屢配不孕母牛FOXP3、FSHR、FMR1基因多態(tài)性與生殖激素相關(guān)性分析

摘 要：旨在研究叉頭框蛋白P3基因（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）、促卵泡激素受體基因（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）、智力低下1基因（fragile Xmental retardation1，F(xiàn)MR1）的多態(tài)性，并探討了基因多態(tài)性對(duì)母牛屢配不孕以及母牛激素水平的影響。通過(guò)PCR方法擴(kuò)增基因突變位點(diǎn)的序列，對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序峰圖分析，統(tǒng)計(jì)三種基因的基因型。分析三種基因突變的組間差異。使用ELISA法檢測(cè)兩組雌激素（estrogen，E）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、催乳素（prolactin，PRL）、睪酮素（testosterone，T）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）激素濃度。并將基因多態(tài)性與激素水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。FOXP3基因檢測(cè)出3種基因型：AA、AG和GG型；FSHR基因檢測(cè)出3種基因型：AA、AC和CC型；FMR1基因5′UTR端302bp處檢測(cè)到T堿基插入?？ǚ竭m應(yīng)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3基因g.92，377，635Agt;G位點(diǎn)、FSHR基因g.31，450，279Agt;C位點(diǎn)均低于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（Plt;0.05）。關(guān)聯(lián)性分析表明，F(xiàn)OXP3基因G等位基因、FSHR基因C等位基因與母牛屢配不孕顯著正相關(guān)性。屢配不孕組E、FSH、PRL、T激素與健康母牛組差異顯著（Plt;0.05）。FOXP3基因AA、GG基因型E激素濃度與AG基因型差異顯著（Plt;0.05）；FSHR基因AA、AC基因型E激素濃度與CC基因型差異顯著（Plt;0.05）。FOXP3基因、FSHR基因在西門塔爾牛、褐牛及安格斯牛群體中具有多態(tài)性，這說(shuō)明基因可能是影響母牛屢配不孕的潛在遺傳因素。其中，F(xiàn)OXP3基因G等位基因在健康組與屢配不孕組中差異顯著（Plt;0.05），F(xiàn)SHR基因C等位基因在健康組與屢配不孕組中差異顯著（Plt;0.05）。FOXP3基因的g.92，377，635Agt;G位點(diǎn)G等位基因與母?；紝遗洳辉屑膊〕曙@著正相關(guān)（Plt;0.05，r=0.16），F(xiàn)SHR基因的g.31，450，279Agt;C位點(diǎn)C等位基因與母牛屢配不孕具有顯著正相關(guān)性（Plt;0.05，r=0.14）。FOXP3基因以及FSHR基因的多態(tài)性位點(diǎn)可能作為母牛屢配不孕的標(biāo)志性識(shí)別位點(diǎn)，可用于篩選屢配不孕母牛的潛在候選遺傳標(biāo)記，這需要進(jìn)一步的證明。FOXP3基因G等位基因與E濃度呈弱正相關(guān)（Plt;0.05，r=0.16），F(xiàn)MR1基因T堿基的插入與E濃度呈弱正相關(guān)（Plt;0.05，r=0.187）。然而FOXP3基因、FSHR基因的變異如何調(diào)控母牛繁殖能力還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

關(guān)鍵詞：牛；屢配不孕；基因多態(tài)性；激素；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S857.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2727-14

收稿日期：2023-08-10

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化示范專項(xiàng)--鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)發(fā)展科技行動(dòng)項(xiàng)目（2022NC098）

作者簡(jiǎn)介：王選藝（1998-），女，新疆五家渠人，碩士生，主要從事動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖疾病研究，E-mail：1020877416@qq.com；Tel：13109015778

*通信作者：孫亞偉，主要從事動(dòng)物形態(tài)學(xué)及家畜肌肉生長(zhǎng)發(fā)育研究，E-mail：sunyawei2008@163.com

