一例海豚源典型異尖線蟲(chóng)形態(tài)觀察和分子鑒定

摘 要：旨在鑒定由海豚糞便樣本中所分離所得線蟲(chóng)種類。首先對(duì)所分離蟲(chóng)體進(jìn)行形態(tài)觀察，然后提取蟲(chóng)體基因組DNA，并對(duì)樣本28S rRNA D2-D3基因和ITS基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。所得序列經(jīng)BLAST比對(duì)并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)所得序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：蟲(chóng)體長(zhǎng)120～140mm，整體呈圓柱形，兩端尖細(xì)，外觀呈乳白色半透明，鏡下觀察其內(nèi)部偏黃?？梢?jiàn)食道前端細(xì)，向后逐漸膨大。PCR結(jié)果顯示，28S rRNA D2-D3基因與ITS基因擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為797和840bp。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：28S rRNA D2-D3基因（GenBank登錄號(hào)OR345165）與已報(bào)道典型異尖線蟲(chóng)（Anisakis typical，GenBank登錄號(hào)HF911524.1）的序列一致性為95.36％；ITS基因（GenBank登錄號(hào)OR345164）與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)MF668919.1）一致性為97.11%，其中，ITS-1區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)MF668919.1）一致性為91.90%，ITS-2區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)JN968938.1）一致性為94.97%，5.8S rRNA區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)OQ244221.1）一致性為100.00%?；贗TS基因和28S rRNA D2-D3基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，此次研究分離所得寄生蟲(chóng)樣本與典型異尖線蟲(chóng)遺傳距離最近，且同一分支上。本次分離所得寄生蟲(chóng)樣本經(jīng)過(guò)分子鑒定為典型異尖線蟲(chóng)。同源性分析結(jié)果顯示，其與典型異尖線蟲(chóng)一致性均大于95%；同時(shí)，在28S rRNA D2-D3基因序列和ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方面，均與已報(bào)道的典型異尖線蟲(chóng)遺傳距離最近。

關(guān)鍵詞：異尖線蟲(chóng)；人畜共患病；形態(tài)學(xué)觀察；分子鑒定；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

中圖分類號(hào)：S852.731; S858.93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2599-08

收稿日期：2023-09-20

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（2008085QC136）

作者簡(jiǎn)介：朱昊天（1999-），男，安徽淮南人，碩士生，主要從事寄生蟲(chóng)與寄生蟲(chóng)病方向研究，E-mail：sirius41852@163.com

*通信作者：徐前明，主要從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)與寄生蟲(chóng)病方向研究，E-mail：xuqianming2006@163.com

Morphological Observation and Molecular Characterization of"Anisakis Derived from Dolphin

ZHUHaotian¹，LIULuyao¹，YANGCongshan¹，JIANGJi¹，SHIHan¹，LIUXiaoxiao¹，CHEN Muxin²，XUQianming^1*

（1.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei230036，"China; 2.Key Laboratory of Parasitic Pathogens and Vector Biology of the National Health"Commission（Institute of Parasitic Diseases Prevention and Control of the Chinese Center for"Disease Control and Prevention），Institute of Parasitic Diseases Prevention and Control of"the Chinese Center for Disease Control and Prevention（National Tropical Disease"Research Center），Shanghai200025，China）

