雞滑液囊支原體對常用抗菌藥流行病學臨界值的建立

摘 要：雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是現(xiàn)在規(guī)模化禽養(yǎng)殖業(yè)中危害最大的支原體之一，同時也出現(xiàn)了嚴重的耐藥性。為了解雞滑液囊支原體對各種藥物的耐藥現(xiàn)狀。本課題參考CLSI和EUCAST中制定流行病學/野生型臨界值（epidemiological/wildtype cut-off values，ECOFFs/CO_WT）的方法，通過查找國內(nèi)外相關文獻報道，收集匯總近5年不同地區(qū)、不同來源的MS對各種藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）數(shù)據(jù)，應用肉眼觀察法、ECOFFinder軟件分析法和正態(tài)化耐藥解釋法（NRI）綜合分析從而得到ECOFFs，隨后計算相應的耐藥率。結(jié)果顯示，MS對泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素、多西環(huán)素、土霉素、金霉素、泰妙菌素、林可霉素、氟苯尼考和大觀霉素的ECOFF值分別為1、0.5、0.5、2、4、2、2、2、8和4μg·mL^-1。在CLSI和EUCAST缺乏MS對各種抗菌藥的敏感性折點下，本課題為臨床合理用藥，耐藥性工作的開展，減少MS耐藥性的產(chǎn)生以及治療與防控提供了理論基礎與科學依據(jù)。

關鍵詞：雞滑液囊支原體；流行病學臨界值；耐藥性；ECOFFinder軟件；正態(tài)化耐藥解釋法

中圖分類號：S852.62

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2701-15

收稿日期：2023-07-18

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1800600）；國家自然科學基金（32172914）；中央高校自主創(chuàng)新基金（2662022DKYJC005）；湖北省自然科學基金（2021CFA016）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-41）

作者簡介：鄒紫瑩（1999-），女，江西撫州人，碩士生，主要從事獸醫(yī)藥理學和抗菌耐藥性研究，E-mail：zzy15179469958@163.com

*通信作者：郝海紅，主要從事獸醫(yī)藥理學和抗菌耐藥性研究，E-mail：haohaihong@mail.hzau.edu.cn

Establishment on Commonly Used Antimicrobials Epidemiological

Cut-off Values of Mycoplasma synoviae

ZOUZiying，HUANGAnxiong，RUANZihan，HAOHaihong^*

（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology（HZAU），National Reference Laboratory of

Veterinary Drug Residues（HZAU），The Key Laboratory for the Detection of Veterinary Drug

Residues，Ministry of Agriculture（HZAU），National Laboratory for Safety Evaluation of

Veterinary Drugs（HZAU），Laboratory of Qualityamp;Safety Risk Assessment for

Livestock and Poultry Products（Wuhan），Wuhan430070，China）

Abstract：Mycoplasma synoviae（MS）is one of the most detrimental mycoplasmas in the large-scale poultry industry.Meanwhile，the development of antimicrobial resistance to MS is serious currently.In order to understand the current situation of antimicrobial resistance to MS，the research was conducted in reference to the method of establishing epidemiological/wildtype cut-off values（ECOFFs/CO_WT）in CLSI and EUCAST by collecting and summarizing MIC from different regions and sources in recent5years after searching relevant literature reports at home and abroad，and then the ECOFFs of various antimicrobial agents to MS were obtained through comprehensive analysis using visual estimation，ECOFFFinder software analysis and Normalized Drug Resistance Interpretation（NRI）.Subsequently，the corresponding drug resistance rates were calculated.（Results and Conclusion）It showed that the ECOFFs of MS to tylosin，tilmicosin，tylvalosin，doxycycline，oxytetracycline，chlortetracycline，enrofloxacin，tiamulin，lincomycin，florfenicol and spectinomycin were1，0.5，0.5，2，4，2，2，2，8and4μg·mL^-1respectively.In absence of sensitive breakpoint of MS in CLSI and ECUAST，the theoretical basis and scientific evidence are provided by this research for the rational use of drugs in clinical practice，development of antimicrobial resistance work for monitoring and reducing it，and also beneficial for the treatment and control of MS.

