腸艾美耳球蟲重組微線蛋白2對家兔免疫保護效果評價

摘 要：本研究旨在評價腸艾美耳球蟲重組微線蛋白2（rEiMIC2）對兔的免疫保護效果，為腸艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的研究提供參考。在腸艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出EiMIC2基因，進行克隆、原核表達和蛋白純化，并采用免疫印跡檢測重組蛋白的免疫反應性。將35日齡無球蟲新西蘭幼兔32只隨機分為4組（未免疫未攻蟲組、未免疫攻蟲組、pET-32a（+）載體組和rEiMIC2免疫組），每組8只，未免疫未攻蟲組和未免疫攻蟲組每只頸部皮下注射1mL無菌PBS，pET-32a（+）載體組和rEiMIC2免疫組每只分別接種100μg pET-32a（+）載體蛋白、rEiMIC2，首免后2周進行二免。二免14d后，除去未免疫未攻蟲組，其余3組每只新西蘭兔口服接種5×10⁴個腸艾美耳球蟲孢子化卵囊；攻蟲14d后安樂死所有新西蘭兔。重組蛋白免疫兔后通過觀察臨床癥狀、腸道病變、測定兔的相對增重率、卵囊減少率、抗球蟲指數(shù)（ACI）值和料肉比以及檢測血清中特異性IgG、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ綜合評價rEiMIC2的免疫保護效果。結(jié)果顯示，EiMIC2基因ORF開放閱讀框長度為1605bp，編碼的蛋白分子質(zhì)量約為57.68ku。免疫印跡顯示rEiMIC2能夠被陽性血清所識別，表明其具有良好的免疫反應性。免疫保護試驗顯示：攻蟲后各組幼兔陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁和腹瀉的癥狀，未免疫攻蟲組和rEiMIC2免疫組各有1只兔死亡；rEiMIC2免疫組相對增重率為73.97%，卵囊減少率為69.98%，ACI值為136.97，料肉比為3.98∶1，與未免疫攻蟲組差異顯著（Plt;0.05）；rEiMIC2免疫組腸道病變與未免疫攻蟲組相比較輕，血清中特異性IgG水平顯著高于未免疫攻蟲組（Plt;0.05）。綜上，rEiMIC2免疫兔后，能有效減少卵囊排出和增重損失，減輕腸道損傷，具有一定的保護效果。

關(guān)鍵詞：腸艾美耳球蟲；微線蛋白2；兔；免疫保護

中圖分類號：S852.723

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2588-11

收稿日期：2023-09-05

基金項目：四川省雅安市重點研發(fā)項目（23ZDYF0004）

作者簡介：陳 浩（1997-），男，貴州遵義人，碩士，主要從事動物寄生蟲病研究，E-mail：chenhao2197@outlook.com；郝 哥（1997-），男，四川達州人，碩士，主要從事動物寄生蟲病研究，E-mail：haoge@stu.sicau.edu.cn。陳浩和郝哥為同等貢獻作者

*通信作者：楊光友，主要從事動物寄生蟲病學研究，E-mail：guangyou1963@126.com；姜 慶，主要從事生物學研究，E-mail：jiangqing0904@126.com

