阿霉素處理后對犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp lncRNAs差異表達(dá)的影響

摘 要：為了旨在探究阿霉素對犬乳腺腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs分子的影響，尋找犬乳腺腫瘤潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，本試驗(yàn)采用RNA-Seq技術(shù)對經(jīng)阿霉素處理的犬乳腺腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選差異表達(dá)lncRNAs，應(yīng)用GO富集和KEGG富集分析進(jìn)行基因功能和途徑注釋并驗(yàn)證其表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)阿霉素處理后的犬乳腺腫瘤細(xì)胞中共有277個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中，147個(gè)表達(dá)上調(diào)，130個(gè)表達(dá)下調(diào)，主要涉及細(xì)胞新陳代謝、轉(zhuǎn)錄程序失調(diào)、ECM受體相互作用以及細(xì)胞壞死性凋亡等生物學(xué)過程。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)隨機(jī)檢測3個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其表達(dá)趨勢與RNA-Seq一致，表明RNA-Seq測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，綜合分析阿霉素抗犬乳腺腫瘤細(xì)胞相關(guān)lncRNAs表達(dá)變化的整體特征，揭示其可能的調(diào)控新機(jī)制，為犬乳腺腫瘤的靶向治療和潛在生物標(biāo)志物的開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：lncRNA；犬；乳腺腫瘤細(xì)胞；阿霉素；RNA-Seq

中圖分類號(hào)：S857.26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2716-11

收稿日期：2023-10-10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（32302946）；福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT210085）；新瑞鵬寵物醫(yī)療集團(tuán)有限公司、深圳市瑞鵬公益基金會(huì)（KH210163A）

作者簡介：張 琰（2000-），女，福建龍巖人，碩士，主要從事lncRNA與犬腫瘤研究，E-mail：mszyzhangyan@foxmail.com

*通信作者：刁洪秀，主要從事小動(dòng)物腫瘤、獸醫(yī)麻醉與鎮(zhèn)痛研究，E-mail：diaohongxiu@yeah.net

The Effect of Doxorubicin Treatment on the Differential Expression of

lncRNAs in Canine Mammary Tumor CHMp Cell Line

ZHANGYan，WUMeijin，ZHOUJiahao，DIAOHongxiu^*

（College of Animal Sciences（College of Bee Science），F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，Key Laboratory of

Animal Pathogen Infection and Immunology of Fujian Province，F(xiàn)uzhou350002，China）

Abstract：To explore the effect of doxorubicin on lncRNAs in canine breast tumor cells and find potential biomarkers and therapeutic targets for canine mammary tumor，RNA-Seq technology was used to perform transcriptome sequencing analysis on canine breast tumor cells treated with doxorubicin，and differentially expressed lncRNAs were screened.GO enrichment and KEGG enrichment analysis were used to annotate gene functions and pathways and verify their expression.The results showed that there were277differentially expressed lncRNAs in canine breast tumor cells after doxorubicin treatment，of which147were up-regulated and130were down-regulated，mainly involving biological processes such as cell metabolism，transcriptional program disorder，ECM receptor interaction and cell necroptosis.Three differentially expressed lncRNAs were randomly detected by real-time quantitative PCR，and their expression trends were consistent with RNA-Seq，indicating the accuracy of the RNA-Seq sequencing results.Based on transcriptomics technology，this study comprehensively analyzed the overall characteristics of the expression changes of lncRNAs related to doxorubicin against canine breast tumor cells，revealed its possible new regulatory mechanisms，and provided areference for the targeted therapy of canine mammary tumor and the development and utilization of potential biomarkers.

Key words：lncRNA; canine; mammary tumor cells; doxorubicin; RNA-Seq

*Corresponding author：DIAO Hongxiu，E-mail：diaohongxiu@yeah.net

乳腺癌是人與犬高發(fā)的重要腫瘤性疾病，2020年，人乳腺癌超越肺癌成為全球癌癥發(fā)生率最高的癌種，且呈現(xiàn)年輕化趨勢^[1]。犬乳腺腫瘤（canine mammary tumor，CMT）是獸醫(yī)臨床最常見的腫瘤之一，其發(fā)生率可占全部腫瘤性疾病50%～70%^[2]，且超過50%的腫瘤會(huì)向局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移^[3]，而癌癥死亡超過90%是因轉(zhuǎn)移引起^[4]，因此犬乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床急需解決的重要性疾病。此外，越來越多研究證實(shí)，自發(fā)性犬乳腺腫瘤可作為人乳腺癌研究的理想模型^[3]，能夠更快地完成抗癌藥物在不同臨床分期的測試，有助于抗癌藥物的研發(fā)。因此，深入研究犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展與治療不僅在獸醫(yī)臨床中具有重要意義，對人乳腺腫瘤治療方案的拓展也具有重要借鑒意義。

