WU Dongyi¹，

MAO Yan¹，YUAN Zhihang¹，YIJin′e¹，WEN Lixin¹，WU Jing^1*

（1.Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care，Colleges of

Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha410128，China;

2.Changsha Lvye Biotechnology Co.，Ltd，Changsha410100，China）

Abstract：This study assessed the mitigation effects of Viola yedoensis Makino（VYM）on the growth performance，meat quality，and gut microbiota of AA broilers under heat stress.Sixty1-day-old male AA broilers were randomly allotted into6treatments.The NT group was fed with astandard diet at normal temperature.The NT+VYM-H group was fed the diet supplemented with4.5%VYM feed at normal temperature; The HS group was fed with astandard diet under heat stress; The HS+VYM-L，HS+VYM-M，and HS+VYM-H groups were fed diets containing0.5%，1.5%，and4.5%VYM under heat stress.All broilers were slaughtered at42days old.Growth performance，serrum biochemistry，meat quality，duodenum morphorlogy，related genes and composition of gut microbe were analyzed.Broilers fed with1.5%VYM（w/w）had higher average daily weight gain and alower feed intake/body weight gain（F/G）ratio under heat stress（Plt;0.05）.Under heat stress，0.5%and1.5%VYM supplementation reduced serum HSP70levels（Plt;0.05），while the supplementation of0.5%VYM increased duodenal lipase activity（Plt;0.05），and upregulated myogenic regulatory-related mRNA（Pax3，Pax7，Myog，Myod，Myf5）expression in the breast muscle of broilers，and upregulated digestive-related mRNA（Ppara，F(xiàn)atp1，B⁰at1，Pept1，Cat1，Eaat3）expression in the duodenum（Plt;0.05）.Under heat stress，1.5%VYM supplementation reversed changes todecreased shearing stress and the color and pH of meat（Plt;0.05）.In the cecum，VYM remarkably improved the richness of intestinal microflora（Plt;0.05）and increased the abundance of Bacteroides，which was significantly positively related to meat pH（45min）.It also lowered the abundance of Subdoligranulum，which was significantly negatively correlated with duodenal amylase activity.In conclusion，under the conditions of this study，the degradation of growth performance and meat quality caused by heat stress can be reduced and the balance of intestinal flora of broilers can be regulated by the supplementation of1.5%and4.5%Viola yedoensis Makino in diet effectively.This work provides avaluable reference for the positive benefits of applying VYM in poultry production，giving aviable solution for coping with the high-temperature climate of poultry farming.

Key words：Viola yedoensis Makino; heat stress; broiler; growth performance; meat quality; gut microbiota

*Corresponding author：WU Jing，E-mail：wujing@hunau.edu.cn

近年來，隨著環(huán)境溫度的不斷升高以及家禽規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，高溫已成為制約家禽生長發(fā)育的重要因素之一^[1]。熱應激是指當動物暴露于超出等溫區(qū)上限的環(huán)境溫度時，產(chǎn)生的一系列非特異性的應答反應，通常伴隨著生產(chǎn)性能的下降，嚴重時甚至出現(xiàn)休克或死亡的現(xiàn)象^[2]。肉雞由于其自身體溫較高，皮膚無汗腺，全身被羽毛覆蓋，新陳代謝較為旺盛，產(chǎn)熱和散熱方式不同于哺乳動物，高溫時散熱非常困難^[3]。長期的高溫環(huán)境會引起肉雞熱應激，進一步降低其生長性能，并影響肉品質(zhì)和風味^[4]。此外，熱應激還會影響肉雞的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導致皮質(zhì)醇水平異常升高^[5]，同時損傷腸道通透性和腸道黏膜免疫功能，影響腸道消化酶和營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運體的活性，降低養(yǎng)殖生產(chǎn)效益^[6-7]。雞肉是我國肉制品消費中僅次于豬肉的第二大肉類產(chǎn)品，因此，迫切需要找到一種有效的飼料添加劑來減少熱應激對畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的危害^[8]。研究表明，中草藥添加劑具有天然性、多功能性、無毒副作用和不產(chǎn)生抗藥性的特點，不僅可提高動物的生產(chǎn)性能，且能顯著改善肉產(chǎn)品品質(zhì)^[9-10]。此外，越來越多的研究證明了中草藥及其提取物在緩解熱應激和提高肉雞生長性能方面具有潛力^[11-12]。紫花地?。╒iola yedoensis Makino）是堇菜科、堇菜屬的一種草本植物，中醫(yī)藥典中屬于干燥全草類中草藥。紫花地丁藥用歷史悠久，在中藥方劑中多利用其清熱解毒、涼血消腫作用來消腫行滯^[13]。研究表明，紫花地丁還具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒和解熱的藥理活性^[14]。紫花地丁含有多種微量元素，能夠影響體內(nèi)各種酶的活性，進而通過調(diào)節(jié)酶系統(tǒng)來控制生物機體的新陳代謝及免疫功能^[15]，并且能有效地清除自由基，具有較好的抗氧化功效^[16]。然而，紫花地丁在肉雞熱應激中的應用研究尚未見報道。因此，本研究以熱應激AA肉雞為模型，在普通日糧的基礎上添加不同劑量（0.5%、1.5%、4.5%）的紫花地丁，探究紫花地丁對熱應激條件下肉雞生長性能、肉品質(zhì)和腸道菌群的改善作用，以期為紫花地丁在肉雞生產(chǎn)中的抗熱應激應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選取1日齡雄性AA肉雞60只，初始平均體重為44g±1g，購自湖南順成實業(yè)有限公司。紫花地丁購自蘭州沃特萊斯生物科技有限公司，規(guī)格為紫花地丁1∶1水提取物，性狀棕黃色粉末，疏松且均勻一致，批號：20201120。