Evaluation of the Immune Protective Effect of Recombinant MIC2from

Eimeria intestinalis in Rabbits

CHENHao¹，HAOGe¹，PUJiayan¹，XIAOJie¹，XIONGChangming¹，HEWei¹，

ZHUYuhua¹，XULiwen¹，JIANGQing^2*，YANGGuangyou^1*

（1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu

611130，China; 2.Ya′an Polytechnic College，Ya′an625014，China）

Abstract：The aim of this study was to evaluate the immunoprotective effect of recombinant Eimeria intestinalis microneme protein2（rEiMIC2）in rabbits and to provide areference for the study of subunit recombinant vaccine against Eimeria intestinalis.cation of EiMIC2gene was identified in E.intestinalis transcriptome data，then cloning，prokaryotic expression and protein purification were conducted.The immunoreactivity of the recombinant protein was also detected using immunoblotting.Thirty-two35-day-old coccidia-free New Zealand young rabbits were randomly divided into4groups（unchallenged group，challenged group，pET-32a（+）vector group and rEiMIC2immunization group），with8rabbits in each group.In the challenge groupunchallenged and challenged groups，1mL sterile PBS was subcutaneously injected into the neck of each rabbit.While in the pET-32a（+）vector group and rEiMIC2immunization group，each rabbits were inoculated with100μg pET-32a（+）protein or rEiMIC2.A second immunization was conducted after2weeks of the first immunization.Fourteen days after the second immunization，excluding the unimmunized and unchallenged group，each of the remaining three groups of New Zealand rabbits was orally inoculated with5×10⁴sporulated oocysts of Eimeria intestinalis; All New Zealand rabbits were euthanized fourteen14days post-infection.After immunizing rabbits with recombinant protein，the relative weight gain rate，oocyst reduction rate，After immunizing rabbits with recombinant protein，the immune protection effect of rEiMIC2was comprehensively evaluated by observing clinical symptoms，evaluating intestinal lesions，and measuring relative weight gain rate，oocyst reduction rate，anticoccidial index（ACI），feed-to-meat ratio，serum IgG，IL-2，IL-4，IL-10，IFN-γ comprehensive evaluation of the immune protection effect of rEiMIC2.The results showed that，the open reading frame length of EiMIC2gene，ORF was1605bp，encoded aprotein with amolecular mass of approximately57.68ku.Western blot showed that rEiMIC2could be recognized by positive sera，indicating its good immunoreactivity.The immune protection experiment showed that after the challenge，the symptoms of depression and diarrhea appeared in each group，and one rabbit died in theeach challenged group and the rEiMIC2immunization group; the relative weight gain rate of the rEiMIC2immunization group was73.97%，and the oocyst reduction rate was69.98%，the ACI was136.97，and the feed-to-meat ratio was3.98∶1，which were significantly different from the unimmunized and challenged group（Plt;0.05）.Compared with the intestinal lesions in the challenged control group，the intestinal lesions in the rEiMIC2immunization group were milder，and the level of the IgG in serum was significantly higher than that in the unimmunized and challenged group（Plt;0.05）.In summary，after immunizing rabbits with rEiMIC2，it can effectively reduce the excretion of oocysts and the loss of weight gain，and reduce intestinal damage，which providing acertain protective effect of the rabbits.

Key words：Eimeria intestinalis; microneme proteins2; rabbit; immune protective

*Corresponding authors：YANG Guangyou，E-mail：guangyou1963@126.com; JIANG Qing，E-mail：jiangqing0904@126.com

兔球蟲病通常由一種或多種艾美耳屬球蟲混合感染所致，流行于世界各地。不同品種和不同年齡段的兔均易感，且幼兔感染死亡率較高^[1]。腸艾美耳球蟲（Eimeria intestinalis）是對兔致病性最強的蟲種之一，在蟲體入侵和發(fā)育的過程中破壞宿主腸道上皮細胞，主要引起腹瀉和生長緩慢，嚴重時可導致死亡^[2-3]。目前在飼料和飲水中添加抗球蟲藥物是預防兔球蟲感染的主要措施，但長期反復使用藥物預防容易導致球蟲產(chǎn)生耐藥性和藥物在兔產(chǎn)品中殘留等問題。兔球蟲免疫防控作為一種替代策略近年來備受重視^[4-5]。在兔球蟲疫苗中，基因工程疫苗具有安全、穩(wěn)定和易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點，而候選抗原基因的篩選是基因工程疫苗研發(fā)的重要環(huán)節(jié)^[6-7]。

微線體（micronemes）是頂復門原蟲的一種分泌型細胞器，它分泌并釋放微線蛋白（microneme proteins，MICs）幫助蟲體識別和黏附^[8]。頂復門原蟲因種類不同其微線蛋白數(shù)量也存在差異，球蟲中共發(fā)現(xiàn)微線體蛋白11種，其中微線蛋白2（MIC2）在子孢子入侵宿主后會覆蓋于蟲體和宿主細胞表面^[9-10]。在弓形蟲（Toxoplasma gondii）、柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）和堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）等原蟲中均已證實MIC2可作為疫苗候選抗原^[11-13]。