Correlation Analysis of FOXP3，F(xiàn)SHR，F(xiàn)MR1Gene Polymorphisms and

Reproductive Hormones in Infertile Cows

WANGXuanyi，SUNYawei^*，LONGYuwei，WANGLiying，ZHOUYuxin，

LINa，MAXuelian，ZHAOHongqiong，YAOGang

（College of Animal Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

Abstract：The polymorphisms of forkhead box protein P3（FOXP3），follicle stimulating hormone receptor（FSHR）and fragile Xmental retardation1（FMR1）were studied，and the effects of gene polymorphisms on infertility and hormone levels in cows were discussed.（Method）The sequence of the gene mutation site was amplified by PCR，and the PCR results were identified by enzyme digestion and sequencing peak analysis，and the genotypes of the three genes were counted.The intergroup differences in the mutations of the three genes were analyzed.The concentrations of estrogen（E），follicle-stimulating hormone（FSH），prolactin（PRL），testosterone（T）and luteinizing hormone（LH）in the two groups were detected by ELISA.The correlation between gene polymorphism and hormone level was analyzed.Three genotypes of FOXP3gene were detected：AA，AG and GG; three genotypes of FSHR gene were detected：AA，AC and CC; T base insertion was detected at302bp of5′UTR of FMR1gene.The results of chi-square adaptability test showed that the92377635Agt;G loci of FOXP3gene and the31450279Agt;C loci of FSHR gene were lower than Hardy-Weinberg equilibrium（Plt;0.05）.Correlation analysis showed that FOXP3gene Gallele and FSHR gene Callele were significantly positively correlated with repeated infertility in cows.There were significant differences in E，F(xiàn)SH，PRL and Thormones between the infertile group and the healthy mother group（Plt;0.05）.The Ehormone concentration of FOXP3AA and GG genotypes was significantly different from that of AG genotype（Plt;0.05）.FSHR gene AA，AC genotype Ehormone concentration was significantly different from CC genotype（Plt;0.05）.（concentration）was significantly different from AG genotype（Plt;0.05）; FSHR gene31450279Agt;C locus AA，AC genotype Ehormone content（concentration）FOXP3gene and FSHR gene are polymorphic in Simmental，Brown and Angus populations，which indicates that the gene may be apotential genetic factor affecting the infertility of cows.The Gallele of FOXP3gene was significantly different between the healthy group and the multiple infertility group（Plt;0.05），and the Callele of FSHR gene was significantly different between the healthy group and the multiple infertility group（Plt;0.05）.The Gallele of g.92377635Agt;G locus of FOXP3gene was significantly positively correlated with multiple infertility in cows（the Callele of PC locus was significantly positively correlated with multiple infertility in cows（Plt;0.05，r=0.14）.The polymorphism sites of FOXP3gene and FSHR gene may be used as the marker identification sites of repeated mating infertility in cows，which can be used to screen the potential candidate genetic markers of repeated mating infertility cows，which needs further proof.The Gallele of FOXP3gene was weakly positively correlated with Econcentration（Plt;0.05，r=0.16），and the Tbase insertion of FMR1gene was weakly positively correlated with Econcentration（Plt;0.05，r=0.187）.However，how the variation of FOXP3gene and FSHR gene regulates the reproductive ability of cows needs further study.

Key words：cattle; infertility cows; gene polymorphism; hormone; relevance analysis

*Corresponding author：SUN Yawei，E-mail：sunyawei2008@163.com

繁殖母牛的屢配不孕疾病嚴(yán)重?fù)p害牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)報(bào)道，引起繁育率降低的原因中，屢配不孕占53.06^[1]，在導(dǎo)致牛淘汰的疾病中，屢次配種不孕的比例達(dá)到了40%，因?qū)遗洳辉性斐傻慕?jīng)濟(jì)損失占總損失的57.6%^[2]。屢配不孕是指發(fā)情周期及發(fā)情期正常，臨床檢查沒(méi)有明顯癥狀，在連續(xù)3個(gè)發(fā)情周期配種3次及以上不受孕即為屢配不孕^[3]。動(dòng)情行為、激素模式和卵巢動(dòng)力學(xué)之間微妙的相互作用還有基因的表達(dá)都可能影響母牛屢配不孕。這些因素最終決定交配或人工授精的結(jié)果。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分基因的功能和表達(dá)可能與牛的繁殖性能相關(guān)^[4]。過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)FOXP3基因^[5]、FSHR基因^[6]、FMR1基因^[7]的變異很大概率上會(huì)導(dǎo)致母牛屢配不孕。FMR1基因被發(fā)現(xiàn)當(dāng)其5′端非編碼區(qū)發(fā)生突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生屢配不孕^[5]。FOXP3基因上游區(qū)域的SNP可能影響FOXP3啟動(dòng)子的活性^[6]。有學(xué)者研究FSHR基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)其10號(hào)外顯子區(qū)域有一個(gè)SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)有3個(gè)基因型：CG基因型妊娠率為66%，GG基因型妊娠率為58%，CC基因型妊娠率為64%^[7]。然而，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性對(duì)不同品種間妊娠率的影響尚未建立^[8]?；蚺c屢配不孕之間的關(guān)系逐漸引起了注意。然而，想要從遺傳角度上解決問(wèn)題應(yīng)該關(guān)注到屢配不孕與染色體基因異常的關(guān)系^[9]。