1.2 動物試驗

將60只1日齡的雄性AA肉雞隨機分為6組（每組10只）。對照組（NT）在常溫條件下飼喂基礎日糧。高劑量紫花地丁常溫（NT+VYM-H）組在常溫條件下飼喂基礎日糧中添加4.5％紫花地丁的日糧。熱應激（HS）組飼養(yǎng)在熱應激條件下，低劑量紫花地丁熱應激（HS+VYM-L）、中劑量紫花地丁熱應激（HS+VYM-M）和高劑量紫花地丁熱應激（HS+VYM-H）組在熱應激條件下分別飼喂含有0.5%、1.5%和4.5%紫花地丁的日糧。所有的紫花地丁組均從第2日至42日混飼不同相應劑量紫花地丁。基礎日糧為湖南農(nóng)業(yè)大學追求飼料科技有限公司自行配制，主要成分為玉米、豆粕、魚粉、豆油、磷酸氫鈣、石粉、L-賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和食鹽等，飼料配方見表1。所有肉雞在42d內(nèi)自由采食和飲水。對照（NT）組和高劑量紫花地丁常溫組飼養(yǎng)溫度與本團隊前期研究一致^[17]。熱應激組中，溫度第1天至第3天保持在31℃，第4天至第7天保持在30℃，第8天至第20天保持在28℃，第21天至第28天保持在25℃，第29天至第42天33℃。免疫程序和其他飼養(yǎng)條件按照本團隊前期研究執(zhí)行^[17]。試驗過程符合國家《實驗動物福利倫理審查指南》規(guī)定，并經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學生物醫(yī)學研究倫理委員會批準（No.43322105）。

1.3 生長性能測定

在第1、4、7、21、28、35和42天，禁食12h后計算所有肉雞的體重（body weight，BW）和采食量。肉雞在第1～28、29～42天的生長性能通過每組平均日增重（average daily gain，ADG）、平均日采食量（average daily feed intake，ADFI）和料重比（feed to gain ratio，F(xiàn)GR）來體現(xiàn)。

1.4 血清生化指標測定

42日齡時，禁食12h后全部屠宰結(jié)束試驗，解剖前翅靜脈采血，分離血清。血清樣本保存在-20℃條件下至指標檢測。采用全自動生化分析儀對血清中的生化指標進行測定：肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLO）。分別采用HSP-70ELISA試劑盒（江蘇寶萊生物科技有限公司，中國江蘇）和皮質(zhì)醇ELISA試劑盒（華美生物工程有限公司，武漢，中國）檢測血清熱休克蛋白70（heat shock protein，HSP-70）和皮質(zhì)醇濃度。

1.5 組織病理學分析

42日齡時CO₂處死肉雞后，分離胸肌和十二指腸，對胸肌和十二指腸樣本進行組織病理學檢測，方法參考本團隊前期研究^[18]。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察胸肌和十二指腸的組織病理學變化。十二指腸杯狀細胞通過Periodic Acid-Schiff（PAS）染色計數(shù)。用Image-Pro Plus軟件（Image-Pro Plus6.0，美國休斯頓）對切片（每組5個樣本）的5個隨機視野中十二指腸絨毛高度、隱窩深度、杯狀細胞數(shù)量和胸肌纖維直徑進行計算。

1.6 肉色和pH測定

肉色采用胴體肉質(zhì)色差儀進行測定，取每只雞的雞胸肉約20g左右分別于宰后45min檢測肉色光電耦合元件信號（Optor isolator，OPto）值并記錄，每個肉樣測定5次，取其平均值。采用胴體肉質(zhì)pH直測儀測定肌肉pH，采取兩點校準方式。于宰后45min使用胴體肉質(zhì)pH直測儀測定胸肉的pH，每個肉樣測定5次，取平均值。將樣品放入密封袋中，并在4 ℃冰箱中保存24h后再次測定pH。

1.7 蒸煮損失測定

宰后45 min內(nèi)，取一定量的肌肉樣品用紙擦干后稱重（W1），放入自封袋中，將溫度計插入肌肉正中心，放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱，直至肌肉中心溫度達到70 ℃為止，取出肉樣隔袋流水冷卻至0～4 ℃，用吸水紙擦去表層汁液，再次稱重（W2）。蒸煮損失計算公式：蒸煮損失=（W1-W2）/W1×100%。

1.8 剪切力測定

采集新鮮雞胸肉，去除外部脂肪和結(jié)締組織，按照肌肉纖維排列切成長為5cm、寬為2cm、高為2cm的長方體肉樣，用肌肉嫩度儀測定（單位為N），每個肉樣測定5次，取平均值。