Abstract：In order to identify the species of nematodes isolated from dolphin fecal samples，the morphology of the isolated nematodes is first identified.The parasite′s body length was observed to be120-140mm long，with acylindrical shape and slender ends.Its appearance was milky white and translucent，and its internal structure was observed to be yellowish under the microscope.It can be seen that the front end of the esophagus is thin and gradually expands backwards.We extracted the genomic DNA of the isolated worm and amplified the28S rRNA D2-D3gene and ITS gene fragments by PCR for molecular identification.The PCR results showed that the amplification products of the28S rRNA D2-D3gene and ITS gene were797and840bp，respectively.BLAST alignment results showed that the sequence similarity between the28S rRNA D2-D3gene（GenBank accession number OR345165）and the Anisakis typical（GenBank accession number HF911524.1）was95.36%.The sequence similarity between the ITS gene（GenBank accession number OR345164）and the Anisakis typical（GenBank accession number MF668919.1）was97.11%，with a91.90%sequence identity between the ITS-1region and the Anisakis typical（GenBank accession number MF668919.1）.There is a94.97%sequence identity between the ITS-2region and the Anisakis typical（GenBank accession number JN968938.1）and a100.00%sequence identity between the5.8S rRNA region and the Anisakis typical（GenBank accession number OQ244221.1）.Phylogenetic analyses based on the ITS gene and the28S rRNA D2-D3gene showed that the parasite samples isolated in this study were genetically closest to the Anisakis typical，and on the same branch.In summary，the isolated parasite samples obtained from this study should be the larvae of Anisakis typical based on microscopic examination and molecular analysis.

Key words：Anisakis; zoonosis; morphological observation; molecular identification; phylogenetic tree

*Corresponding author：XU Qianming，E-mail：xuqianming2006@163.com

異尖線蟲(chóng)（Anisakis spp.）屬于蛔目異尖科，其第一中間宿主為磷蝦等小型甲殼類動(dòng)物，第二中間宿主為海洋魚(yú)類及較大的甲殼類和頭足類動(dòng)物，終末宿主為鯨魚(yú)、海豚和海獅等海洋哺乳動(dòng)物^[1-3]。人不是異尖線蟲(chóng)的適宜宿主，但幼蟲(chóng)可寄生于人體消化道各部位，引起內(nèi)臟幼蟲(chóng)移行，即人體異尖線蟲(chóng)病^[4]。人體異尖線蟲(chóng)病為食源性寄生蟲(chóng)病，主要通過(guò)食用某些含有異尖線蟲(chóng)第三期幼蟲(chóng)的海魚(yú)而感染，可引起腹痛、腹瀉并伴有惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)在體內(nèi)多處組織器官內(nèi)形成腫瘤腫物^[5-6]。目前，已報(bào)道可引起人體異尖線蟲(chóng)病的蟲(chóng)種主要有5屬：即異尖線蟲(chóng)屬、鉆線蟲(chóng)屬、鮪蛔線蟲(chóng)屬、海豹線蟲(chóng)屬和對(duì)盲囊線蟲(chóng)屬^[7-9]。隨著異尖線蟲(chóng)對(duì)海洋生物感染率的不斷上升以及鮮食生魚(yú)（刺身、壽司等）的飲食文化興起，異尖線蟲(chóng)病已經(jīng)成為一種非常重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病，不僅對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅，還給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)重大損失，已被我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部會(huì)同海關(guān)總署組織修訂的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》列為二類傳染病、寄生蟲(chóng)病。

據(jù)近幾年的報(bào)道，在我國(guó)江蘇省沿海地區(qū)海域異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染率為64.0%^[10]；福建省沿海魚(yú)類異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染率為34.20%^[7]；遼寧省鮮活海魚(yú)中異尖線蟲(chóng)感染率為20.04%^[8]。由此可見(jiàn)，異尖線蟲(chóng)的危害是不可忽視的，尤其是在選擇食用海產(chǎn)品（魷魚(yú)、小黃魚(yú)、帶魚(yú)等）時(shí)，必須經(jīng)過(guò)完全烹煮后再食用。

本文主要對(duì)一例由海豚糞便中進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，進(jìn)而采用分子分類法加以確定其種屬關(guān)系，且初步鑒定其為典型異尖線蟲(chóng)，這為異尖線蟲(chóng)病的診斷和鑒定提供了借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒（Blood DNAamp;Tissue kit）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，PCR預(yù)混液購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 蟲(chóng)體來(lái)源

蟲(chóng)體樣本來(lái)源于江蘇省南京市紅山動(dòng)物園一只2歲雌性寬吻海豚經(jīng)驅(qū)蟲(chóng)后排泄出的糞便樣，其日常喂飼以常見(jiàn)雜魚(yú)為主。

