豬流行性腹瀉病毒感染仔豬空腸轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

摘 要：旨在分析豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染仔豬空腸組織的轉(zhuǎn)錄組差異。用PEDV毒株HB（G2b）感染3頭2日齡仔豬，對(duì)感染后18h仔豬空腸組織進(jìn)行免疫組化、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，最后采用熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。結(jié)果顯示：仔豬感染PEDV18h后空腸絨毛明顯脫落、變短，且PEDV主要分布于空腸腸絨毛表面；GO富集及KEGG富集分析的差異基因主要與免疫應(yīng)答過程和炎癥反應(yīng)過程相關(guān)；富集在趨化因子受體相互作用、Toll受體信號(hào)、脂肪與糖代謝等。結(jié)果提示PEDV感染可激活宿主免疫反應(yīng)及相關(guān)抗病毒信號(hào)通路，并且引起宿主的炎癥風(fēng)暴和營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂，為深入研究PEDV的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；轉(zhuǎn)錄組；致病機(jī)制

中圖分類號(hào)：S852.6596

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2652-10

收稿日期：2023-06-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32202826）；河南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)（202210471045）；河南省青年基金（222300420216）

作者簡(jiǎn)介：李棟梁（1989-），男，河南鄭州人，博士生，主要從事病毒免疫學(xué)研究，E-mail：497222038@sian.com

*通信作者：吳 超，主要從事病原微生物學(xué)檢測(cè)研究，E-mail：wuchao_517@126.com

Differential Expression of Transcriptome in Jejunal of Piglets Infected with Porcine

Epidemic Diarrhea Virus

LIDongliang^1，2，ZHENGGuanmin³，LIShuai¹，ZHUHongsen³，WUChao^4*

（1.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou450046，China;

2.College of Animal Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou

450046，China; 3.Henan University of Chinese Medicine School of Medicine，Zhengzhou

450046，China; 4.Zhengzhou Customs，Zhengzhou450008，China）

Abstract：The aim is to study the pathogenic mechanism of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）by transcriptome analysis of the jejunum of two-day-old piglets infected with PEDV.Three two-day-old piglets were infected with the PEDV HB strain（PEDV-HB），which belongs to the currently prevalent G2b subtype.At18h post-infection，jejunum tissues were collected from piglets for pathology，PEDV detection，RNA-seq and transcriptome analysis.Finally; the transcriptome results were verified by quantitative real-time PCR（RT-qPCR）.The result showed that the jejunal villi of piglets infected PEDV-HB were significantly shed and shortened; and was mainly distributed on the surface of intestinal villi.GO and KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes（DEGs）were mainly related to immune response and inflammatory response，and were enriched in several classical pathways，such as cytokine-cytokine receptor interaction，Toll-like receptor signaling pathway，fat and glucose absorption and metabolism.（Conclusion）PEDV infection of the jejunum of piglets activates the host immune response and associated antiviral signaling pathways and induces acytokine storm as well as dysfunctions in fat and glucose absorption and metabolism.In all，this research can lay the foundation for the study of pathogenesis mechanism of PED.

Key words：porcine epidemic diarrhea virus; transcriptions; pathogenesis mechanisms

*Corresponding author：WU Chao，E-mail：wuchao_517@126.com

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于α冠狀病毒，是一種高度接觸性的傳染病病原，可引起各日齡豬的嘔吐、腹瀉、脫水及仔豬的高死亡^[1]。1971年P(guān)EDV首次在英國(guó)的育肥豬發(fā)現(xiàn)。隨后，20世紀(jì)80年代和90年代PEDV在歐洲廣泛流行^[2]。2010年以后PEDV發(fā)生變異，在中國(guó)、美國(guó)、加拿大、日本等全球主要養(yǎng)豬國(guó)家廣泛流行；新的PEDV毒株主要引起嚴(yán)重的腸道疾病，從而導(dǎo)致初生仔豬死亡，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失，且臨床上尚無有效的疫苗防控此病^[1，3]。因此，針對(duì)PEDV致病機(jī)制的相關(guān)基礎(chǔ)研究尤為重要。