目前有關(guān)腸艾美耳球蟲基因工程疫苗的研究報道較少^[14]。本研究在實驗室測定的腸艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出腸艾美耳球蟲EiMIC2基因，擬對其進行克隆和原核表達，并用純化后的重組蛋白免疫兔，以期綜合評價rEiMIC2作為兔腸艾美球蟲基因工程疫苗候選抗原的潛力。

1 材料與方法

1.1 動物倫理聲明

該動物研究得到四川農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會的審查和批準（SYXK（川）2019-187）。本研究中使用的動物程序均參照《實驗動物的護理和使用指南》（美國馬里蘭州貝塞斯達的國家研究委員會）和ARRIVE指南的建議進行。

1.2 試驗動物和蟲株

選取32只體重（829.75±94.32）g無球蟲感染的35日齡新西蘭幼兔（四川農(nóng)業(yè)大學寄生蟲病研究中心繁育提供），無球蟲感染的新西蘭幼兔培育方法參考文獻[15]。兔舍、飲食器具等均經(jīng)過烘烤處理，飼料則經(jīng)過高溫干燥，同時在飲水中添加了抗球蟲藥物，試驗兔自由提供采食和飲水。與此同時，未添加抗球蟲藥物的飼料則由專門的兔料廠生產(chǎn)并提供，該飼料將在攻蟲前5d開始使用。腸艾美耳球蟲（E.intestinalis）四川分離株（強毒株）由四川農(nóng)業(yè)大學寄生蟲病研究中心提供，該蟲株分離自四川省自貢市的發(fā)病肉兔。

1.3 主要試劑與儀器

兔腸艾美耳球蟲cDNA、兔腸艾美耳球蟲陽性血清和陰性血清由四川農(nóng)業(yè)大學寄生蟲病研究中心提供；pET-32a（+）載體質(zhì)粒購自北京天根生化科技有限公司；羊抗兔IgG（HRP標記）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；His Trap HP層析柱購自美國Cytiva公司。

蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)：?KTA pure層析系統(tǒng)，Cytiva，美國；PCR儀：Mastercycler Gradient，eppendorf，美國；McMaster計數(shù)板，富士平工業(yè)株式會社，日本。

1.4 生物信息學分析

將腸艾美耳球蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的EiMIC2核苷酸序列導入NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對并預測其開放閱讀框。利用生物信息學分析網(wǎng)站（Conserved Domains、SignalP-6.0、TMHMM、ExPASy Proteomics Server、BaCelLo）進行結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)和B細胞抗原表位預測。

1.5 EiMIC2基因擴增、原核表達、可溶性分析和蛋白純化

利用Primer5.0設計EiMIC2基因的上、下游引物，在引物兩端加入pET-32a（+）載體同源臂（以下劃線標記）。F：ATCGGATCCGAATTCGAGC-TCATGTCATCACAGGCAGCAGGAG，R：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGCAGGGATT-GTTTTCACATTCTCGC。以腸艾美耳球蟲cDNA為模板進行PCR擴增，提取測序正確的pET-32a（+）-EiMIC2質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。擴增培養(yǎng)5mL的陽性菌液在37℃、140r·min^-1和1mmol·L^-1IPTG濃度條件下誘導12h。擴大培養(yǎng)1L保種留下的表達菌液，在18℃、90r·min^-1和0.5mmol·L^-1IPTG濃度條件下誘導12h，以7000r·min^-1離心收集菌體沉淀，向菌體沉淀中加入30mL裂解液，反復凍融后進行超聲破碎，產(chǎn)物在7000r·min^-1離心收集上清，先后加入2、4、6、8mol·L^-1尿素重懸沉淀并離心收集上清，各取40μL制樣通過SDS-PAGE驗證重組蛋白可溶性，并使用HisTrap HP層析柱純化蛋白。

1.6 rEiMIC2免疫印跡分析

重組蛋白經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)至0.45μm的PVDF膜上，TBST洗膜3次，每次5min，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，腸艾美耳球蟲陽性血清作為一抗以1∶100稀釋，4℃過夜孵育。一抗孵育結(jié)束后用TBST洗膜4次，加入1∶1000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG室溫孵育2h。最后用TBST洗膜4次后用DAB顯色液（北京索萊寶）顯色。