母牛在發(fā)情期間，雌激素濃度上升，子宮內(nèi)膜增厚，為受精卵提供營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)環(huán)境^[10-11]。如果母牛的激素水平異常，可能會(huì)影響卵泡的發(fā)育和排卵，從而導(dǎo)致配種不成功^[12]。如果繁殖母牛患有卵巢囊腫^[13-14]、子宮內(nèi)膜炎^[15-17]等疾病，可能導(dǎo)致屢配不孕。屢配不孕治療的方法常用激素來(lái)治療，在屢配不孕治療手段中激素刺激是較為常用的，對(duì)屢配不孕母牛使用激素刺激可使其卵巢的活動(dòng)恢復(fù)^[18]，提高母牛繁殖力^[19]。因此，母牛屢配不孕可能與激素濃度相關(guān)。及時(shí)關(guān)注繁殖母牛激素水平的變化，可以提高母牛的繁殖能力。

許多基因參與編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和卵巢發(fā)育的蛋白質(zhì)^[18]。一些基因變異可能會(huì)影響母牛的生殖器官發(fā)育或功能，從而影響母牛繁殖能力^[19]。在母牛生殖器官發(fā)育或功能被影響時(shí)其激素水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。所以母牛屢配不孕的基因變異可能與其部分激素水平變化有相關(guān)性。

本試驗(yàn)以不同品種母牛為研究對(duì)象，探究不利于母牛繁殖的基因多態(tài)性位點(diǎn)，從而篩選出存在屢配不孕風(fēng)險(xiǎn)的母牛。并用ELISA法檢測(cè)雌激素（estrogen，E）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、催乳素（prolactin，PRL）、睪酮素（testosterone，T）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）在血清中濃度。探究母牛屢配不孕與其激素水平的相關(guān)性，以及導(dǎo)致母牛屢配不孕的基因變異與生殖激素水平變化的相關(guān)性。為提高母牛繁殖能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為在新疆不同牛場(chǎng)采集的褐牛、西門塔爾牛、安格斯牛，按其配種與受孕情況分為屢配不孕組和健康對(duì)照組，屢配不孕組母牛均為經(jīng)過(guò)牛場(chǎng)具有豐富經(jīng)驗(yàn)的獸醫(yī)檢查篩選過(guò)的無(wú)解剖學(xué)異常的；沒(méi)有感染的；連續(xù)3個(gè)發(fā)情周期及其以上配種但沒(méi)有受孕的母牛。健康組為同一時(shí)期，同一營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境下的配種1或2次能夠正常受孕的母牛。在健康組母牛產(chǎn)后對(duì)兩組母牛進(jìn)行同期發(fā)情處理，每次注射氯前列醇鈉注射液3mL·頭^-1（0.1mg·mL^-1），注射3次，注射后第（13±3）天內(nèi)使用EDTA抗凝管采集兩組母牛新鮮血液及血清并立即放入-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)動(dòng)物中褐牛共63頭，其中，屢配不孕組31頭，健康組32頭；西門塔爾牛共54頭，其中，屢配不孕組35頭，健康19頭；安格斯牛共50頭，其中，屢配不孕組29頭，健康21頭。共采集167份樣本。

1.1.2 主要試劑及儀器

紅細(xì)胞裂解液的制備：碳酸氫鉀（KHCO₃）1.0g；氯化氨（NH₄Cl）8.3g；EDTA-Na₂0.037g，加雙蒸水定容至1000mL。白細(xì)胞裂解液的制備：0.2422g Tris溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)其pH為8.0，然后加入0.149g EDTA和0.16g SDS。10%SDS的制備：稱取10g SDS融于60mL高壓滅菌蒸餾水中，混合液置于水浴鍋中65 ℃加熱助融10min，定容至100mL。蛋白酶K的制備：蛋白酶K100mg；Tris（10mmol·L^-1）10mL在冰盒上混勻后保存在-20 ℃。酚氯仿異戊醇混合液：25mL飽和酚試劑；24mL三氯甲烷；1mL異戊醇混勻。酚氯仿混合液：25mL飽和酚試劑；25mL三氯甲烷混勻；高GC含量PCR擴(kuò)增試劑盒（B639283-0001）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Maker A（25～500bp）（B600303）購(gòu)自上海生物技術(shù)有限公司提供。