轉(zhuǎn)錄組近些年來被廣泛應(yīng)用于病毒與宿主相互作用的基礎(chǔ)研究中，其中應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究PEDV致病機(jī)制已有了大量報(bào)道。有文章報(bào)道使用PEDV感染Vero E6細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在Vero E6細(xì)胞抗PEDV病毒調(diào)控中發(fā)揮了重要作用^[4]；有學(xué)者分別使用經(jīng)典毒株（CV777）和地方流行毒株（HLJ）感染IPEC-J2細(xì)胞，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)HLJ菌株比CV777菌株能更快速、更強(qiáng)烈地激活先天免疫和炎癥反應(yīng)^[5]；此外，還有研究報(bào)道分別使用PEDV強(qiáng)、弱毒株感染IPEC-J2細(xì)胞，比對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組差異^[6]；通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞能激活STAT家族的調(diào)控^[7]。

本論文為研究PEDV與宿主空腸組織相互作用的分子致病機(jī)制，我們使用PEDV抗原抗體陰性的初生2日齡仔豬為感染宿主，使用PEDV G2b基因型HB毒株感染2日齡仔豬，建立了PEDV感染仔豬18h的模型。隨后，使用18h感染仔豬的空腸組織構(gòu)建了文庫，對(duì)文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到PEDV感染引起的宿主差異表達(dá)基因，隨后進(jìn)行GO富集及KEGG富集生物信息學(xué)分析，并用RT-qPCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。該研究補(bǔ)充了PEDV與宿主相互作用的體內(nèi)數(shù)據(jù)，并且為進(jìn)一步研究PEDV體內(nèi)致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與病毒

從PEDV抗原陰性的母豬所產(chǎn)仔豬中選取6頭用作試驗(yàn)動(dòng)物。PEDV抗原檢測(cè)試紙條檢測(cè)仔豬，結(jié)果顯示抗原為陰性。使用羊奶替代母豬的初乳飼喂初生仔豬24h；口服感染PEDV HB毒株（KY928065.1）。該毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；PEDV N蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備^[8]；4％多聚甲醛購(gòu)自Hyclone公司；HRP-羊抗鼠IgG試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自中國(guó)武漢博士德生物技術(shù)有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自Vazyme品牌；引物由生工生物工程有限公司合成；PEDV抗原檢測(cè)試紙條購(gòu)自廣州岳洋生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物感染試驗(yàn)

感染組3頭仔豬使用噬斑純化后第五代HB毒株，經(jīng)口服感染途徑感染，每頭仔豬感染劑量為1 mL，病毒毒價(jià)為10⁵TCID₅₀·mL^-1，編號(hào)為1、2、3；剩余3頭口服DMEM，設(shè)為對(duì)照組，編號(hào)為4，5，6。感染18h后，收集感染組和對(duì)照組仔豬空腸組織，4％多聚甲醛固定，其余空腸部分-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PEDV N蛋白在仔豬空腸內(nèi)的分布

對(duì)收集的空腸組織進(jìn)行石蠟包埋，使用的一抗為PEDV N蛋白單抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，DAB顯色試劑盒顯色，檢測(cè)病毒在空腸組織內(nèi)的表達(dá)分布。