Key words：Mycoplasma synoviae; epidemiological cut-off values; drug resistance; ECOFFinder software; normalized drug resistance interpretation（NRI）

*Corresponding author：HAO Haihong，E-mail：haohaihong@mail.hzau.edu.cn

雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是目前臨床上最常見的支原體類致病微生物之一，無細胞壁，對家禽危害嚴重，被世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health，WOAH）列為應上報的禽類疾病^[1-2]。雞滑液囊支原體是感染雞和火雞的一種急性或慢性亞臨床型傳染性病原，通過呼吸道傳播，侵害雞關節(jié)滑液囊膜及腱鞘，引起滲出性滑膜炎、腱鞘炎及附關節(jié)和腳墊腫脹；也會引起呼吸道癥狀，表現(xiàn)出呼吸困難、氣管啰音等^[1，3]。MS的傳播方式都是水平傳播和垂直傳播，在雞群中凈化難度較大。雞群支原體的感染會造成臨床上呼吸道問題、肉雞飼料利用率降低、生長發(fā)育遲緩、蛋雞的淘汰率增高、產(chǎn)蛋量下降等^[4-5]，嚴重影響雞群的正常生產(chǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失^[6]。對于MS的控制，免疫接種和藥物治療是防治的主要方法，并且在已發(fā)病的情況下藥物治療是更優(yōu)的選擇。但是由于支原體的分離難度高、生長緩慢和出藥敏結(jié)果報告的時間長等原因，臨床上大多數(shù)治療支原體的方案往往是根據(jù)以往的經(jīng)驗，而不是根據(jù)藥敏試驗數(shù)據(jù)^[7]。因此，在沒有合理的用藥指導下，MS對各種藥物的敏感性越來越低，這說明耐藥性可能已經(jīng)出現(xiàn)。為了保護現(xiàn)有藥物的有效性和發(fā)揮更好的臨床治療效果，需要選擇更合理的藥物治療MS的感染，這也是本課題的意義所在。

抗菌藥物敏感性折點（clinical breakpoints，CBPs）是用于定義細菌對藥物敏感或耐藥的標準。目前主要有美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical laboratory Standard Institute，CLSI）和歐盟藥敏試驗標準委員會（European Commission of Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）這兩個組織制定折點。EUCAST和CLSI制定折點的方法雖有所不同，但都需要先建立流行病學/野生型臨界值（ECOFF/CO_WT）、PK-PD臨界值（pharmacokinetics-pharmacodynamics，CO_PD）和臨床臨界值（clinical cut-off values，CO_CL），然后根據(jù)三個臨界值的大小關系確定最終的敏感性折點^[8]。在缺乏相關藥動學研究和臨床數(shù)據(jù)而無法建立CO_PD和CO_CL的情況下，可以用ECOFF暫代敏感性折點使用^[9]。ECOFF用于對分離菌株進行耐藥性的流行病學監(jiān)測，是野生型菌株MIC值范圍的上限^[10]，并且通常不考慮臨床因素，在一定時期內(nèi)，并不會隨樣本來源及不同地區(qū)而異，因此該值相對穩(wěn)定，在全世界范圍內(nèi)通用^[11]。為了避免試驗操作的差異^[12]，細菌MIC數(shù)據(jù)的分析和最終ECOFF的確定主要由軟件統(tǒng)計方法來確定^[13]，并且不同方法建立的ECOFF是大致相同的^[14]。

雖然CLSI發(fā)布了人支原體敏感性檢測標準（methods for antimicrobial testing for human mycoplasma，approved Guideline，M43-A），然而目前國際上，包括CLSI和EUCAST等都缺乏MS對各種抗菌藥的敏感性折點。因此本課題參考CLSI和EUCAST中制定折點的方法，通過多種數(shù)據(jù)庫收集匯總近5年不同國家不同地區(qū)的MS對各種藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），利用肉眼觀察法、ECOFFinder程序和正態(tài)化耐藥解釋法（normalized resistance interpretation，NRI）三種方法綜合分析，從而建立了各種藥物的ECOFF。本課題填補了國內(nèi)MS對各種藥物ECOFF的空白，有助于耐藥性工作的開展以及為臨床有效治療MS的合理用藥提供了指導。