牛促卵泡素（FSH）試劑盒（貨號(hào)：JYM0055Bo；生產(chǎn)批次GR20230210），牛催乳素（PRL）試劑盒（貨號(hào)：JYM0095Bo；生產(chǎn)批次：GR20230210），牛睪酮（T）試劑盒（貨號(hào)：JYM0282Bo；生產(chǎn)批次：GR20230210），牛促黃體激素（LH）試劑盒（貨號(hào)：JYM0054Bo；生產(chǎn)批次：GR20230210），牛雌激素（E）試劑盒（貨號(hào)：JYM0045Bo；生產(chǎn)批次：GR20230210）均購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司。

主要儀器：Eppendorf離心機(jī)、NanoDrop2000微量分光光度計(jì)、Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)、ST-360KHB酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的酚氯仿法提取DNA^[20]，并使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA的濃度與光密度比值（OD_260nm/OD_280nm），提取后使用0.7%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA特異性與完整性。

1.2.2 位點(diǎn)信息及引物合成

參考NCBI提供的牛（Bos taurus；登錄號(hào)：NC_037 357.1）FOXP3、FSHR和FMR1基因序列號(hào)，根據(jù)過(guò)往研究結(jié)果確定FOXP3基因與屢配不孕母牛相關(guān)的SNP位點(diǎn)存在于5′UTR區(qū)域上游（NC_037 357.1：g.92，377，635Agt;G，rs135720414）、FSHR基因10號(hào)外顯子區(qū)域、FMR1基因變異區(qū)在5′UTR區(qū)域。利用軟件Prime5設(shè)計(jì)特異性PCR引物（表1）擴(kuò)增FOXP3基因g.92，377，635Agt;G、FSHR基因10號(hào)外顯子、FMR1基因5′UTR端。引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 基因分型

FOXP3基因、FMR1基因擴(kuò)增DNA片段由上海生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用Snpgene軟件進(jìn)行基因型分析。FSHR基因利用AulⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，將酶切產(chǎn)物在3.5%的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)酶切結(jié)果，通過(guò)酶切結(jié)果結(jié)合測(cè)序峰圖分析其基因型。

1.2.4 激素水平檢測(cè)

使用ELISA法檢測(cè)健康組與屢配不孕組的E、FSH、PRL、T和LH濃度^[21]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Excle2019計(jì)算基因SNP位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率、純和度（homozygosity，Ho）、雜合度（heterozygosity，He）、有效等位基因數(shù)（effectively allele number，Ne）。通過(guò)χ²檢驗(yàn)FOXP3基因在群體中是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。通過(guò)多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）檢測(cè)基因的變異程度，其中，PIClt;0.05表示為低度多態(tài)性；0.05lt;PIClt;0.50表示為中度多態(tài)性；PICgt;0.50表示為高度多態(tài)性。利用SPSS25.0軟件對(duì)健康組和屢配不孕組母?；蛐瓦M(jìn)行秩和檢驗(yàn)。激素結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±s_x-）”表示，對(duì)健康組與屢配不孕牛組的各生殖激素濃度進(jìn)行差異分析。最后將基因變異情況與激素水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取

0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA帶型清晰可見(jiàn)，表明總DNA無(wú)降解（圖1）。提取的總DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定后260與280nm的吸光值之比均在1.75～2.00，表明提取的總DNA符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 FOXP3基因

2.2.1 FOXP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，引物擴(kuò)增片段為618bp左右，與預(yù)期片段大小相符，且無(wú)雜帶。

2.2.2 測(cè)序驗(yàn)證

測(cè)序結(jié)果經(jīng)snpgene軟件分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3基因在g.92，377，635Agt;G存在一處突變，測(cè)序峰圖可分為3種基因型：AA、AG、GG。峰圖如圖3。