具體方法如下：組織的脫水、透明和浸蠟使用全自動(dòng)組織處理器設(shè)備來完成，完成脫水、透明和浸蠟后，對(duì)組織進(jìn)行包埋，修剪包埋蠟塊，進(jìn)行切片。脫蠟：二甲苯透明10min，梯度乙醇脫水，然后沖洗，過蒸餾水?？乖迯?fù)：使用蒸餾水稀釋抗原修復(fù)液，將切片煮沸20min，并且自然冷卻至室溫。用PBS漂洗3次，封閉液封閉1h；棄去封閉液，滴加一抗，4 ℃過夜；用PBS漂洗3次，滴加二抗，37 ℃濕盒中孵育1h；用PBS漂洗3次，使用DAB在37 ℃溫箱顯色10min，鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有棕色顆粒出現(xiàn)時(shí)，蒸餾水終止顯色；蘇木素溶液復(fù)染5min，從蘇木素溶液中取出后，組織切片經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 樣品總RNA提取

處理凍存的空腸組織（感染組和對(duì)照組），使用TRIzol法提取總RNA。RNA樣品快速放置-80 ℃保存，用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。

1.6 測(cè)序文庫構(gòu)建

對(duì)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的RNA進(jìn)行純化，去除rRNA，富集mRNA。通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA，用超聲波打斷mRNA。以片段化的mRNA為模版，合成cDNA第1條鏈，用RNaseH降解多余的RNA，隨后合成cDNA第2條鏈。雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加尾并連接測(cè)序接頭，隨后篩選出200bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫，Illumina平臺(tái)上機(jī)測(cè)序（由廣東基迪奧公司完成）。

1.7 生物信息學(xué)分析

比較感染組和對(duì)照組之間的基因表達(dá)差異，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

1.8 熒光定量（RT-qPCR）驗(yàn)證

對(duì)樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)選擇的基因，以GADPH為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定與分析（表1）。RT-qPCR的結(jié)果用2^-ΔΔCt方法進(jìn)行處理，在本試驗(yàn)中特定基因的ΔΔCt具體為（PEDV感染組檢測(cè)基因-感染組內(nèi)參）-（對(duì)照組檢測(cè)基因-對(duì)照組內(nèi)參）。每個(gè)樣品做3孔重復(fù)，用GraphPad Prism6軟件處理數(shù)據(jù)。RT-qPCR的反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃5min；95℃15s；60℃40s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：SYBY EX Taq10μL；上游引物1μL；下游引物1μL；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL；DEPC水7μL。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV感染仔豬癥狀及空腸的免疫組化分析

PEDV HB毒株口服感染2日齡仔豬后，仔豬在8～12h出現(xiàn)腹瀉和嘔吐等PED典型癥狀。感染組3頭仔豬糞便評(píng)分分別為1分、2分和2分；對(duì)照組3頭仔豬評(píng)分均為0分（1分及以上認(rèn)為是腹瀉癥狀，最大分值為2分）。感染18h后，仔豬陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡，臥地不起癥狀，但是沒有仔豬死亡；進(jìn)一步剖檢觀察發(fā)現(xiàn)小腸壁薄而透明，小腸和胃分別膨脹且充滿凝乳和未消化乳汁，而對(duì)照組小腸臟器基本正常。

利用PEDV N單抗檢測(cè)感染PEDV18h的仔豬空腸。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，感染組空腸絨毛明顯脫落、變短，空腸組織內(nèi)可見明顯的N蛋白表達(dá)，且主要分布在腸絨毛表面（圖1）。進(jìn)一步量化評(píng)估腸絨毛與腸隱窩比值，3頭感染仔豬的VH∶CD（腸絨毛長(zhǎng)度﹕腸隱窩深度）分別為1.14、2.10、2.49；3頭對(duì)照組仔豬VH∶CD為6.61、6.80、7.10；感染組與對(duì)照組VH∶CD比值之間差異極顯著（Plt;0.05）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫分析

對(duì)構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫原始數(shù)據(jù)與參考序列進(jìn)行比對(duì)，剔除一系列低質(zhì)量數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，所測(cè)樣品的高質(zhì)量數(shù)據(jù)占原始數(shù)據(jù)的比率分別為96.7%、96.73%、96.65%、96.79%、96.73%、96.70%；高質(zhì)量數(shù)據(jù)比例較高可用于后續(xù)分析。進(jìn)一步將獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)與豬的參考基因組進(jìn)行比對(duì)；6個(gè)樣品與參考基因組匹配分別為44629843（93.10%）、44703865（92.97%）、41875447（92.64%）、34146295（88.84%）、35720474（89.38%）、39135999（87.14%），樣品高質(zhì)量數(shù)據(jù)基本可匹配到參考基因組。