阿霉素（doxorubicin，DOX）是乳腺癌治療一線化療藥物，其可直接插入DNA堿基中，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，影響DNA合成，同時(shí)促進(jìn)自由基形成，最終激活caspases途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡^[5]，但其與長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的關(guān)系尚不清楚。lncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，曾一度被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”。隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，lncRNA能與DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，在基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、RNA代謝、翻譯和翻譯后修飾等多個(gè)層面參與機(jī)體的生命活動(dòng)調(diào)節(jié)。更重要的是，lncRNA在多種疾病發(fā)生發(fā)展中被賦予重要的調(diào)節(jié)功能，其有望成為疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究證實(shí)lncRNA參與腫瘤細(xì)胞增殖、代謝以及腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)^[6]。在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA IUR1能夠促進(jìn)Abl介導(dǎo)的小鼠原代骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)化與白血病的形成，進(jìn)一步對其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)lncRNA IUR1通過負(fù)向調(diào)控STAT5介導(dǎo)GATA3的表達(dá)發(fā)揮抗癌作用^[7]。此外，在Groff等^[8]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA p21基因位點(diǎn)存在多個(gè)啟動(dòng)增強(qiáng)子，可通過順式作用周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）參與細(xì)胞周期的調(diào)控。這些研究為lncRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

本研究以犬乳腺腫瘤CHMp細(xì)胞系為模型，采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Sequence，RNA-Seq）和分析技術(shù)，篩選出阿霉素調(diào)節(jié)犬乳腺腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)的lncRNAs，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究阿霉素抗腫瘤新的潛在機(jī)制，為犬乳腺腫瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp，由日本東京大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科教研室饋贈(zèng)。阿霉素購自美國APExBIO公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素溶液均購自美國Gibco公司，CCK8試劑盒購自日本東仁化學(xué)科技有限公司，RNA提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有效有限公司。

1.2 阿霉素對CHMp細(xì)胞活力的影響

將對數(shù)生長期的CHMp細(xì)胞按照2000·孔^-1接種于96孔細(xì)胞板，37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度0.11、0.33、1.00和3.00μg·mL^-1的阿霉素，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，48h后每孔加入CCK8試劑10μL，37℃孵育1h左右，450nm處測定吸光度（OD值），細(xì)胞存活率（%）=（OD試驗(yàn)孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%，利用Graphpad Prism8.0計(jì)算IC₅₀。

1.3 阿霉素處理后的CHMp細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分組及RNA提取

對數(shù)生長期CHMp細(xì)胞按照5×10⁶·孔^-1接種于6孔細(xì)胞板，37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，參照“1.2”試驗(yàn)方法中阿霉素的IC₅₀處理細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，并根據(jù)RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，使用NanoDrop^TM2000對RNA樣品進(jìn)行濃度測定，A_260nm/A_280nm在1.9～2.1之間的RNA樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 阿霉素處理后的CHMp細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及分析

轉(zhuǎn)錄組文庫的制備和測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，應(yīng)用二代高通量測序平臺(tái)（IlluminaHiSeq）進(jìn)行樣本的測序，并將其以fastq格式儲(chǔ)存起來作為raw data樣本的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行測序相關(guān)質(zhì)量評估，包括堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計(jì)、堿基錯(cuò)誤率分布統(tǒng)計(jì)、堿基含量分布統(tǒng)計(jì)，使用SeqPrep軟件和Sickle進(jìn)行指控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，從而獲得高質(zhì)量的clean data，應(yīng)用TopHat2軟件和HISAT2將clean data與犬基因組（Canis familiaris）進(jìn)行匹配比對，獲得mapped data（reads）。使用StringTie或Cufflinks軟件對mapped reads進(jìn)行拼接，并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較，發(fā)掘新的轉(zhuǎn)錄本。