2.2.3 基因位點(diǎn)分型及多態(tài)性分析

通過(guò)測(cè)序得到FOXP3基因有3種基因型分為AA、AG、GG型，詳見(jiàn)表2，χ²檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3基因g.92，377，635Agt;G位點(diǎn)在西門塔爾牛、褐牛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；安格斯牛群體偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。該基因多態(tài)信息含量為0.33，屬于中度多態(tài)；純和度、雜合度及有效等位基因數(shù)詳見(jiàn)表3。

2.2.4 不同品種健康組與屢配不孕組FOXP3基因型差異分析

圖4為不同品種健康組與屢配不孕組基因型頻率分析，其中，圖4a為安格斯牛，圖4c為西門塔爾牛，圖4d為褐牛，圖4b為總計(jì)。經(jīng)過(guò)SPSS及Graphpad軟件分析發(fā)現(xiàn)：總的來(lái)說(shuō)屢配不孕組FOXP3基因的G基因型頻率顯著高于健康組，如圖4a所示。各品種中：安格斯牛屢配不孕組FOXP3基因的G基因型頻率顯著高于健康組，如圖4d中所示。西門塔爾牛和褐牛未發(fā)現(xiàn)有差異。對(duì)FOXP3基因G等位基因與母牛屢配不孕情況進(jìn)行相關(guān)性分析得出G等位基因與母牛屢配不孕具有相關(guān)性，且G等位基因與母?；紝遗洳辉屑膊〕嗜跽嚓P(guān)（Plt;0.05，r=0.16）。

2.3 FSHR基因

2.3.1 FSHR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，產(chǎn)物大小為306bp，與預(yù)期片段大小相符，且無(wú)雜帶。

2.3.2 酶切分析

將酶切產(chǎn)物在3.5%的瓊脂糖凝膠中檢測(cè)酶切結(jié)果如圖6，可得到3種基因型：CC、CG、GG型。

2.3.3 測(cè)序驗(yàn)證

測(cè)序結(jié)果經(jīng)snpgene軟件分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因存在一處突變，通過(guò)測(cè)序峰圖可分為3種基因型：AA、AC、CC，如圖7所示。

2.3.4 基因位點(diǎn)分型及多態(tài)性分析

通過(guò)測(cè)序得到FSHR基因3個(gè)基因型AA、AC、CC（表4）。χ²檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)SHR基因突變位點(diǎn)在西門塔爾牛、褐牛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；安格斯牛群體偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。該基因多態(tài)信息含量為0.35，屬于中度多態(tài)；純和度、雜合度及有效等位基因數(shù)見(jiàn)表5。

2.3.5 不同品種健康組與屢配不孕組FSHR基因型差異分析

圖8為不同品種健康組與屢配不孕組母牛基因型頻率分析，總的來(lái)說(shuō)，屢配不孕組FSHR基因的C基因型頻率顯著高于健康組，如圖8a（圖8a為所有品種總計(jì)，Plt;0.05）所示。各品種中，安格斯牛（圖8b）屢配不孕組FSHR基因的C基因型頻率顯著高于健康組，且差異極顯著（Plt;0.01）如圖中所示。西門塔爾牛（圖8d）和褐牛（圖8c）未發(fā)現(xiàn)有差異。對(duì)FSHR基因C等位基因與母牛屢配不孕情況進(jìn)行相關(guān)性分析得出C等位基因與母牛屢配不孕具有相關(guān)性，且C等位基因與母?；紝遗洳辉屑膊〕嗜跽嚓P(guān)（Plt;0.05，r=0.14）。

2.4 FMR1基因

2.4.1 FMR1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示，產(chǎn)物大小為310bp，與預(yù)期片段大小相符，且無(wú)雜帶。

2.4.2 測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果經(jīng)snpgene軟件分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1基因存在一處T堿基插入，測(cè)序峰圖詳見(jiàn)圖10。

2.4.3 基因位點(diǎn)分型及多態(tài)性分析

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)FMR1基因健康組與屢配不孕組FMR1基因T堿基插入無(wú)差異，該基因多態(tài)信息含量為0.35，屬于中度多態(tài)；純和度、雜合度及有效等位基因數(shù)詳見(jiàn)表6。對(duì)FMR1基因T堿基的插入與母牛屢配不孕情況進(jìn)行相關(guān)性分析得出T堿基的插入與母牛屢配不孕不具有相關(guān)性（Pgt;0.05）。