2.3 差異基因分析

對(duì)感染組和對(duì)照組差異基因進(jìn)行聚類分析，設(shè)定|log₂FC|gt;1且FDRlt;0.05的基因?yàn)椴町愶@著。如圖2A，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)1051個(gè)差異顯著基因，其中上調(diào)基因?yàn)?41個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?10個(gè)。單個(gè)樣品差異基因聚類分析熱圖（2B）可以通過樣品基因譜的相近程度判斷組內(nèi)不同樣品基因的表達(dá)情況，紅色代表高表達(dá)基因，藍(lán)色代表低表達(dá)基因。如圖2B對(duì)照組樣品之間的差異基因表達(dá)聚類相近，感染組樣品差異基因表達(dá)聚類相近，符合水平預(yù)期。

2.4 GO富集分析

把差異顯著基因比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫，得到GO功能顯著性富集分析結(jié)果。其中生物過程中富集的差異基因主要集中在炎性反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程等（圖3）。

2.5 KEGG分析

為探討PEDV感染仔豬后，主要影響空腸組織的哪些信號(hào)通路或代謝途徑，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析。分析結(jié)果顯示，富集的最顯著信號(hào)通路為細(xì)胞因子與受體相互作用、脂肪消化與吸收等（圖4）。

2.6 RT-qPCR驗(yàn)證空腸轉(zhuǎn)錄組

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得到的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，隨機(jī)選取9個(gè)基因（圖5A）和9個(gè)趨化因子相關(guān)基因（圖5B），用RT-qPCR確定其表達(dá)水平。盡管由于兩種方法的不同，RT-qPCR與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的具體數(shù)值不完全匹配（表2、表3），但是RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢(shì)一致。

3 討 論

PEDV是近些年內(nèi)引起初生仔豬高死亡率的腸道傳染病病原之一^[1]?？漳c組織是PEDV主要感染部位^[9]。在之前的研究中我們使用臨床分離的PEDV流行毒株-HB、HNAY、HNXX構(gòu)建了2日齡仔豬感染PEDV的動(dòng)物模型，比對(duì)了不同毒株的毒力差異^[10]。在本研究中，我們基于之前的動(dòng)物模型數(shù)據(jù)，進(jìn)一步構(gòu)建了PEDV HB毒株感染2日齡仔豬18h的動(dòng)物模型。臨床觀察發(fā)現(xiàn)仔豬出現(xiàn)典型的PED癥狀，免疫組化染色驗(yàn)證了感染仔豬的腸絨毛存在大量PEDV抗原，基于仔豬剖檢分析和腸絨毛與腸隱窩比值分析，感染組空腸組織破壞嚴(yán)重。選擇18h感染組空腸組織構(gòu)建文庫，對(duì)文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、生物信息學(xué)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1051個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)基因?yàn)?41個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?10個(gè)。

進(jìn)一步通過GO富集分析后，發(fā)現(xiàn)在生物過程聚類的差異基因大部分與免疫應(yīng)答相關(guān)，這與之前的體外PEDV感染細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究相一致^[4-7]。差異基因顯著富集的炎癥反應(yīng)過程中IL-6基因有明顯表達(dá)（圖5，表2）。在新型冠狀病毒的研究中，炎癥風(fēng)暴已被認(rèn)為是引起宿主死亡的關(guān)鍵因素^[11]；事實(shí)上在SARS-CoV-2的臨床研究中IL-6特異性抗體可以抑制過度的炎癥反應(yīng)，從而有效治療重癥患者^[12]。那么，IL-6在PEDV導(dǎo)致仔豬急性腸炎和高死亡中發(fā)揮何種功能還需要進(jìn)一步研究。