1.3 蟲(chóng)體觀察

直接從海豚糞便中挑取出蟲(chóng)體，經(jīng)PBS緩沖液（pH7.2）漂洗3次，主要觀察蟲(chóng)體整體形狀即結(jié)構(gòu)，包括胃、腸、尾等。

1.4 蟲(chóng)體基因組DNA提取

將分離所得蟲(chóng)體置500μL組織裂解液進(jìn)行充分研磨，加入蛋白酶K消化5min，依照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蟲(chóng)體基因組DNA，-20 ℃下保存、備用。

1.5 引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[11-12]設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增線蟲(chóng)28S rRNA中D2-D3基因序列和rRNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，，ITS1、ITS2）（包括ITS-1和ITS-2）基因引物。引物序列詳見(jiàn)表1，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.6 PCR擴(kuò)增目的基因

將提取所得DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20μL）：2×PCR預(yù)混液10μL，ddH₂O8μL，分別添加上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件：95℃3min；94℃25s，56℃25s，72℃20s，共35個(gè)循環(huán)；72℃5min。取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.7 同源性分析和遺傳系統(tǒng)發(fā)育分析

在GenBank中檢索不同種線蟲(chóng)ITS基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，并對(duì)28 S rRNA基因（GenBank登錄號(hào)OR345165）和ITS基因（GenBank登錄號(hào)OR345164）測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)分析。使用MEGA11.0軟件以最大似然法（Maximal likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展值重復(fù)1000次，分析蟲(chóng)體親緣關(guān)系。

1.8 動(dòng)物倫理批準(zhǔn)和患者知情同意

本研究獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為AHAUB001），符合動(dòng)物福利倫理要求，不涉及患者知情同意。

2 結(jié) 果

2.1 蟲(chóng)體觀察

在海豚源性糞便樣本中發(fā)現(xiàn)并分離出3條蟲(chóng)體樣本，蟲(chóng)體長(zhǎng)12～14mm，整體呈圓柱形，兩端尖細(xì)，外觀呈乳白色半透明，鏡下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)偏黃?？梢?jiàn)食道前端細(xì)，向后逐漸膨大（圖1）。根據(jù)Jabber等^[13]以及文茜^[14]關(guān)于異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的研究以及描述，且未見(jiàn)明顯分化雌雄器官且蟲(chóng)體長(zhǎng)度較短，初步鑒定該寄生蟲(chóng)為異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)，后續(xù)以便進(jìn)一步開(kāi)展分子學(xué)鑒定。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增28S rRNA D2-D3基因以及ITS基因片段大小分別為797和840bp（圖2），與預(yù)期結(jié)果相一致。

2.3 序列分析

通過(guò)BLAST分析28S rRNA D2-D3基因測(cè)序結(jié)果，可知本次分離所得樣本該基因與典型異尖線蟲(chóng)（Anisakis typica，GenBank登錄號(hào)HF911 524.1）一致性為95.36%。

根據(jù)蘆亞君等^[15]的研究，以及通過(guò)在GenBank中檢索不同種線蟲(chóng)ITS基因序列并進(jìn)行對(duì)比分析可知，不同種類線蟲(chóng)之間ITS基因長(zhǎng)度差距明顯，見(jiàn)表2。相同地，不同種類異尖線蟲(chóng)之間ITS基因長(zhǎng)度同樣存在差異，見(jiàn)表3。以典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)HF911 524.1）作為參照物，分析出ITS基因840bp序列中含有18S rRNA14bp，ITS-1307bp，5.8S rRNA158bp，ITS-2288bp，28S rRNA73bp。通過(guò)BLAST分析后，可知ITS基因序列（包括ITS-1、ITS-2）整體上與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)MF668 919.1）一致性為97.11%；其中ITS-1區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)MF668 919.1）一致性為91.90%；ITS-2區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)JN968 938.1）一致性為94.97%；5.8 S rRNA區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)（GenBank登錄號(hào)OQ244 221.1）一致性為100.00%。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，本次分離所得樣本與典型異尖線蟲(chóng)（Anisakis typica，GenBank登錄號(hào)KY352 230.1）遺傳距離相近，且在同一分支上（圖3），自展值為99%。