2.5 激素檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 激素水平標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照E、FSH、PRL、T和LH的ELISA試劑盒說(shuō)明書繪制其激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖11。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，E（圖11A）、FSH（圖11B）、PRL（圖11C）、T（圖11D）和LH（圖11E）線性回歸曲線的相關(guān)系數(shù)分別是0.9976、0.9968、0.9973、0.9971和0.9940，均大于試劑盒所提供的相關(guān)系數(shù)（R²gt;0.92）。本次標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，可用于后續(xù)試驗(yàn)的計(jì)算。

2.5.2 兩組生殖激素濃度比較

如圖12可知，健康組E、FSH、PRL、T的濃度含量高于屢配不孕組，且健康組E和FSH激素濃度含量極顯著高于屢配不孕組（Plt;0.01）；健康組T和PRL激素濃度含量顯著高于屢配不孕組（Plt;0.05）；健康組LH激素濃度含量與屢配不孕組差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.6 FOXP3、FSHR、FMR1基因多態(tài)性與激素濃度關(guān)聯(lián)分析

已知FOXP3、FSHR、FMR1基因均檢測(cè)到了出變異情況。將各基因變異情況與激素水平變化進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。由表7可知，牛FOXP3基因g.92377635Agt;G位點(diǎn)AA、GG基因型E激素濃度與AG基因型差異顯著（Plt;0.05），其余激素含量各基因型間差異均不顯著（Pgt;0.05）。FSHR基因g.31450279Agt;C位點(diǎn)AA、AC基因型E激素濃度與CC基因型差異顯著（Plt;0.05），其余激素含量各基因型間差異均不顯著（Pgt;0.05），見(jiàn)表8。FMR1基因5′UTR端302bp處T堿基插入的基因型PRL激素濃度與正?；蛐筒町愶@著（Plt;0.05），其余激素在各基因型間差異均不顯著（Pgt;0.05），見(jiàn)表9。但相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)FOXP3基因g.92，377，635位點(diǎn)的突變與E濃度無(wú)相關(guān)性（P=0.347gt;0.05）

3 討 論

繁殖力是決定動(dòng)物生產(chǎn)效率的重要因素。高效的管理和整體生產(chǎn)對(duì)于良好的繁殖性能至關(guān)重要，然而，無(wú)論規(guī)模大小，牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)高低取決于每頭母牛都在合適的正常生理范圍內(nèi)和最佳的繁殖節(jié)律中^[22]。母牛屢配不孕是世界各地乳制品和牛肉行業(yè)主要關(guān)切的疾病之一，屢配不孕與遺傳、生理、環(huán)境和管理因素之間的相互作用有關(guān)^[6]。識(shí)別遺傳標(biāo)記和了解母牛生育遺傳機(jī)制將有助于選擇具有更好繁殖性能的母牛。

3.1 FOXP3基因

FOXP3基因的g.92，377，635Agt;G位點(diǎn)是最接近母牛屢配不孕的SNP位點(diǎn)^[23]。FOXP3是調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞的線性特異性轉(zhuǎn)錄因子^[24-25]。母體的Treg細(xì)胞在懷孕期間在血液和胎盤中積聚^[26]，切除母體的FOXP3細(xì)胞會(huì)觸發(fā)胎兒特異性效應(yīng)T細(xì)胞的激活，進(jìn)而導(dǎo)致妊娠丟失^[27]。FOXP3基因上游區(qū)域的SNP影響了FOXP3啟動(dòng)子的活性以及mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而降低母體Treg細(xì)胞的分化^[5，27]。因此，Treg細(xì)胞數(shù)量的減少會(huì)觸發(fā)胎兒特異性效應(yīng)器T細(xì)胞的激活，從而母牛導(dǎo)致屢配不孕。要闡明FOXP3在屢配不孕中的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究FOXP3mRNA在屢配不孕母牛中的表達(dá)水平和Treg細(xì)胞的數(shù)量^[26]。有學(xué)者使用RT-qPCR研究了滋養(yǎng)細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)譜，他們的結(jié)論是結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，并且在屢配不孕中減少^[5]?？傊^(guò)往研究均提示，位于牛FOXP3基因上游的X連鎖母源單核苷酸多態(tài)（NC_037 357.1：g.92，377，635Agt;G，rs135720414），與母牛屢配不孕有關(guān)^[25]。關(guān)于FOXP3基因多態(tài)性與西門塔爾牛、褐牛、安格斯牛屢配不孕及E、FSH、PRL、T和LH激素水平相關(guān)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擴(kuò)增FOXP3基因，通過(guò)DNA直接測(cè)序技術(shù)在母牛的FOXP3基因中分別檢測(cè)到了rs135720414位點(diǎn)Agt;G突變產(chǎn)生的3種基因型AA、AG、GG，對(duì)健康組與屢配不孕組進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩組基因型有顯著差異（Plt;0.05），卡方檢驗(yàn)顯示，該位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡，遺傳純和度高于雜合度，說(shuō)明這個(gè)位點(diǎn)在該群體種變異程度較小，位點(diǎn)多態(tài)信息含量為中度多態(tài)（0.25lt;PIClt;0.50），說(shuō)明該群體具有較為豐富的遺傳基礎(chǔ)，F(xiàn)OXP3基因rs135720414位點(diǎn)不同基因型關(guān)于母牛屢配不孕發(fā)病情況存在顯著差異。說(shuō)明FOXP3基因可能可以用于評(píng)估母牛的繁殖狀態(tài)。