1.5 阿霉素處理后的CHMp細(xì)胞lncRNA的鑒定及表達(dá)量分析

從NONCODE、GreeNC、Ensembl、NCBI數(shù)據(jù)庫下載已經(jīng)報(bào)道的lncRNA的序列，基于這些數(shù)據(jù)庫進(jìn)行已知lncRNA的鑒定。同時(shí)，篩選新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測結(jié)果中class code分類信息為‘x’‘i’‘j’‘u’‘o’類型的轉(zhuǎn)錄本，在此基礎(chǔ)上，選擇長度≥200bp，Exon個(gè)數(shù)≥2，ORF長度≤300bp的轉(zhuǎn)錄本作為初步篩選的候選lncRNA。然后利用CPC分析、CNCI分析、CPAT分析、Pfam蛋白結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測編碼能力，最終選取這四個(gè)軟件的交集為最終的lncRNA數(shù)據(jù)集。

使用TPM定量估計(jì)基因表達(dá)值，運(yùn)用DEseq2軟件進(jìn)行不同組別之間差異表達(dá)基因分析，以|log₂FC|≥1和P adjust＜0.05為篩選條件，統(tǒng)計(jì)表達(dá)具有顯著差異性的基因。

1.6 阿霉素處理后的CHMp細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能分析

采用軟件Goatools對基因集中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO富集分析，使用方法為Fisher精確檢驗(yàn)，采用BH方法對P值進(jìn)行校正，當(dāng)經(jīng)過校正的P值（FDR）＜0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況。通路富集分析采用KEGG獲得功能注釋，同樣采用Fisher精確檢驗(yàn)，確定差異表達(dá)基因顯著性富集的通路。

1.7 阿霉素處理后的CHMp細(xì)胞差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

為驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇3個(gè)lncRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。采用1μg·mL^-1阿霉素處理CHMp細(xì)胞24和48h后，利用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，每個(gè)樣品進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。引物信息見表1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以“x-±s”表示，采用SPSS18進(jìn)行單因素方差分析，其中，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 阿霉素對CHMp細(xì)胞增殖效果的影響

用不同濃度的阿霉素處理CHMp細(xì)胞48h后，細(xì)胞存活率如圖1所示，阿霉素抑制CHMp細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。CHMp細(xì)胞在48h的IC₅₀為1.01μg·mL^-1。為進(jìn)一步探究lncRNA在阿霉素抗犬乳腺腫瘤中的作用及機(jī)制，選擇1μg·mL^-1阿霉素處理CHMp細(xì)胞，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選關(guān)鍵的lncRNAs。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

利用Illumina novaseq6000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到130.74Gb clean data，各樣品clean data均達(dá)到20.62Gb以上，Q30堿基百分比在93.85%及以上，詳見表2。各樣本與參考基因組序列比對效率在93.49%～94.5%，匹配率高，表明測序質(zhì)量可靠。

2.3 樣本相關(guān)性分析

對樣本生物重復(fù)性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，各組生物學(xué)重復(fù)間相關(guān)系數(shù)均在0.99以上（圖2），表明組內(nèi)一致性較高，生物學(xué)重復(fù)性較好。PCA分析發(fā)現(xiàn)，樣本組間區(qū)分明顯（圖3），組間重復(fù)性良好。

2.4 阿霉素處理后CHMp細(xì)胞差異表達(dá)lncRNA的篩選

經(jīng)RNA-Seq分析，在對照組和試驗(yàn)組中分別檢測到795和917個(gè)lncRNAs，其中，共表達(dá)lncRNAs有719個(gè)。將|log₂FC|≥1和P adjust＜0.05定義為差異顯著，共檢測到277個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中，147個(gè)表達(dá)上調(diào)，130個(gè)表達(dá)下調(diào)，差異表達(dá)lncRNAs火山圖見圖4。為了更好反映對照組與試驗(yàn)組差異lncRNAs的表達(dá)情況，對不同表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類。由圖5可見，經(jīng)阿霉素處理后細(xì)胞內(nèi)lncRNAs的差異變化情況，不同樣品組相互之間的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異顯著，彼此之間可以較好區(qū)分。

2.5 阿霉素處理后CHMp細(xì)胞差異表達(dá)lncRNA的靶基因功能分析

對277個(gè)差異表達(dá)lncRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測與GO功能注釋，差異表達(dá)lncRNAs的靶基因富集到36條GO條目中，細(xì)胞組分（cellular component）13條，分子功能（molecular function）7條，生物過程（biological process）16條。主要富集在細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞組分組成或再生、綁定和細(xì)胞器等方面，顯示豐度前20見圖6。