1.7 免疫保護效果評價

1.7.1 免疫分組和免疫程序

無球蟲感染的35日齡新西蘭幼兔共32只，分為未免疫未攻蟲組、未免疫攻蟲組、pET-32a（+）組和rEiMIC2免疫組。免疫接種部位為頸部皮下，共進行2次免疫，首次免疫為幼兔35日齡，并在首次免疫后14d進行第二次免疫。各組免疫劑量如表1所示，未免疫未攻蟲組和未免疫攻蟲組免疫注射1mL的無菌PBS；pET-32a（+）組注射100μg的pET-32a（+）空白載體蛋白；rEiMIC2免疫組每只分別注射100μg rEiMIC2。從幼兔35日齡起，每間隔1周進行1次稱重和采血直到免疫保護試驗結(jié)束；二免14d后，除去未免疫未攻蟲組其余3組每只新西蘭兔口服接種5×10⁴個腸艾美耳球蟲孢子化卵囊；攻蟲14d后安樂死所有新西蘭兔，收集直腸糞便、空腸和回腸。

1.7.2 相對增重率和料肉比

從新西蘭幼兔35日齡時開始，每間隔7d進行稱重用于計算攻蟲前的平均增重（ΔW1）和攻蟲后的平均增重（ΔW2），再通過平均增重計算相對增重率（relative weight gain ratio）。攻蟲結(jié)束后統(tǒng)計各組消耗的飼料總量以計算料肉比（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）。

ΔW1=各組二免14d后的平均體重-各組首次免疫時的平均體重；

ΔW2=各組攻蟲14d后的平均體重-各組二免14d后的平均體重；

相對增重率=各組的ΔW2/未免疫未攻蟲組的ΔW2×100%；

料肉比=攻蟲后消耗飼料總量/攻蟲后增重總量。

1.7.3 卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)

攻蟲14d后結(jié)束免疫保護試驗，收集直腸糞便用于計算每克糞便中的卵囊數(shù)（oocyst per gram，OPG）和卵囊減少率（oocyst decrease rate）^[16]。并根據(jù)存活率、相對增重率、病變值（表2）和卵囊值（表3）計算抗球蟲指數(shù)（Anticoccidial index，ACI）（表4）^[17]。

卵囊減少率=（未免疫攻蟲組的平均OPG-其余各組的平均OPG）/未免疫攻蟲組的平均OPG×100%；

ACI=（存活率+相對增重率）-（病變值+卵囊值）。

1.7.4 血清中特異性IgG抗體和細胞因子水平檢測

基于rEiMIC2使用間接ELISA方法^[18-19]檢測血清中特異性IgG抗體變化水平（蛋白稀釋比1∶100，二抗稀釋比1∶3000）。使用兔細胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）ELISA試劑盒（北京索萊寶）測定第二次免疫14d血清樣品中細胞因子水平，細胞因子的檢測均按照試劑盒說明書操作步驟進行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差（SD）”表示，多組間差異性比較方法采取單因素方差分析（one-way ANOVA），使用IBM SPSS statistics20.0進行統(tǒng)計分析。使用Jalview2.10.5和GraphPad Prism version8.0.2（GraphPad Software）進行作圖。

2 結(jié) 果

2.1 EiMIC2基因擴增和生物信息學分析

根據(jù)設計的腸艾美耳球蟲MIC2基因的上、下游引物，以腸艾美耳球蟲cDNA為模板進行PCR擴增，并與pET-32a（+）載體進行連接，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)EiMIC2基因序列完全一致（GenBank：OP805603），成功構(gòu)建pET-32a（+）-EiMIC2表達載體（圖1A）。

EiMIC2基因含1605bp的開放閱讀框，編碼534個氨基酸，預測分子質(zhì)量約為57.68ku，等電點為4.86，無信號肽，N端0～10aa為跨膜區(qū)，N端216～282aa、287～345aa、350～406aa、411～467aa、472～530aa之間包含5個TSP-1（Thrombospondin-1）結(jié)構(gòu)域。EiMIC2基因氨基酸序列與早熟艾美耳球蟲（Eimeria praecox）、堆型艾美耳球蟲（E.acervulina）、巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima）、毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）、布氏艾美耳球蟲（Eimeria brunetti）、緩艾美耳球蟲（Eimeria mitis）和柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）微線蛋白2氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，EiMIC2基因氨基酸序列與其他球蟲氨基酸同源性在60%左右（圖1B）。