1.9 滴水損失測定

稱取一定量的胸肌并記錄好重量（W1），用細鐵絲將肉樣固定在自封袋內(nèi)密封，確保自封袋與肉樣無黏連，迅速放置于4 ℃冰箱，24h后，取出再次稱取肉樣重量（W2）并記錄。滴水損失=（W1-W2）/W1×100%。

1.10 十二指腸消化酶活性測定

取十二指腸組織1g，加入900 μL生理鹽水后將組織進行充分勻漿，3000r·min^-1離心10min，取上清液。淀粉酶（amylase，AMS）和脂肪酶（lipase，LPS）活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所，根據(jù)試劑盒說明測定消化酶活性。

1.11 實時熒光定量PCR

從十二指腸和肌肉中提取總RNA，組織RT-PCR檢測方法按本課題組前期研究的方法進行^[18]。Hsp70、Pparα、Stl27Fatp1、B⁰at1、Pept1、Cat1、Eaat3、Myf5、Pax3、Pax7、Myog、Myod和β-actin基因的引物如表2所示。用2^-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。

1.12 腸道菌群DNA提取和16S rRNA測序

縱向解剖腸道，對NT、NT+VYM-H、HS和HS+VYM-H組進行腸道微生物/腸道菌群分析；并將4個組分別重命名為NT、NT-VYM、HS和HS-VYM?？v向剖開盲腸，取盲腸內(nèi)容物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rRNA生物多樣性測序^[18]，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在美吉生信云平臺（https：∥www.majorbio.com）完成。

1.13 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS25軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差（SD）”表示。對生長性能、血清生化指標、酶活性、mRNA表達量等數(shù)據(jù)進行單因素方差（one-way ANOVA）分析，用Fisher′s LSD法進行事后檢驗。組織病理學數(shù)據(jù)進行Kruskal-Wailis平均秩檢和Duncan氏法進行事后多重比較檢驗。微生物多樣性結(jié)果統(tǒng)計中，α多樣性分析組間差異檢驗使用Kruskal-Wallis秩和檢驗；樣本層級聚類距離算法使用unweighted unifrac法；主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）距離算法使用bray curtis法；物種差異分析多組比較使用Kruskal-Wallis秩和檢驗，事后檢驗為Tukey-kramer法，多重檢驗校正方法為FDR；兩組比較使用Wilcoxon秩和雙尾檢驗，CI計算方法為bootsrap，多重檢驗校正方法為FDR；表型指標以及基因與腸道菌群的關聯(lián)分析使用Spearman等級相關檢驗。Plt;0.05認定為差異顯著，Plt;0.01認定為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 紫花地丁對熱應激條件下肉雞的生長性能和血清生化指標的影響

如圖1A所示，圖1A為試驗設計示意圖，圖1B所示為與NT組相比，HS組中HSP70水平顯著提高（Plt;0.05），而添加0.5%或1.5%VYM肉雞的HSP70水平顯著低于HS組（Plt;0.05，圖1B）。與NT組相比，NT+VYM-H組在42日齡的末體重顯著下降（Plt;0.05，圖1C、1D）。與NT組相比，HS組29～42d的日增重顯著降低（Plt;0.05）；而HS+VYM-M組29～42d的日增重顯著增加（Plt;0.05，圖1E）。HS+VYM-H組對比HS+VYM-L組和HS+VYM-M組的肉雞42日齡體重（Plt;0.05）和平均日增重較低（Pgt;0.05）降低，各組之間平均日采食量沒有顯著差異（圖1F）。與NT組相比，HS組肉雞29～42d的料重比顯著增加（Plt;0.05）。與HS組相比，HS+VYM-M的料重比在29～42日齡d顯著降低（Plt;0.05，圖1G）。與NT組相比，HS組的ALB含量顯著下降，CK活性顯著升高（Plt;0.05）。與HS組相比，HS+VYM-M組血清GLO含量顯著升高，LDHCK活性顯著降低（Plt;0.05）。NT+VYM-H組CK活性顯著降低低于其它各組（Plt;0.05，表3）。

2.2 紫花地丁對熱應激條件下肉雞肉品質(zhì)的影響

與NT組相比，熱應激影響了肉雞胸肌的肉色、剪切力和滴水損失（Plt;0.05），并降低了肉雞屠宰后45min時的pH（Plt;0.05）。肉雞宰后45 min，與熱應激造模HS組相比，在熱應激條件下添加三種中、高劑量紫花地丁組均升高了肉雞胸肌pH（Plt;0.05），同時并降低了肉雞胸肌肉色和剪切力，添加中劑量的紫花地丁顯著降低了肉雞胸肌的剪切力（Plt;0.05，圖2A～2D）。如圖2E所示，六組間蒸煮損失無顯著差異（Pgt;0.05）。與NT組相比，HS組肌肉的Pax3和Myod mRNA表達量顯著降低（Plt;0.05），Myf5mRNA表達量顯著升高（Plt;0.05）。與HS組相比，HS+VYM-L組中Pax3、Pax7、Myog mRNA表達量均顯著升高（Plt;0.05，圖2F～2H）。在熱應激條件下，添加紫花地丁的HS+VYM-L組中，肌肉Myod和Myf5mRNA表達量相似均顯著升高（Plt;0.05）。如圖2L病理組織切片所示，HS組胸肌纖維間間隙明顯擴大，胸肌纖維密度和數(shù)量均減少。但在紫花地丁處理組中，胸肌纖維間間隙較窄，肌纖維的密度和數(shù)量均較高。此外，NT組與HS組的胸肌纖維直徑無顯著差異（Pgt;0.05）。紫花地丁處理后，熱應激組肉雞胸肌直徑顯著減?。≒lt;0.05，圖2K、2L）。