3.2 FSHR基因

FSHR基因位于11號(hào)染色體上，由10個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，前9個(gè)外顯子包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，第10個(gè)外顯子包含跨膜結(jié)構(gòu)域^[28]。在母牛卵巢中表達(dá)，并通過(guò)與促卵泡激素^[29]結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，以刺激配子發(fā)生過(guò)程^[30]。在卵巢卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用^[31]。FSH是卵巢發(fā)生排卵反應(yīng)的主要因素^[32]。FSHR基因的C和G等位基因與屢配不孕的發(fā)生率顯著相關(guān)；G等位基因顯著高于C等位基因。以往的研究報(bào)道了FSHR位點(diǎn)多態(tài)性與母牛屢配不孕發(fā)生率之間的關(guān)聯(lián)^[33]。FSHR基因可作為屢配不孕母牛早期淘汰的標(biāo)記，避免因?qū)遗洳辉心概Ｔ馐芙?jīng)濟(jì)損失，從而實(shí)現(xiàn)高效的標(biāo)記輔助選擇^[17]。關(guān)于FSHR基因多態(tài)性與西門塔爾牛、褐牛、安格斯牛屢配不孕及E、FSH、PRL、T和LH激素水平相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擴(kuò)增FSHR基因，通過(guò)DNA直接測(cè)序技術(shù)在母牛的FSHR基因中檢測(cè)到1個(gè)SNP位點(diǎn)突變產(chǎn)生的3種基因型AA、AC、CC，對(duì)健康組與屢配不孕組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)兩組基因型有顯著差異，卡方檢驗(yàn)顯示該位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡，遺傳純和度高于雜合度，說(shuō)明這個(gè)位點(diǎn)在該群體種變異程度較小，位點(diǎn)多態(tài)信息含量為中度多態(tài)（0.25lt;PIClt;0.5），說(shuō)明該群體具有較為豐富的遺傳基礎(chǔ)，F(xiàn)SHR基因不同基因型關(guān)于母牛屢配不孕發(fā)病情況存在顯著差異。說(shuō)明FSHR基因可能可以用于評(píng)估母牛的繁殖狀態(tài)。

3.3 FMR1基因

FMR1基因編碼的FMRP，是一種mRNA結(jié)合蛋白，在蛋白質(zhì)翻譯、mRNA運(yùn)輸和RNA降解中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)MR1突變導(dǎo)致基因高度甲基化、基因沉默和FMRP不表達(dá)，導(dǎo)致屢配不孕的發(fā)生^[34]。然而本研究對(duì)167頭母牛5′UTR區(qū)域的檢測(cè)中未檢測(cè)到差異顯著的變異情況。分析其原因可能為前人的研究多偏向于以人為研究對(duì)象，牛與人基因編碼差異過(guò)大，該基因在牛上未表現(xiàn)出變異情況。