1 材料與方法

1.1 MIC數(shù)據(jù)收集與整理

關于數(shù)據(jù)收集，CLSI規(guī)定：若要確定CO_WT，則需采集與臨床感染有關的各個種屬的細菌，并且當病原以屬分類，如大腸桿菌、腸球菌等，需至少300株目標菌；當病原以種分類，如金黃色葡萄球菌，需至少100株目標菌。EUCAST上也有類似的要求，若要建立同一種屬病原的CO_WT，需至少100個MIC數(shù)據(jù)分布；但目前也有報道稱只需要至少30株野生型細菌就能建立^[15]。為使結(jié)果更具科學性，本研究挑選菌株數(shù)大于100的藥物進行CO_WT的制定。對于菌株，由于EUCAST中5年更新一次ECOFF數(shù)據(jù)，因而選擇近5年的臨床菌株，并且分離株需從感染動物獲得并經(jīng)過參考方法得到鑒定。

本課題通過查找中國知網(wǎng)、萬方、PubMed、ScienceDirect、Web of science等數(shù)據(jù)庫資源，查找近5年內(nèi)的國內(nèi)外不同地區(qū)MS對各種藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）數(shù)據(jù)。而由于目前暫時還沒有規(guī)定抗菌藥對MS最小抑菌濃度的標準化規(guī)程，通過文獻調(diào)查，對于獸醫(yī)支原體的MIC測定方法，科研工作者主要是參考CLSI M43-A人類支原體的抗菌藥敏試驗方法^[16]，以及Hannan^[17]為比較支原體學國際研究規(guī)劃（IRPCM）編寫的獸醫(yī)支原體最小抑菌濃度試驗的指南和建議。關于以上兩種藥敏參考方法，由于對支原體的定量計數(shù)方法，Hannan指南中肉湯稀釋法的顏色改變單位（color change unit，CCU）比CLSI中的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）更具可行性以及在臨床研究中廣泛使用^[18-20]。因而本課題對于數(shù)據(jù)進行相同標準處理，統(tǒng)一選擇參考Hannan指南利用CCU計數(shù)方法的文獻數(shù)據(jù)；隨后，將收集到的MS對各種藥物的MIC數(shù)據(jù)進行匯總。

1.2 確定ECOFFs

目前，有“肉眼觀察法”和“統(tǒng)計法”來確定ECOFF，這兩種方法也是EUCAST所推薦的方法^[21]。“肉眼觀察法”是先繪制出MIC分布直方圖，再肉眼觀察得出ECOFF值，有研究報道一般ECOFF值為峰值后1～2個稀釋濃度的MIC值^[22]?！叭庋塾^察法”簡單直觀，但是具有一定的主觀性，并且一般對于具有單峰或明顯雙峰的MIC分布效果較好，而對于野生型和非野生型有部分重合的MIC分布則效果不好^[11]；“統(tǒng)計法”則可以參照Turnidge等^[23]介紹的ECOFFinder軟件進行統(tǒng)計分析，該軟件利用了Microsoft Excel的宏功能，遵循野生型菌株MIC值分布的統(tǒng)計表征，可以幫助建立流行病學臨界值。目前，ECOFFinder軟件可在CLSI官網(wǎng)上下載使用。正態(tài)化耐藥解釋法（NRI）是由Kronvall等^[13，24]學者提出的軟件分析方法，也是利用了Microsoft Excel的宏功能，輸入相應的抑菌圈數(shù)據(jù)或MIC分布，從而定義出野生型菌群的客觀方法。NRI軟件可在該網(wǎng)站（http：∥www.bioscand.se/nri/）上下載使用。有關具體操作，兩種軟件均有詳細的相關說明。

本課題利用“肉眼觀察法”、統(tǒng)計學的ECOFFinder方法和NRI方法綜合分析從而建立ECOFF。在ECOFFinder中輸入各類常用藥物的MIC數(shù)據(jù)，從而繪制出了各種藥物所對應菌株的MIC分布直方圖、原始MIC數(shù)據(jù)分布曲線圖和經(jīng)過擬合后的MIC數(shù)據(jù)分布曲線^[25]，建立起95%置信區(qū)間下各種藥物對MS的野生型臨界值。NRI方法也類似，按照軟件的相關說明，將MIC分布數(shù)據(jù)輸入軟件，即可自動計算出相應的ECOFF。