2.3 紫花地丁改善了對熱應激條件下肉雞消化功能的影響

如圖3A～3C所示，在熱應激條件下，HS四個組的十二指腸絨毛稀疏、呈落葉狀，腸腺損傷，同時十二指腸杯狀細胞數(shù)均減少。添加紫花地丁治療對熱應激下十二指腸形態(tài)和杯狀細胞有保護作用（圖3A～C）。與NT組相比，HS組的十二指腸絨毛高度/隱窩比例深度有明顯的變化趨勢顯著降低（Plt;0.05，圖3D）。與HS組相比，HS+VYM-L、HS+VYM-M和HS+VYM-H的十二指腸絨毛高度/隱窩比例深度顯著增加（Plt;0.05，圖3D）。與NT組相比，HS組十二指腸Hsp70mRNA的表達顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖3E）。HS組的十二指腸淀粉酶和脂肪酶活性顯著低于NT組（Plt;0.05），而HS+VYM-L組的脂肪酶活性高于HS組（Plt;0.05，圖3F、3G）。與NT組相比，HS組十二指腸中Pparα、Fabp1、B⁰at1、Pept1、Cat1和Eaat3mRNA表達量顯著降低（Plt;0.05，圖3H～3M），與HS組相比，這些基因在HS+VYM-L中的相對表達量顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖3H～3M）。此外與HS組相比，HS+VYM-M中Pparα、Fabp1、B⁰at1和Pept1mRNA表達量顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖3H～3K），HS+VYM-H組中Fabp1、B⁰at1、Eaat3mRNA表達量也顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖3I～3K、3M）。

2.4 紫花地丁對熱應激肉雞腸道菌群物種豐富度和多樣性的影響

在腸道菌群的結(jié)果中，如圖4A所示，與NT組相比，NT-VYM組的Sobs指數(shù)顯著上調(diào)（Plt;0.05）。與HS相比，HS-VYM組的Sobs指數(shù)顯著升高（Plt;0.05）。但各組間Shannon指數(shù)和Shannoneven指數(shù)均無顯著差異（Pgt;0.05，圖4B、4C）。NT、NT-VYM、HS和HS-VYM組分別鑒定出352、368、346和366個OTUs，四組共同的OTUs有335個（Venn圖，圖4D）。主坐標分析（PCoA）和群落相似性分析（ANOSIM）結(jié)果表明，各組間腸道微生物群組成存在一定差異（圖4E、F）。在門水平上，各組菌群總豐度前3的物種依次為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）和脫硫桿菌門（Desulfobacterota）（圖4G）。在屬水平上，總豐度前10的物種分別為unclassified_f__Lachnospiraceae屬、Eisenbergiella屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Faecalibacterium屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、Lachnoclostridium屬、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014屬、嗜膽菌屬（Bilophila）、胃瘤球菌屬（Ruminococcus_torques_group）和Subdoligranulum屬（圖4H）。

2.5 紫花地丁改善對熱應激下肉雞腸道菌群的改善作用

各組中從門到屬的優(yōu)勢菌群分布見圖5A、B所示，在NT組中，優(yōu)勢菌群包括o__Lachnospirales，f__Enterococcaceae，g__Enterococcus，f__Desulfovibrionaceae，c__Desulfovibrionia，o__Desulfovibrionales，p__Desulfobacterota，g__Bilophila，c__Clostridia和f__Lachnospiraceae（LDAgt;3.5）。在NT_VYM組中，優(yōu)勢菌群包括g__Lactobacillus，g__Tuzzerella，f__Monoglobaceae，g__Monoglobus，o__Monoglobales，g__Candidatus_Soleaferrea，f__Peptostreptococcaceae，g__Romboutsia，p__Firmicutes，c__Bacilli，o__Lactobacillales和f__Lactobacillaceae（LDAgt;3.5）。在HS組中，優(yōu)勢菌群包括g__unclassified_f__Lachnospiraceae，g__norank_f__Ruminococcaceae，g__Peptococcus，g__V9D2013_group，g__Subdoligranulum和g__Eisenbergiella（LDAgt;3.5）。在HS_VYM組中，優(yōu)勢菌群包括g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae，o__Izemoplasmatales，g__norank_f__norank_o__Izemoplasmatales，f__norank_o__Izemoplasmatales，g__unclassified_f__Butyricicoccaceae，g__Negativibacillus，g__Butyricicoccus，f__Tannerellaceae，g__Parabacteroides，g__Bacteroides，f__Bacteroidaceae，c__Bacteroidia，p__Bacteroidota和o__Bacteroidales（LDAgt;3.5）。