分支下方數(shù)字為自展值基于28S rRNA D2-D3基因所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，本研究分離的線蟲(chóng)與典型異尖線蟲(chóng)（Anisakis typica，GenBank登錄號(hào)ON117 607.1）遺傳距離最近，且在同一分支上，自展值為100%（圖4）。

3 討 論

異尖線蟲(chóng)傳統(tǒng)分類中普遍所采用的形態(tài)學(xué)依據(jù)主要有：頭端結(jié)構(gòu)，口、唇、鉆齒和乳突的形狀；食道特征；排泄孔位置；胃和腸；尾端等^[9]。但是通過(guò)形態(tài)學(xué)特征對(duì)異尖線蟲(chóng)進(jìn)行分類鑒定，卻不是最理想的辦法。因?yàn)楫惣饩€蟲(chóng)的幼蟲(chóng)在宿主體內(nèi)處于不同的發(fā)育時(shí)期，形態(tài)和結(jié)構(gòu)上也存在很大的差異^[16-17]；此外，還會(huì)因一些外界因素，如宿主遷徙、季節(jié)等對(duì)其生殖器官的發(fā)育帶來(lái)一定的影響^[18-19]。因而對(duì)異尖線蟲(chóng)的鑒定與分類，使用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法僅能停留在科或?qū)僖陨希鴮?duì)于屬內(nèi)各種間異尖線蟲(chóng)的分類鑒定存在很大的困難，特別是對(duì)于一些隱藏種、復(fù)合種和姊妹種。

近年來(lái)隨著生物分子學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的分子技術(shù)被運(yùn)用到線蟲(chóng)的鑒定與分類學(xué)上。如Orecchia等^[20]通過(guò)多位點(diǎn)等位酶電泳技術(shù)，首次證實(shí)了采自于地中海和東北大西洋海域大的簡(jiǎn)單異刺線蟲(chóng)（A.simliex）為復(fù)合種；Timi等^[21]用rDNA的ITS-1、ITS-2和mtDNA的cox2基因分別設(shè)計(jì)引物，建立了用于鑒別偽地新線蟲(chóng)屬的PCR方法，用該方法結(jié)合測(cè)序和進(jìn)化樹(shù)分析首次證明西南大西洋海域的海魚(yú)寄生偽地新線蟲(chóng)屬第三期幼蟲(chóng)。由此可見(jiàn)，分子方法對(duì)于物種的精確鑒定是不可或缺的。故對(duì)于本次采集的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增28S rRNA基因及ITS基因，通過(guò)同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。

本次研究利用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)同時(shí)對(duì)分離所得樣本ITS基因和28S rRNA D2-D3基因進(jìn)行了分析，為異尖線蟲(chóng)分子生物學(xué)鑒定方法提供了參考，同時(shí)為我國(guó)海豚源性異尖線蟲(chóng)蟲(chóng)種分類豐富了案例。

4 結(jié) 論

對(duì)分離所得樣本ITS基因和28S rRNA D2-D3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期相符合的目的條帶，并通過(guò)同源性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分子鑒定。綜合分析結(jié)果表明，ITS基因，即ITS-1區(qū)域和ITS-2區(qū)域，與典型異尖線蟲(chóng)一致性分別為91.90%和94.97%，其中5.8S rRNA區(qū)域與典型異尖線蟲(chóng)一致性為100%；28S rRNA基因與典型異尖線蟲(chóng)一致性為95.36%。同時(shí)結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，分離樣本ITS基因與28S rRNA基因與典型異尖線蟲(chóng)親緣關(guān)系最為接近，由此可初步鑒定分離所得樣本為典型異尖線蟲(chóng)。

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（編輯 白永平）