1.3 耐藥率的計算

綜合考慮肉眼觀察法和兩種統(tǒng)計學方法，最后確認ECOFF值進行MS對各種藥物的耐藥率計算，其中，ECOFFinder的統(tǒng)計結(jié)果是取置信區(qū)間為95%的ECOFF值。由于ECOFF是野生型菌株MIC值范圍的上限，所以MIC值小于等于該ECOFF的菌株為野生型菌株，MIC值大于該ECOFF的菌株則為非野生型菌株。因此，耐藥率即為非野生型菌株數(shù)占菌株總數(shù)的比例。耐藥率的計算可以粗略反映MS對各種藥物的耐藥情況，為日后耐藥性的監(jiān)測和敏感性折點的建立提供一定的數(shù)據(jù)基礎和科學依據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 MS對12種藥物的MIC數(shù)據(jù)整理

按照統(tǒng)一標準進行文獻的數(shù)據(jù)收集，將MS對12種藥物的MIC數(shù)據(jù)按照藥物名稱、菌株總數(shù)、來源地區(qū)、參考文獻等進行整理，匯總結(jié)果見表1。由該表可知，所收集到的數(shù)據(jù)來源廣泛，主要來自歐洲、亞洲、非洲和大洋洲，同時通過調(diào)研可以發(fā)現(xiàn)我國的MIC數(shù)據(jù)較少。

隨后，將12種藥物對MS的具體MIC數(shù)據(jù)整理成MIC分布圖，結(jié)果見表2。由表2可知，MS對泰樂菌素的MIC數(shù)據(jù)分布最廣泛，為0.004～128μg·mL^-1，這表明雖然一部分菌株依然對這種藥物保持著非常好的敏感性，但也出現(xiàn)了一定程度上的耐藥情況，致使在以后的治療中很可能出現(xiàn)治療失敗的現(xiàn)象。

2.2 確定ECOFFs

先用“肉眼觀察法”，初步得到ECOFF_Visual；隨后，應用兩種統(tǒng)計學方法計算出ECOFF。ECOFFinder方法步驟如下，將整理好的MIC分布數(shù)據(jù)，輸入ECOFFinder軟件，從而繪制出原始MIC數(shù)據(jù)分布直方圖和紅色的原始MIC分布曲線，經(jīng)過軟件擬合后，則繪制出綠色的MIC分布擬合曲線，12種藥對MS的擬合結(jié)果見圖1。MIC分布數(shù)據(jù)輸入后，則自動計算出不同置信區(qū)間下相應的流行病學臨界值，選擇95%置信區(qū)間下的ECOFF_ECOFFinder值。NRI方法的步驟也類似，參考相關軟件使用說明，將MIC分布的數(shù)據(jù)輸入軟件，操作后會出現(xiàn)一條擬合曲線，相關擬合曲線見圖2，并且自動計算出ECOFF_NRI。三種方法的ECOFF結(jié)果見表3。

由圖1和2可知，大部分藥物的MIC原始數(shù)據(jù)曲線基本呈現(xiàn)單峰分布。大觀霉素和土霉素的MIC分布呈典型的單峰分布，故推測幾乎沒有出現(xiàn)耐藥菌株。泰樂菌素曲線的左右兩端都有1個小峰，推測有部分的MS菌株分別對泰樂菌素敏感和耐藥。替米考星曲線的峰值右側(cè)有眾多MIC值偏大的平緩分布，并且最右側(cè)有個小峰，推測出現(xiàn)了很多MS菌株對替米考星耐藥。泰妙菌素曲線的左側(cè)有1個小峰，推測有部分菌株對泰妙菌素敏感。

繼而觀察表3，三種方法所得出的ECOFF值大部分是基本一致的，尤其是肉眼觀察法和ECOFFinder軟件分析得出的ECOFF值，可能是由于本課題中大部分的MIC分布基本呈現(xiàn)單峰分布。而對于ECOFFinder和NRI，結(jié)果大部分是一致的，除了替米考星和泰妙菌素其他藥物結(jié)果一致或只差1～2個稀釋度，猜測可能是替米考星和泰妙菌素的分布并不在峰值處對稱，導致不同軟件的擬合有點出入，或者目前所收集的數(shù)據(jù)不足導致的差異。最后綜合考慮該三種方法，確定MS對泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素、多西環(huán)素、土霉素、金霉素、泰妙菌素、林可霉素、氟苯尼考和大觀霉素的ECOFF值分別為1、0.5、0.5、2、4、2、2、2、8和4μg·mL^-1。