在屬水平上，與NT相比，HS組的Ruminococcus_torques_group、腸球菌和CHKCI001的相對豐度顯著降低（Plt;0.05）；而HS組中乳桿菌、norank_f__Ruminococcaceae和魏氏菌屬的相對豐度均上調(diào)（Plt;0.05，圖6A～6F）。與HS組相比，HSVYM中unclassified_f__Lachnospiraceae、Eisenbergiella、嗜膽菌和Subdoligranulum的相對豐度均顯著降低（Plt;0.05），而HSVYM組中擬桿菌屬和丁酸球菌屬的相對豐度增加（Plt;0.01）（圖6G～6L）。

表型指標與腸道菌群種類的相關性分析顯示，乳桿菌與剪切損失和滴水損失呈正相關，但分別與Pparα和Fatp1mRNA表達量呈負相關（Plt;0.01，Plt;0.05）（圖7B）。Norank_f_Ruminococcaceae與胸肌的蒸煮損失和CK呈顯著正相關（Plt;0.01），但與胸肌45 min后pH、GLO和Fatp1mRNA表達量呈負相關（Plt;0.01、Plt;0.05，圖7A、7B）。Unclassified_f_Lachnospiraceae和Eisenbergiella與胸肌45 min后pH呈負相關（Plt;0.01，圖7A）。Eisenbergiella有助于調(diào)節(jié)胸肌生長，并與Myf5mRNA表達量呈正相關（Plt;0.05，圖7B）。Suboligranulum與十二指腸脂肪酶（Plt;0.05）和胸肌的45 min后pH（Plt;0.01）呈極顯著的負相關（圖7B）。Suboligranulum和嗜膽菌屬（Bilophila）的表達與Myf5mRNA表達量呈正相關（Plt;0.05，圖7B）。

3 討 論

熱休克蛋白在體內(nèi)的表達與所有生物體的熱應激密切相關^[19]。其中HSP70是熱休克蛋白家族中最豐富的一種，由于其對細胞的非特異性保護特性，一般在正常細胞內(nèi)水平比較低，而在應激狀態(tài)下升高較為明顯，因此可作為熱應激的重要分子標志物^[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應激組肉雞血清中HSP70含量在35日齡和42日齡均顯著高于對照組；且十二指腸中Hsp70mRNA的表達量同樣顯著升高；而添加三種劑量紫花地丁都能降低熱應激條件下血清HSP70含量，其中35日齡的低、中三種劑量紫花地丁組血清中HSP70含量顯著降低；此外，添加3種劑量紫花地丁都能顯著降低熱應激條件下十二指腸中Hsp70mRNA的表達，提示添加適量的紫花地丁能夠有效緩解熱應激。

本研究發(fā)現(xiàn)，與熱應激組相比，在熱應激條件下，低、中劑量紫花地丁可以顯著增加42日齡肉雞體重，但高劑量紫花地丁組的肉雞42日齡體重和平均日增重較低?？赡苡捎谔砑舆^高的紫花地丁降低了基礎日糧中的總熱量密度，而各組間的采食量無顯著差異，因此高劑量紫花地丁組的肉雞日增重相較于另兩組更低。這說明適量添加紫花地丁才能有效緩解熱應激對肉雞生長性能的影響。通常，在熱應激的作用下，組織發(fā)生損傷，細胞膜的通透性增高，組織細胞內(nèi)的酶通過細胞膜進入血液，會導致各種生化指標的改變^[21-22]。本研究表明，補充紫花地丁可以顯著降低熱應激條件下血清LDH和CK的活性，增加血清GLO，減少熱應激對機體造成的損傷。

肉品質(zhì)一般通過測量肉的pH、肉色、滴水損失、蒸煮損失和剪切力等指標來評定^[23]。肌肉pH一般在7～7.5之間，是由肌肉中所含乳酸量決定的，肌肉中乳酸蓄積過多會造成pH降低，肉品質(zhì)下降則pH下降的速度增加。本研究發(fā)現(xiàn)，添加紫花地丁可以升高熱應激條件下肉雞屠宰后胸肌的宰殺后45min pH。其中，中、高劑量的紫花地丁熱應激組胸肌pH顯著高于熱應激組。在屠宰后24h，添加紫花地丁的熱應激組其pH沒有顯著差異。此外，中、高劑量紫花地丁組的肉雞屠宰后45min肉色值顯著高于低于熱應激組。在一定范圍內(nèi)剪切力越小，肌肉的嫩度越高，滴水損失和蒸煮損失是指肌肉組織在不同環(huán)境下對于水分的保持能力^[24]。與熱應激組相比，添加紫花地丁的熱應激組肉雞的剪切力和滴水損失降低，且中劑量紫花地丁熱應激組的剪切力顯著低于熱應激組。與熱應激組相比，中、高劑量紫花地丁蒸煮損失降低，高劑量紫花地丁熱應激組蒸煮損失顯著降低。綜上，熱應激條件下，日糧中添加1.5%、4.5%劑量的紫花地丁可有效改善肉雞的肉品質(zhì)。