3.4 激素水平

生殖激素濃度變化是引起牛屢配不孕的主要因素之一^[35]。近年來(lái)，對(duì)屢配不孕臨床癥狀的研究很多，但是在內(nèi)分泌方面的研究相對(duì)較少。生殖激素與繁殖有很大的聯(lián)系，各生殖激素在繁殖期間不可或缺。E與孕激素（progesterone，P）具有協(xié)同作用，有研究表明給切除卵巢的奶牛先注射少量P后再注射E可以引起母牛發(fā)情^[36]。FSH激素水平的變化能夠?qū)δ概Ｅ怕压δ墚a(chǎn)生影響，長(zhǎng)效牛重組卵泡刺激素的使用可以顯著改善卵巢超刺激反應(yīng)的結(jié)果，并提高胚胎的質(zhì)量和數(shù)量^[37]。PRL是一種具有多種生物學(xué)功能的腦下垂體激素，PRL是啟動(dòng)和維持哺乳所必需的^[38]，不僅在哺乳期中起重要作用，而且還調(diào)節(jié)生殖過(guò)程，如PRL已被報(bào)道影響生殖性能和細(xì)胞凋亡的過(guò)程^[39]。關(guān)于T激素，已有研究表明T失調(diào)會(huì)導(dǎo)致綿羊發(fā)情周期缺陷和多囊卵巢綜合征發(fā)生，影響其繁殖性能^[40]。因此，母牛屢配不孕可能可通與其激素水平相關(guān)。本研究中對(duì)健康組與屢配不孕牛組的各生殖激素濃度進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，健康組與屢配不孕組激素濃度有顯著差異，健康牛E、FSH濃度顯著高于屢配不孕牛，差異極顯著，健康牛PRL、T濃度顯著高于屢配不孕牛；健康牛LH濃度與屢配不孕牛差異不顯著.由此可以推斷E、FSH、PRL、T的濃度對(duì)屢配不孕牛有影響。因此及時(shí)關(guān)注母牛激素水平的變化，可能可以提高母牛的繁殖能力。

3.5 基因多態(tài)性與激素水平相關(guān)性

馬菀笛等^[41]認(rèn)為一些基因的變異會(huì)導(dǎo)致激素水平的變化，從而導(dǎo)致母牛屢配不孕。FSHR基因變異導(dǎo)致母牛GH、LH、FSH和P4種激素濃度的波動(dòng)與母牛屢配不孕有一定相關(guān)性。PRL調(diào)節(jié)母體生殖過(guò)程，隨著PRL濃度的增加，卵泡數(shù)量逐漸減少^[40]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PRL濃度與基因變異相關(guān)，從而影響母牛屢配不孕。在本研究將FOXP3基因的3種基因型與激素水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3基因多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型對(duì)母牛E激素水平存在顯著影響，說(shuō)明FOXP3基因可能可以通過(guò)調(diào)控母牛體內(nèi)E激素水平影響母牛屢配不孕。另外，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明FOXP3基因突變對(duì)FSH、PRL、T、LH幾乎沒(méi)有影響作用。FSHR基因的3種基因型與部分激素水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSHR基因不同基因型對(duì)母牛E激素水平存在顯著影響，說(shuō)明FSHR基因可能可以通過(guò)調(diào)控母牛體內(nèi)E激素水平影響母牛屢配不孕。FMR1基因5′UTR端302bp處T堿基插入的基因型PRL激素濃度與正?；蛐筒町愶@著。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)FOXP3基因、FSHR基因在西門塔爾牛、褐牛及安格斯牛群體中具有多態(tài)性，這說(shuō)明基因可能是影響母牛屢配不孕的潛在遺傳因素。其中，F(xiàn)OXP3基因G等位基因與母牛屢配不孕具有顯著正相關(guān)性，F(xiàn)SHR基因C等位基因與母牛屢配不孕具有顯著正相關(guān)性。FMR1基因5′UTR端發(fā)現(xiàn)T堿基插入，但與母牛屢配不孕不具有相關(guān)性。FOXP3基因的g.92，377，635Agt;G位點(diǎn)以及FSHR基因g.31，450，279Agt;C位點(diǎn)可能能夠作為母牛屢配不孕的標(biāo)志性識(shí)別位點(diǎn)，可用于篩選屢配不孕母牛的潛在候選遺傳標(biāo)記，這需要進(jìn)一步的證明。部分激素水平也在健康組與屢配不孕組中表現(xiàn)出明顯的差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人關(guān)于激素水平可作為檢測(cè)母牛繁殖能力變化的重要指標(biāo)的研究結(jié)果。由相關(guān)性分析可知，F(xiàn)OXP3基因G等位基因與E濃度呈弱正相關(guān)，F(xiàn)MR1基因T堿基的插入與E濃度呈弱正相關(guān)。然而FOXP3基因、FSHR基因的變異如何調(diào)控母牛繁殖能力還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（編輯 白永平）