觀察MS對12種藥物的MIC₅₀、MIC₉₀和ECOFF值，可以發(fā)現(xiàn)MS對大部分藥物的ECOFF值相對較低，說明大部分的藥物仍然具有良好的治療效果。泰萬菌素、替米考星的ECOFF值最小，均為0.5μg·mL^-1，說明MS對泰萬菌素、替米考星兩種藥敏感，能夠有效地治療臨床上野生型菌株的感染；但是根據(jù)替米考星的MIC分布發(fā)現(xiàn)該藥可能已經(jīng)出現(xiàn)了很多耐藥菌株，因而臨床上需要謹慎使用，保護其有效性。泰樂菌素的ECOFF值為1μg·mL^-1，說明目前大環(huán)內(nèi)酯類藥物仍然是治療MS感染的首選藥物。泰妙菌素的ECOFF值為2μg·mL^-1，并且目前還沒有強耐藥菌的出現(xiàn)，因而該藥對MS的療效是值得保護的。對四環(huán)素類藥物的多西環(huán)素、土霉素和金霉素的ECOFF值分別為2、4和2μg·mL^-1，推測四環(huán)素類藥物中的多西環(huán)素和金霉素比土霉素敏感。林可霉素和大觀霉素的ECOFF值分別為2和4μg·mL^-1，MS對林可霉素和大觀霉素還是較為敏感的，但從MIC分布上來看，已經(jīng)出現(xiàn)了部分MS菌株對林可霉素強耐藥，因而臨床上也需要謹慎合理的使用林可霉素。氟苯尼考的ECOFF值為8μg·mL^-1，相對其他藥物的ECOFF值是偏高的，但峰型趨近單峰，說明MS對氟苯尼考并沒有產(chǎn)生嚴重的耐藥現(xiàn)象。

2.3 耐藥率

根據(jù)流行病學臨界值來計算MS對10種藥物的耐藥率，以MS對泰樂菌素的耐藥率為例：總菌株數(shù)為453株，其中，有403株野生型菌株和50株非野生型菌株，則耐藥率為11.0%（50/453）。同理，計算出MS對其他藥物的耐藥率，結(jié)果也詳見表3。由表3可知，除了氟苯尼考，其他藥物對MS都有一定的耐藥率，推測是由于收集的數(shù)據(jù)量過少，導致氟苯尼考的野生型臨界值后暫時無數(shù)據(jù)，因而此時0%的耐藥率不具有科學參考意義。泰妙菌素的耐藥率最低為0.4%，替米考星的耐藥率最高為46.9%，與前文圖1和2所推測的一致。MS對土霉素、大觀霉素、泰萬菌素和多西環(huán)素的耐藥率分別為1.4%、2.2%、4.2%和5.6%，說明目前對該四種藥物較敏感；其他藥物的耐藥率情況也與圖1和2所推測的基本一致。

3 討 論

目前，抗生素在控制雞滑液囊支原體感染中發(fā)揮了重要的作用；但同時由于支原體分離難度高、生長緩慢、出藥敏結(jié)果慢等原因，臨床上大多數(shù)治療支原體的方案往往是根據(jù)以往的經(jīng)驗，因而臨床上不能制定出科學的用藥方案；這導致了MS耐藥性的產(chǎn)生，該問題引起人們的高度關注。并且在獸醫(yī)臨床上，大部分的抗菌藥物仍未制定出相應的敏感性折點，導致無法有效監(jiān)管及監(jiān)測耐藥性風險，進一步加快了MS耐藥性的產(chǎn)生。針對MS耐藥性的問題并且能在臨床上有效治療感染，制定出MS耐藥性判定標準迫在眉睫。ECOFFs可用于判斷菌株屬于野生型或非野生型，而非野生型菌株的MIC值大于ECOFFs，將野生型菌株的測序結(jié)果與非野生型菌株的測序結(jié)果對比，則有利于發(fā)現(xiàn)耐藥機制；ECOFFs還能優(yōu)化臨床動物用藥的選擇，從而更好地指導臨床科學用藥；并且有利于MS耐藥性的監(jiān)測，減緩耐藥菌的產(chǎn)生，為今后敏感性折點的建立提供一定的數(shù)據(jù)基礎和科學依據(jù)。