對差異表達(dá)lncRNAs靶基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，其主要富集在全身性紅斑狼瘡、酒精中毒、病毒的致癌作用、細(xì)胞壞死性凋亡、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和ECM受體相互作用等生物過程，詳見圖7。

2.6 差異表達(dá)lncRNA的驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇3個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，基因MSTRG.21 292.1、MSTRG.21 304.2、MSTRG.21 335.2在經(jīng)阿霉素處理后犬乳腺腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平極顯著下調(diào)（Plt;0.001），與RNA-Seq的檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步表明本次RNA-Seq測序結(jié)果的可靠性。

3 討 論

犬乳腺腫瘤是一種高度異質(zhì)性腫瘤，嚴(yán)重威脅犬生命和健康。隨著犬生存期不斷延長，越來越多中老年犬患有乳腺腫瘤，且惡性率高達(dá)51.59%^[9]。

乳腺腫瘤不僅是雌性中老年犬中最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是全球女性最常見的癌癥之一，是導(dǎo)致死亡的第二大原因^[10]。值得注意的是，犬乳腺癌在流行病學(xué)、組織學(xué)、遺傳學(xué)及病理學(xué)上與人類乳腺癌十分相似，可作為人類乳腺癌研究的理想動(dòng)物模型^[11]。

阿霉素又稱多柔比星，具有廣泛的抗癌活性。自20世紀(jì)70年代以來，一直被認(rèn)為是治療乳腺癌最有效的化療藥物之一，現(xiàn)已成為臨床化療首選藥物之一^[12]。在轉(zhuǎn)移性犬乳腺腫瘤中，一定濃度范圍（0.1～100.0μmol·L^-1）的阿霉素可以有效抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞體外增殖^[13]，使細(xì)胞周期阻滯于S期，并引起細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞活力^[14]?；熕幬锫?lián)合應(yīng)用是癌癥治療中最有效手段之一，Bakirel等^[15]研究發(fā)現(xiàn)德拉昔布（deracoxib，DER）能夠協(xié)同阿霉素發(fā)揮抗腫瘤活性，降低阿霉素在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中IC₅₀，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并促進(jìn)凋亡。與之相似，阿霉素與犬羊膜干細(xì)胞（canine amniotic membrane stem cells，AMCs）聯(lián)合使用也能增強(qiáng)抗腫瘤活性，有望成為犬乳腺癌治療有效方法之一^[16]。而與分子碘（I₂）結(jié)合后，不僅增加了阿霉素抗腫瘤作用，還減弱了阿霉素引起的正常組織氧化損傷，有效改善犬乳腺癌治療效果，提高了犬生存率和無復(fù)發(fā)生存率^[17]。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，lncRNA成為一種新型受到重視的非編碼RNA，其表達(dá)和失調(diào)比蛋白質(zhì)編碼基因更具有癌癥特異性。最新研究表明lncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥相關(guān)，并在乳腺癌中發(fā)揮重要生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、黏附、遷移、侵襲、凋亡和血管生成^[18-19]。乳腺癌中具有大量差異表達(dá)的lncRNA分子，且多種lncRNA已被證實(shí)具有致癌作用，如H19、HOTAIR、MALAT-1、CCAT1、CCAT2和UCA1等，相反GAS5、EPB41L4A-AS2、BC040587和FGF14-AS2等具有抑癌作用^[20]。郭晨明等^[21]發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST在miR-20a-5p/HMGA2軸上抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為乳腺癌的靶向治療提供了新靶點(diǎn)。lncRNA FAR2P1在乳腺癌中高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖遷移并抑制其凋亡^[22]，而lncRNA LOXL1-AS1則可以通過miR-28-5p/IGF-1軸調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與凋亡，具有促癌功能^[23]，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了lncRNA在人類乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來，lncRNA在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域同樣也備受矚目，近期發(fā)現(xiàn)了一條新型lncRNA42060可作為一個(gè)腫瘤促進(jìn)因子，通過miR-204-5p靶向SOX4調(diào)控犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、克隆和微乳球形成能力，可作為犬乳腺癌治療潛在生物標(biāo)志物^[24]。相似的是，lncRNA34977通過調(diào)節(jié)miR-8881/ELAVL4表達(dá)，促進(jìn)犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡，而lncRNA40589作用則相反，其抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖和遷移^[25-26]。由此可見，lncRNA在癌癥中的異常表達(dá)可以通過直接或間接作用參與癌癥的發(fā)生、進(jìn)展，有望成為癌癥診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