2.2 EiMIC2原核表達、可溶性分析和蛋白純化

重組蛋白在IPTG誘導總濃度為0.5mmol·L^-1，溫度為18 ℃，誘導12h的條件下為最佳表達條件，rEiMIC2大小在75ku左右（包含載體蛋白）（圖2A）?？扇苄苑治鼋Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，rEiMIC2在上清和包涵體中均有表達，為可溶性表達。經(jīng)蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)和層析柱后，成功獲得較為單一的重組蛋白（圖2A）。

2.3 rEiMIC2免疫印跡分析

使用健康家兔血清作為一抗孵育后，rEiMIC2結(jié)果均無條帶信號產(chǎn)生，而使用感染腸艾美耳球蟲的家兔血清作為一抗，結(jié)果在預期大小位置有條帶信號產(chǎn)生（圖2B）。免疫印跡結(jié)果說明感染腸艾美耳球蟲的兔血清可以識別rEiMIC2。

2.4 rEiMIC2免疫保護試驗

2.4.1 臨床癥狀與病理變化

兩次免疫后各組均未出現(xiàn)明顯的不良反應?？诜臃N5×10⁴個腸艾美耳球蟲孢子化卵囊3d后未免疫攻蟲組、pET-32a（+）組和rEiMIC2免疫組兔均出現(xiàn)精神沉郁、軟便甚至下痢的癥狀，pET-32a（+）組和rEiMIC2免疫組各有1只兔分別在攻蟲后第6和第5天死亡。攻蟲后2周剖檢空腸和回腸發(fā)現(xiàn)，未免疫攻蟲組、pET-32a（+）組和rEiMIC2免疫組空腸和回腸有不同程度的增厚，腸壁有白色結(jié)節(jié)，未免疫攻蟲組、pET-32a（+）組甚至有白色結(jié)節(jié)連接成片。

2.4.2 平均增重、相對增重率和料肉比

如表5所示，各組免疫后攻蟲前平均增重（ΔW1）無明顯差異（Pgt;0.05）；攻蟲后平均增重（ΔW2）結(jié)果表明，攻蟲組和載體蛋白組平均增重分別為（438.28±81.60）g和（419.37±80.64）g，與未攻蟲組的平均增重（716.50±98.48）g和rEiMIC2免疫組的平均增重（530.00±90.18）g均存在顯著差異（Plt;0.05）。攻蟲組、載體蛋白組的相對增重率分別為61.17%和58.53%，rEiMIC2免疫組相對增重率為73.97%。未攻蟲組料肉比為3.00∶1，攻蟲組和載體蛋白組料肉比分別達到4.71∶1和4.95∶1，rEiMIC2免疫組3.98∶1。

未免疫攻蟲組、rEiMIC2免疫組各有1只實驗兔在攻蟲后分別在第6和第5天出現(xiàn)死亡。死亡兔在攻蟲前均為組內(nèi)體重最低，且每周平均增重也最低。

2.4.3 OPG、卵囊減少率和ACI

如表5所示，攻蟲14d后取各組糞便計算OPG和卵囊減少率。未攻蟲組糞樣中未檢出腸艾美耳球蟲卵囊；攻蟲組平均OPG達到（9.45±8.79）×10⁵，rEiMIC2免疫組平均OPG遠少于攻蟲對照組，卵囊減少率為69.98%。攻蟲組和載體蛋白組ACI值分別為88.37和91.83，rEiMIC2免疫組為136.97，rEiMIC2免疫組ACI值介于120和160之間，rEiMIC2具有中等保護效果。