3.1 研究方法的可行性

Turnidge等^[10]發(fā)明出ECOFFinder程序，應用Microsoft Excel的宏功能，根據(jù)野生型菌株MIC值分布的自動擬合從而計算出不同置信區(qū)間下的ECOFF，該軟件的原理是利用非線性回歸分析對累計分布進行擬合。雷志鑫^[35]應用了線性回歸統(tǒng)計和ECOFFinder方法來制定泰地羅新對副豬嗜血桿菌的ECOFFs，結(jié)果表明兩種方法的ECOFF一致，從而驗證了ECOFFinder方法的可行性；Kronvall等^[13]運用NRI方法，制定出替加環(huán)素對不同細菌的ECOFFs。FredrikResman等^[36]也應用NRI方法來調(diào)查銅綠假單胞菌對美羅培南的易感性，并且在一個為期18年的耐藥監(jiān)測項目中運用NRI制定折點；國外學者Baron等^[37]應用ECOFFinder和NRI兩種方法制定了氣單胞菌對14種抗菌藥的ECOFFs，結(jié)果幾乎一致，最多僅有一個稀釋度的差異；傅嘉莉^[38]和吳思莉等^[39]都同時應用了線性回歸統(tǒng)計、ECOFFinder、NRI三種方法分別制定大腸桿菌和沙門菌對三種動物專用藥物的ECOFFs，結(jié)果也表明這三種方法得出的結(jié)果幾乎一致。國外學者Canton等^[14]也比較了這三種方法，分析發(fā)現(xiàn)使用不同的統(tǒng)計學方法所制定出的ECOFF大致相同。

因而，以上研究皆說明了ECOFFinder方法和NRI方法的科學性，對于ECOFFs的建立是可行的。而本研究中替米考星和泰妙菌素兩種統(tǒng)計學方法的結(jié)果相差3個稀釋度，推測原因可能是該兩種藥的MIC分布并不在峰值處對稱，導致不同軟件的擬合有點差異，或者目前所收集的數(shù)據(jù)不足。

3.2 ECOFFs比較

本研究參考了CLSI和EUCAST的方法，初步制定了10種藥物對雞滑液囊支原體的野生型臨界值。值得注意的是，由于數(shù)據(jù)有限，恩諾沙星曲線分布不完整，呈現(xiàn)截斷分布，因而目前暫時無法建立MS對恩諾沙星的ECOFF，需要收集更多的數(shù)據(jù)。此外，新霉素的ECOFF值最大，為128μg·mL^-1，但根據(jù)MIC分布來看，新霉素并沒有耐藥峰的出現(xiàn)，其ECOFF擬合結(jié)果較大的原因可能是MS對新霉素不敏感，所以MIC結(jié)果較大，峰型靠右；或者推測目前所收集到的數(shù)據(jù)過少，也需要收集更多的數(shù)據(jù)來建立更科學的ECOFF。對于ECOFFs的比較，由于CLSI和EUCAST目前還沒有對雞滑液囊支原體的野生型臨界值制定標準，相關文獻中也很少有雞滑液囊支原體的ECOFFs報道，因而在這里對比文獻中所參考的折點值。隨后通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前大多數(shù)研究者^{[34，40-43]}參考的是Hannan指南^[17]上所建議的折點值。本課題制定的泰樂菌素的ECOFF為1μg·mL^-1，與Hannan指南中建議的判定MS敏感的標準值≤1μg·mL^-1、耐藥的標準值＞1μg·mL^-1結(jié)果一致；土霉素的ECOFF為4μg·mL^-1，與指南中建議的敏感判定標準≤4μg·mL^-1結(jié)果一致；對于泰妙菌素，本課題研究制定的ECOFF為2μg·mL^-1，而指南中建議的敏感判定標準是≤8μg·mL^-1，比指南低2個稀釋度，分析原因可能是本研究匯總的菌株數(shù)較少；林可霉素的ECOFF為2μg·mL^-1，也符合指南上建議的敏感判定標準≤2～8μg·mL^-1。整體來看，本研究制定的ECOFFs有科學依據(jù)和一定參考價值。