因此，本研究利用阿霉素處理的犬乳腺腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行高通量測序分析，檢測lncRNA表達(dá)譜變化，篩選出277個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，其中，147個(gè)表達(dá)上調(diào)，130個(gè)表達(dá)下調(diào)，通過GO功能注釋和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些lncRNA分子在細(xì)胞新陳代謝、轉(zhuǎn)錄程序失調(diào)、ECM受體相互作用以及細(xì)胞壞死性凋亡通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ECM是一種阻止腫瘤細(xì)胞遷移至新組織的物理屏障，由原纖維或非原纖維膠原、彈性蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等組成，這些蛋白結(jié)構(gòu)的改變可影響腫瘤細(xì)胞黏附、腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移^[27]。研究發(fā)現(xiàn)，犬乳腺腫瘤中ECM的結(jié)構(gòu)和成分均會(huì)發(fā)生變化，造成基底膜降解，IV型膠原和層粘連蛋白減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和組織功能喪失，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散^[28]。另一方面，ECM硬化可以誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，通過下調(diào)miR-203表達(dá)和激活ZNF217介導(dǎo)的AKT通路來刺激乳腺上皮細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，間接促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖^[29-30]。但lncRNA與ECM的關(guān)系尚不清楚，可能成為犬乳腺腫瘤研究和治療的新方向。壞死性凋亡在腫瘤中的作用存在爭議性，有研究認(rèn)為壞死性凋亡是惡性乳腺腫瘤主要的程序性細(xì)胞死亡途徑，其可通過TNF-α、干擾素、Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）、病毒及各種物理和化學(xué)應(yīng)激源等刺激觸發(fā)^[31]。在MDA-MB-231、MCF-7等乳腺癌細(xì)胞系中，參與壞死性凋亡的調(diào)節(jié)因子RIPK1、RIPK3與MLKL高度表達(dá)^[32]。但也有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤介導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡后，細(xì)胞表面蛋白脫落可以抑制T細(xì)胞的抗腫瘤活性而促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移^[33]。Karsch-Bluman等^[34]發(fā)現(xiàn)壞死性惡性乳腺癌細(xì)胞裂解后將誘發(fā)血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并促進(jìn)遷移、侵襲和細(xì)胞間相互作用。與壞死性凋亡相似，轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程在惡性細(xì)胞中也可能失調(diào)或紊亂，致癌或腫瘤抑制轉(zhuǎn)錄因子以及細(xì)胞調(diào)節(jié)因子與腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)因子的失調(diào)共同影響多個(gè)生物過程，如腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變、腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。與癌癥相關(guān)基因的改變可以影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的蛋白質(zhì)，包括反式因子（轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)蛋白、輔因子、染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子和染色體結(jié)構(gòu)蛋白）及順式元件（增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和絕緣體）^[35]。轉(zhuǎn)錄程序的失調(diào)將導(dǎo)致癌細(xì)胞高度依賴基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，這可能與早期腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞生長和存活有關(guān)。作為一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子FOXM1能直接或間接激活靶基因的表達(dá)來維持病變特征，其表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展^[36]。ELF5轉(zhuǎn)錄因子通常在乳腺腫瘤中失調(diào)，并被證明是通過轉(zhuǎn)錄抑制SNAI2的表達(dá)抑制癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化^[37]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，阿霉素在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中的抗腫瘤活性與上述一種或多種途徑密切相關(guān)，差異表達(dá)的lncRNA可能影響著轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，同時(shí)可能通過ECM蛋白相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡，但其具體的作用及機(jī)制尚需更多研究來證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)探索了經(jīng)阿霉素處理的犬乳腺腫瘤細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜，篩選出277個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些lncRNAs與細(xì)胞進(jìn)程、壞死性凋亡、ECM蛋白相互作用及癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)密切聯(lián)系，提示阿霉素潛在的抗腫瘤新機(jī)制，為犬乳腺腫瘤的診斷和治療提供潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

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（編輯 白永平）