Pax3、Pax7及其下游的MRFs家族是調(diào)控肌纖維發(fā)育最主要的生肌因子^[25-26]。本研究顯示，熱應激組肉雞Myod和Pax3mRNA表達顯著下調(diào)，而Myf5mRNA表達顯著升高。因此，高溫會影響肌肉的生長；然而，具體的機制還有待闡明。在熱應激條件下，補充低劑量紫花地丁上調(diào)了生肌因子的mRNA水平，緩解熱應激對肉雞生長性能和肌肉發(fā)育的影響。在熱應激條件下，肉雞腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，腸道正常分泌的消化酶減少，進而嚴重影響生長性能^[27]。本研究中，熱應激導致十二指腸中的LPS和AMS酶脂肪酶和淀粉酶活性下降，而補充紫花地丁可以緩解這種熱應激產(chǎn)生的影響，從而促進肉雞的生長。蛋白質(zhì)的運輸和吸收效率由小腸上皮細胞刷狀緣的轉(zhuǎn)運載體決定。這些載體包括PEPT1、B⁰AT1、EAAT3、和CAT1^[28]。FATP1調(diào)節(jié)腸道對脂肪酸的攝取，并將其轉(zhuǎn)化為CoA^[29]。PPAR與畜禽脂肪性狀密切相關，并可調(diào)控體內(nèi)的能量平衡以及脂質(zhì)和脂蛋白的代謝^[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應激組的肉雞腸道Pept1、B⁰at1、Eaat3、Cat1mRNA表達量顯著低于對照組，添加紫花地丁后升高。高劑量紫花地丁熱應激組和熱應激組的Fatp1mRNA和Pparα mRNA表達量對比對照組顯著降低。然而，紫花地丁顯著增加了熱應激條件下Fatp1mRNA的表達。因此，在日糧中添加紫花地丁可以減輕熱應激對腸道蛋白、氨基酸和脂肪酸消化吸收的影響。

腸道菌群的作用是促進胃腸蠕動，協(xié)助食物的消化與吸收，代謝藥物以及清除有害的物質(zhì)，對維持機體正常生理代謝和免疫力等具有重要作用^[31-32]。腸道微生物群落物種豐富度與多樣性受到多種因素的影響^[33-34]，熱應激會損害腸道結(jié)構(gòu)并改變腸道微生物組成^[6，35]。紫花地丁顯著增加了熱應激條件下盲腸菌群的Sobs指數(shù)，即上調(diào)了盲腸微生物的多樣性和豐富度。盲腸中的優(yōu)勢菌是厚壁菌門和擬桿菌門，這兩種菌群都能提高肉雞生長性能、腸道健康和機體免疫力^[36]。同時，還有證據(jù)表明腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的比例可以影響機體能量代謝^[37-38]。與對照組相比，添加紫花地丁增加了厚壁菌門的豐度，并且顯著增加熱應激條件下擬桿菌屬的比例。證明了在日糧中添加紫花地丁可以增加盲腸中的優(yōu)勢菌，從而緩解熱應激對肉雞生長性能和腸道健康等的負面影響。

熱應激還降低了益生菌的豐度，包括毛螺菌屬、毛螺菌科、梭菌屬、腸球菌科、胃瘤球菌屬和腸球菌科。表型指標與腸道微生物區(qū)系的相關性分析還表明，胃瘤球菌屬與Pept1、B⁰at1和Eaat3的表達呈正相關。此外，腸球菌屬與Cat1和Pparα的表達呈正相關。Pept1、B⁰at1和Eaat3是腸道上皮細胞相關轉(zhuǎn)運載體，氨基酸的吸收程度取決于它們的表達量^[39-41]。所以熱應激能通過影響十二指腸內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達，降低肉雞對蛋白質(zhì)的消化吸收，而這些變化與肉雞盲腸中的微生物群落的變化存在密切相關性。因此，在日糧中添加紫花地丁可以通過腸道微生物途徑來降低熱應激對腸道中脂肪消化和代謝的負面影響。

熱應激同樣增加了乳桿菌屬和norank_f_Ruminococcaceae屬的豐度。在熱應激條件下，添加紫花地丁可以增加盲腸中羅斯氏菌屬、產(chǎn)丁酸菌和狄氏副擬桿菌的豐度。同時，它還減少了有害細菌的豐度，如Desulfovibrionaceae科、Eisenbergiella屬、嗜膽菌屬和Subdoligranulum屬。因此，乳桿菌屬和剪切力、滴水損失呈顯著正相關，但與Pparα和Fatp1mRNA的表達呈顯著負相關。norank_f_Ruminococcaceae與蒸煮損失和CK呈正相關，但與pH45 min、GLO和Fatp1的表達呈顯著負相關。Eisenbergiella屬、嗜膽菌屬和Subdoligranulum屬都與Myf5呈顯著正相關。Eisenbergiella屬與pH45 min呈負相關。Subdoligranulum屬與十二指腸脂肪酶活性呈顯著負相關。肉品質(zhì)通常通過測量某些指標來評估，如pH、肉色、滴水損失、蒸煮損失剪切力^[42-43]。Wang等^[44]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5基因的表達量與活體重、屠體重、半凈膛重和全凈膛重的關系十分緊密。并且，由于Myf5與屠宰性能相關基因群關系緊密，所以其表達量也會影響肉雞的屠宰性能。因此，在熱應激條件下，紫花地丁能夠增加益生菌的豐度，減少有害菌的豐度，防止肌肉pH下降，增加胸肌肉色值，減少剪切力、滴水損失和蒸煮損失，從而改善肉雞的肉品質(zhì)。