3.3 支原體耐藥機制調(diào)研

據(jù)報道，目前，最廣泛用于治療支原體的藥物是大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類和截短側(cè)耳素類藥物^[44-47]，其他藥物例如林可霉素類、氯霉素類和氨基糖苷類也能有效治療支原體感染^[44]；關于支原體的耐藥機制，通過查找文獻發(fā)現(xiàn)，雞滑液囊支原體對藥物的耐藥原因也是多種多樣的。支原體對一些藥物固有耐藥，例如由于沒有細胞壁，對β-內(nèi)酰胺類、糖肽類藥物和桿菌肽固有耐藥^{[7，44]}；同時也沒有合成葉酸的酶，對磺胺類藥物^[48-49]和甲氧芐啶^[48，50]也固有耐藥；此外，支原體也對利福平^[49，51]和多黏菌素^[49，52]固有耐藥。而由于支原體的固有耐藥，從而縮小了治療支原體的藥物選擇范圍，這也從側(cè)面體現(xiàn)出了合理應用目前現(xiàn)有對支原體有效的藥物的重要性。

Kang等^[53]學者首次研究了雞滑液囊支原體的生物被膜形成與耐藥性之間的關系，發(fā)現(xiàn)了MS對恩諾沙星、多西環(huán)素、泰妙菌素和泰樂菌素的敏感性隨著生物被膜的形成而降低，其中，泰樂菌素的敏感性下降幅度最大。而生物被膜的形成導致細菌耐藥性主要有兩個原因，改變膜的通透性從而阻止抗菌劑進入細菌，并且細菌在生物被膜內(nèi)處于休眠狀態(tài)對抗菌劑不太敏感^[53-54]。

目前，也有很多學者對基因突變與耐藥性之間的聯(lián)系進行研究；Lysnyansky等^[55]和張惠茹等^[30]都發(fā)現(xiàn)MS對氟喹諾酮類的耐藥性與基因突變有關，相關的基因為編碼DNA拓撲異構(gòu)酶ⅣparC、parE和拓撲異構(gòu)酶ⅡgyrA、gyrB。謝迪^[40]的研究結(jié)果也顯示，MS對氟喹諾酮類藥物獲得耐藥性的靶點為parC和parE基因，其氨基酸的替換導致MS對氟喹諾酮類藥物耐藥；Lysnyansky等^[56]研究表明，MS對大環(huán)內(nèi)酯類的敏感性降低與23S rRNA等位基因中的氨基酸替換有關，相關的基因有rrlA、rrlB、rplD和rplV；張惠茹等^[30]的研究并未發(fā)現(xiàn)rrlA、rrlB，但是也發(fā)現(xiàn)了MS對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥可能與編碼核糖體蛋白L4、L22rplD及rplV突變相關；李俊等^[28]對篩選出的多重耐藥菌株（MS HB）進行全基因組序列分析，首次報道在MS基因組中檢測到ermQ耐藥基因，該基因編碼甲基化酶，讓23S rRNA基因甲基化，從而使MS對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類產(chǎn)生耐藥性；Katinka Beko等^[32]的研究中發(fā)現(xiàn)MS對林可霉素耐藥與rrlA、rrlB基因的突變有關；而對于截短側(cè)耳素類，有學者發(fā)現(xiàn)支原體對該藥的耐藥機制是通過突變或甲基化改變肽基轉(zhuǎn)移酶中心^[57]，但是，目前耐藥基因尚不明確，今后待進一步的研究；同時，目前關于MS對四環(huán)素類耐藥機制的研究較少，但由于tet基因是其他支原體耐藥性產(chǎn)生的研究熱點，因此今后可以tet基因為切入點展開四環(huán)素類的耐藥性研究。