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要聚類到趨化因子受體相互作用通路（Cytokine-cytokine receptor interaction）。趨化因子是免疫系統(tǒng)對(duì)抗病原感染的的重要組成部分，主要負(fù)責(zé)淋巴細(xì)胞遷移和炎癥反應(yīng)^[13]。SARS-CoV感染的患者血清中和死亡患者的表達(dá)譜中都能檢測(cè)到高表達(dá)的趨化因子和炎癥因子^[14]。此外，還有文章報(bào)道PEDV可以感染DC細(xì)胞，引起相關(guān)趨化因子上調(diào)^[14]。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)PEDV感染的空腸組織中大量趨化因子表達(dá)變化，進(jìn)一步選擇之前報(bào)道研究的趨化因子進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，所得結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢(shì)一致（圖5，表3）。但是，有趣的是根據(jù)之前文章報(bào)道，PEDV體外感染DC細(xì)胞后CCL25為上調(diào)^[15]。而在我們體內(nèi)研究中CCL25則下調(diào)表達(dá)（圖5，表3）。CCL25對(duì)趨化腸道分泌的IgA，T淋巴細(xì)胞遷移、循環(huán)和抗原遞呈具有重要作用^[16-17]。人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的恒河猴動(dòng)物模型中，空腸內(nèi)CCL25的表達(dá)明顯下調(diào)，這可能會(huì)影響?zhàn)つち馨图?xì)胞回歸，進(jìn)而影響?zhàn)つぜ?xì)胞的體液免疫功能^[18]。我們推測(cè)PEDV感染仔豬腸道內(nèi)CCL25趨化因子下調(diào)可能會(huì)影響宿主IgA的趨化和抗原遞呈，從而更有利于病毒在腸道復(fù)制。但是，PEDV可以利用抗原遞呈細(xì)胞-DC細(xì)胞感染宿主多個(gè)器官^[15]，CCL25的下調(diào)可能會(huì)在一定程度上減弱腸道DC細(xì)胞的招募和遞呈作用，從而減少病毒對(duì)宿主多器官的影響。其次，我們發(fā)現(xiàn)差異基因主要還聚類到Toll受體信號(hào)通路（toll-like receptor signaling pathway），冠狀病毒感染宿主后，宿主主要通過Toll受體識(shí)別模式識(shí)別病毒，激活下游免疫應(yīng)答^[19-20]。除此之外，差異顯著基因還富集到脂肪消化與吸收（fat digestion and absorption）和高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物-受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications），這些信號(hào)通路主要與脂肪和糖代謝相關(guān)。事實(shí)上，PEDV感染宿主，造成腸道損傷后，是可以影響空腸黏膜對(duì)脂質(zhì)和葡萄糖的吸收和代謝^[21]；從而進(jìn)一步加劇宿主死亡。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了PEDV感染2日齡仔豬18h動(dòng)物模型，對(duì)感染的空腸組織進(jìn)行免疫組化分析，可觀察到空腸絨毛明顯脫落、變短，且PEDV主要分布在腸絨毛表面。進(jìn)一步對(duì)感染仔豬空腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析顯示：差異表達(dá)基因主要富集在免疫應(yīng)答相關(guān)生物學(xué)過程，并在趨化因子受體相互作用，Toll受體信號(hào)通路等多個(gè)經(jīng)典通路富集。這提示PEDV感染宿主后激活了宿主免疫反應(yīng)及相關(guān)抗病毒信號(hào)通路，從而對(duì)抗病毒感染。此外，差異顯著基因還主要富集在炎癥應(yīng)答，脂肪、糖代謝相關(guān)通路上，這提示PEDV引起的炎癥風(fēng)暴和空腸營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂可能是仔豬高死亡率的原因。

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（編輯 白永平）