4 結(jié) 論

適量補充紫花地丁可有效減輕熱應激對肉雞生長性能、肉品質(zhì)和十二指腸的消化功能的負面影響并調(diào)節(jié)肉雞腸道菌群的平衡。本研究為紫花地丁在家禽生產(chǎn)中的應用提供了科學依據(jù)，對家禽養(yǎng)殖臨床中熱應激的防治具有參考價值。

參考文獻（References）：

[1]HABASHY WS，MILFORT MC，ADOMAKO K，et al.Effect of heat stress on amino acid digestibility and transporters in meat-type chickens[J].Poult Sci，2017，96（7）：2312-2319.

[2]HE YQ，MALTECCA C，TIEZZI F.Potential use of gut microbiota composition as abiomarker of heat stress in monogastric species：a review[J].Animals（Basel），2021，11（6）：1833.

[3]TANG LP，LIU YL，ZHANG JX，et al.Heat stress in broilers of liver injury effects of heat stress on oxidative stress and autophagy in liver of broilers[J].Poult Sci，2022，101（10）：102085.

[4]TAVANIELLO S，SLAWINSKA A，SIRRI F，et al.Performance and meat quality traits of slow-growing chickens stimulated in ovo with galactooligosaccharides and exposed to heat stress[J].Poult Sci，2022，101（8）：101972.

[5]LI QF，ZHOU H，OUYANG JX，et al.Effects of dietary tryptophan supplementation on body temperature，hormone，and cytokine levels in broilers exposed to acute heat stress[J].Trop Anim Health Prod，2022，54（3）：164.

[6]SHI DY，BAI L，QU Q，et al.Impact of gut microbiota structure in heat-stressed broilers[J].Poult Sci，2019，98（6）：2405-2413.

[7]YANG T，LIU BF，WANG YJ，et al.Ellagic acid improves antioxidant capacity and intestinal barrier function of heat-stressed broilers via regulating gut microbiota[J].Animals（Basel），2022，12（9）：1180.

[8]ZHANG L，ZHONG G，GU WJ，et al.Dietary supplementation with daidzein and Chinese herbs，independently and combined，improves laying performance，egg quality and plasma hormone levels of post-peak laying hens[J].Poult Sci，2021，100（6）：101115.

[9]SUN KX，WU LG J，WANG SY，et al.Antitumor effects of Chinese herbal medicine compounds and their nano-formulations on regulating the immune system microenvironment[J].Front Oncol，2022，12：949332.

[10]LIU HW，ZHOU DW，TONG JM，et al.Influence of chestnut tannins on welfare，carcass characteristics，meat quality，and lipid oxidation in rabbits under high ambient temperature[J].Meat Sci，2012，90（1）：164-169.

[11]WANG L，PIAO XL，KIM SW，et al.Effects of Forsythia suspensa extract on growth performance，nutrient digestibility，and antioxidant activities in broiler chickens under high ambient temperature[J].Poult Sci，2008，87（7）：1287-1294.

[12]LI HG，ZHAO JS，DENG W，et al.Effects of chlorogenic acid-enriched extract from Eucommia ulmoides Oliver leaf on growth performance and quality and oxidative status of meat in finishing pigs fed diets containing fresh or oxidized corn oil[J].J Anim Physiol Anim Nutr（Berl），2020，104（4）：1116-1125.

[13]CHU HQ，WANG JX，WANG Q，et al.Protective effect of n-Butanol extract from Viola yedoensis on immunological liver injury[J].Chem Biodivers，2021，18（6）：e2001043.

[14]CAO DL，ZHANG XJ，XIE SQ，et al.Application of chloroplast genome in the identification of Traditional Chinese Medicine Viola philippica[J].BMC Genomics，2022，23（1）：540.

[15]ZENG HR，ZHAO B，ZHANG D，et al.Viola yedoensis Makino formula alleviates DNCB-induced atopic dermatitis by activating JAK2/STAT3signaling pathway and promoting M2macrophages polarization[J].Phytomedicine，2022，103：154228.

[16]WANG CK L，COLGRAVE ML，GUSTAFSON KR，et al.Anti-HIV cyclotides from the Chinese medicinal herb Viola yedoensis[J].J Nat Prod，2008，71（1）：47-52.

[17]WANG XL，LIU XY，LIU S，et al.Effects of anti-stress agents on the growth performance and immune function in broiler chickens with vaccination-induced stress[J].Avian Pathol，2023，52（1）：12-24.

[18]ZHANG LY，LI X，LIU XY，et al.Purified diet versus whole food diet and the inconsistent results in studies using animal models[J].Food Funct，2022，13（8）：4286-4301.

[19]SIDDIQUI SH，KANG D，PARK J，et al.Chronic heat stress regulates the relation between heat shock protein and immunity in broiler small intestine[J].Sci Rep，2020，10（1）：18872.

[20]DANGI SS，GUPTA M，NAGAR V，et al.Impact of short-term heat stress on physiological responses and expression profile of HSPs in Barbari goats[J].Int JBiometeorol，2014，58（10）：2085-2093.