3.4 臨床合理用藥的分析及建議

防控雞滑液囊支原體感染主要有疫苗免疫和藥物控制兩種方法^[58-59]。我國目前養(yǎng)殖場主要靠抗菌藥物防治該病^[60]，然而隨著藥物的廣泛使用，以及不合理使用，其防治效果欠佳，耐藥性的問題也逐漸凸顯出來。本研究參考CLSI和EUCAST上的方法，建立出MS對泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素、多西環(huán)素、土霉素、金霉素、泰妙菌素、林可霉素、氟苯尼考和大觀霉素的ECOFF值分別為1、0.5、0.5、2、4、2、2、2、8和4μg·mL^-1，為該病臨床合理用藥提供指導。從ECOFF值上看，大環(huán)內(nèi)酯類藥物的替米考星和泰萬菌素對MS最敏感，泰樂菌素次之，因而目前首選治療MS的藥物推薦使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物，但是本研究中顯示替米考星的耐藥率高達46.9%，已有很多MS菌株產(chǎn)生耐藥性，提示在臨床上應謹慎使用，更應采取一定的措施保護其有效性。多西環(huán)素、金霉素、泰妙菌素和林可霉素的ECOFF均為2μg·mL^-1，說明目前這4種藥對MS較為敏感，從而也證實了目前大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、截短側(cè)耳素類和林可酰胺類對于MS的治療具有很好的預防治療效果^[61]。

招麗嬋等^[60]測定了11株MS對10種抗菌藥物的MIC值，結(jié)果顯示泰樂菌素、泰萬菌素和泰妙菌素對11株MS的MIC值非常敏感，對多西環(huán)素、替米考星也較為敏感，與本研究的結(jié)果幾乎一致；丁美娟等^[62]測定了12種抗生素對MS的MIC，結(jié)果顯示MS對泰樂菌素比較敏感，對替米考星、林可霉素和土霉素敏感性次之，也與本研究結(jié)果基本一致；顧的樂^[63]檢測了廣東地區(qū)7株MS對9種抗菌藥的MIC值，其結(jié)果顯示7株菌對泰樂菌素和替米考星的敏感性較差，與本研究結(jié)果有點出入，推測原因可能是來自不同地區(qū)的菌株敏感性不同，但是該研究也能說明替米考星出現(xiàn)了一定的耐藥MS菌株；石曉磊等^[64]測定了3株MS對各種抗菌藥物的MIC值，結(jié)果也顯示大環(huán)內(nèi)酯類和截短側(cè)耳素類藥物最為敏感。

而對于恩諾沙星，本研究由于數(shù)據(jù)量不充足，暫時還無法建立MS對該藥的ECOFF；但是從恩諾沙星近5年的MIC數(shù)據(jù)分布上觀察也能發(fā)現(xiàn)MIC數(shù)值偏大；2006年，Dufour-Gesbert等^[65]測定了36株MS對恩諾沙星的MIC，結(jié)果顯示，MIC范圍為0.25～1μg·mL^-1；2013年，Lysnyansky等^[55]測定了73株MS對恩諾沙星的MIC，結(jié)果顯示MIC范圍為0.03～16μg·mL^-1，MIC₅₀和MIC₉₀分別為2μg·mL^-1和8μg·mL^-1；該兩篇報道都說明了近5年恩諾沙星的MIC明顯增大，因而推測近年來恩諾沙星已出現(xiàn)耐藥的情況?？傊x擇治療MS感染的合適藥物是取得良好的治療效果和預防耐藥性產(chǎn)生的前提，綜合本研究結(jié)果和對比前人結(jié)果，目前建議主要選擇大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、截短側(cè)耳素類和林可酰胺類藥物用來防治雞滑液囊支原體，而對于氟喹諾酮類藥物，推測目前已產(chǎn)生耐藥性，提示臨床上需要謹慎使用該類藥并采取一定措施保護其敏感性，以防止治療失敗的產(chǎn)生。

4 結(jié) 論

本研究參考CLSI和EUCAST制定ECOFF的方法，通過收集整理近5年研究的MIC數(shù)據(jù)，應用肉眼觀察法、ECOFFinder軟件和NRI方法綜合分析，從而制定出MS對泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素、多西環(huán)素、土霉素、金霉素、泰妙菌素、林可霉素、氟苯尼考和大觀霉素的ECOFF值分別為1、0.5、0.5、2、4、2、2、2、8和4μg·mL^-1，并且計算出相應的耐藥率。本課題提供了區(qū)分野生型菌株和非野生型菌株的方法，有利于耐藥性監(jiān)測工作的開展，為今后敏感性折點的建立提供一定的數(shù)據(jù)基礎和科學依據(jù)。但是本研究中獲得的ECOFFs不應視為官方解釋標準，今后仍需收集更多的數(shù)據(jù)來不斷更新ECOFFs，從而與時俱進地指導臨床合理用藥。

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（編輯 孟 培編輯）