[21]WANG Y，ZHAO HJ，LIU JJ，et al.Copper and arsenic-induced oxidative stress and immune imbalance are associated with activation of heat shock proteins in chicken intestines[J].Int Immunopharmacol，2018，60：64-75.

[22]ABDELNOUR SA，AL-GABRI NA，HASHEM NM，et al.Supplementation with proline improves haemato-biochemical and reproductive indicators in male rabbits affected by environmental heat-stress[J].Animals（Basel），2021，11（2）：373.

[23]DENG SL，LIU R，LI CB，et al.Meat quality and flavor compounds of soft-boiled chickens：effect of Chinese yellow-feathered chicken breed and slaughter age[J].Poult Sci，2022，101（12）：102168.

[24]KIM HJ，KIM HJ，JEON JJ，et al.Comparison of the quality characteristics of chicken breast meat from conventional and animal welfare farms under refrigerated storage[J].Poult Sci，2020，99（3）：1788-1796.

[25]ULMAN A，KOT M，SKRZYPEK K，et al.Myogenic differentiation of iPS cells shows different efficiency in simultaneous comparison of protocols[J].Cells，2021，10（7）：1671.

[26]SOSA P，ALCALDE-ESTéVEZ E，ASENJO-BUENO A，et al.Aging-related hyperphosphatemia impairs myogenic differentiation and enhances fibrosis in skeletal muscle[J].J Cachexia Sarcopenia Muscle，2021，12（5）：1266-1279.

[27]DUNN AJ，ANDO T，BROWN RF，et al.HPA axis activation and neurochemical responses to bacterial translocation from the gastrointestinal tract[J].Ann NY Acad Sci，2003，992（1）：21-29.

[28]ARTHUR S，MANOHARAN P，SUNDARAM S，et al.Unique regulation of enterocyte brush border membrane Na-glutamine and Na-alanine Co-transport by peroxynitrite during chronic intestinal inflammation[J].Int JMol Sci，2019，20（6）：1504.

[29]CHEN ZG，ZHOU LH，YUAN QL，et al.Effect of fumonisin B₁on oxidative stress and gene expression alteration of nutrient transporters in porcine intestinal cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2021，35（4）：e22706.

[30]CHRISTOFIDES A，KONSTANTINIDOU E，JANI C，et al.The role of peroxisome proliferator-activated receptors（PPAR）in immune responses[J].Metabolism，2021，114：154338.

[31]ZHOU BL，YUAN YT，ZHANG SS，et al.Intestinal flora and disease mutually shape the regional immune system in the intestinal tract[J].Front Immunol，2020，11：575.

[32]DOMINGO JJ S，SáNCHEZ CS.From the intestinal flora to the microbiome[J].Rev Esp Enferm Dig，2018，110（1）：51-56.

[33]HILLS RD，PONTEFRACT BA，MISHCON HR，et al.Gut microbiome：profound implications for diet and disease[J].Nutrients，2019，11（7）：1613.

[34]MILANI C，DURANTI S，BOTTACINI F，et al.The first microbial colonizers of the human gut：composition，activities，and health implications of the infant gut microbiota[J].Microbiol Mol Biol Rev，2017，81（4）：e00036-17.

[35]ROSTAGNO MH.Effects of heat stress on the gut health of poultry[J].J Anim Sci，2020，98（4）：skaa090.

[36]CLAVIJO V，F(xiàn)LóREZ MJ V.The gastrointestinal microbiome and its association with the control of pathogens in broiler chicken production：A review[J].Poult Sci，2018，97（3）：1006-1021.

[37]LEY RE，TURNBAUGH PJ，KLEIN S，et al.Microbial ecology：human gut microbes associated with obesity[J].Nature，2006，444（7122）：1022-1023.

[38]TURNBAUGH PJ，LEY RE，MAHOWALD MA，et al.An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J].Nature，2006，444（7122）：1027-1031.

[39]SPANIER B，ROHM F.Proton coupled oligopeptide transporter1（PepT1）function，regulation，and influence on the intestinal homeostasis[J].Compr Physiol，2018，8（2）：843-869.

[40]BR?ER S.The role of the neutral amino acid transporter B⁰AT1（SLC6A19）in Hartnup disorder and protein nutrition[J].IUBMB Life，2009，61（6）：591-599.

[41]BIANCHI MG，BARDELLI D，CHIU M，et al.Changes in the expression of the glutamate transporter EAAT3/EAAC1in health and disease[J].Cell Mol Life Sci，2014，71（11）：2001-2015.

[42]KATEMALA S，MOLEE A，THUMANU K，et al.Meat quality and Raman spectroscopic characterization of Korat hybrid chicken obtained from various rearing periods[J].Poult Sci，2021，100（2）：1248-1261.

[43]LE BIHAN-DUVAL E，DEBUT M，BERRI CM，et al.Chicken meat quality：genetic variability and relationship with growth and muscle characteristics[J].BMC Genet，2008，9：53.

[44]WANG Y，ZHU Q，ZHAO XL，et al.Association of FATP1gene polymorphisms with chicken carcass traits in Chinese meat-type quality chicken populations[J].Mol Biol Rep，2010，37（8）：3683-3690.

（編輯 范子娟）