2.4.4 血清中特異性IgG抗體水平檢測

首次免疫前，所有實驗兔血清中平均IgG抗體水平較低；rEiMIC2免疫組（圖4）的血清平均特異性IgG水平在首免后1周達到較高水平，二免后抗體水平繼續(xù)升高，隨后可維持在較高水平直至攻蟲后2周。在攻蟲前后，未免疫攻蟲組的特異性IgG水平?jīng)]有顯著變化，一直保持在較低水平，而pET-32a（+）組的特異性IgG水平在二免后1周特異性IgG水平達到最高值隨后下降。與未免疫攻蟲組相比，rEiMIC2免疫組實驗兔的血清平均特異性IgG抗體水平顯著高于未免疫攻蟲組（P＜0.05）。

2.4.5 細胞因子水平檢測

二免兩周后對血清細胞因子水平進行了評估（圖5）。rEiMIC2免疫組與未免疫攻蟲組和pET-32a（+）組在IL-4、IL-10和IFN-γ中比較差異不顯著（Pgt;0.05）。rEiMIC2免疫組血清中IL-2水平顯著低于未免疫攻蟲組（Plt;0.05），而pET-32a（+）組的IL-2水平介于rEiMIC2免疫組和未免疫攻蟲組之間（Pgt;0.05）。

3 討 論

腸艾美耳球蟲是兔球蟲主要的致病性蟲種之一，嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，而使用疫苗防控球蟲病是一種切實可行的方法^[18-20]。在球蟲疫苗當中，基因工程疫苗因生產(chǎn)成本低、安全性高成為研究熱門。

頂復門原蟲入侵宿主細胞需要眾多細胞器協(xié)同，微線體是其中位于蟲體頂端最小的分泌性細胞器，該細胞器分泌的微線蛋白（MICs）參與蟲體入侵過程的黏附和識別，在蟲體入侵過程中發(fā)揮重要作用^[21-22]。微線蛋白2（MIC2）是一種酸性蛋白質(zhì)，分布于子孢子和裂殖子頂端，在蟲體入侵過程中會被大量分泌至蟲體表面黏附宿主細胞^[23-24]。本研究將EiMIC2基因與7種球蟲MIC2基因氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，EiMIC2與其他7種球蟲MIC2基因相似度均在60%左右，但是在200～600aa位置與其他7種球蟲MIC2基因相似度較高，且在該段氨基酸序列內(nèi)8種球蟲都具有TSP-1結(jié)構(gòu)域。TSP-1是一種多功能糖蛋白黏附分子，參與免疫、細胞黏附和神經(jīng)元發(fā)育等功能^[25]。目前在雞球蟲中MIC2已經(jīng)被證明具有不錯的免疫保護效果。Hoan等^[26]鑒定了布氏艾美耳球蟲MIC2（EbMIC2）基因，并通過免疫保護試驗證明重組蛋白rEbMIC2可以為雞提供保護作用，能夠有效減少布氏艾美耳球蟲的卵囊排出量，減輕腸道病變。在巨型艾美耳球蟲MIC2的保護試驗上發(fā)現(xiàn)的結(jié)果也與之相似，雞免疫重組蛋白rEmMIC2后巨型艾美耳球蟲卵囊排出量明顯減少，卵囊減少率達到79.93%^[27]。

增重情況和卵囊減少率是評價保護效果的重要指標^[28-29]。本研究中，攻蟲后各組陸續(xù)有兔出現(xiàn)食欲不振和腹瀉癥狀，其中rEiMIC2免疫組和攻蟲組各有1只兔在出現(xiàn)腹瀉癥狀出現(xiàn)后不久死亡，其余兔在腹瀉癥狀緩解后雖未死亡，但攻蟲組和載體蛋白組兔的料肉比與未攻蟲組相比差異明顯。其原因是由于腸艾美耳球蟲屬于強致病性蟲種，其寄生部位位于宿主空腸和回腸上皮細胞，在子孢子入侵階段和裂殖生殖階段腸艾美耳球蟲會破壞宿主腸道結(jié)構(gòu)^[30-31]，擾亂腸道微生物群和代謝穩(wěn)態(tài)，繼發(fā)感染其他腸道病原導致死亡率增加^[32-33]，也會導致宿主對飼料的利用率下降，體重增長減緩。rEiMIC2免疫組的料肉比、相對增重率和卵囊減少率以及病變評分分別為3.98∶1、73.97%、69.98%和1.45，免疫保護效果表現(xiàn)更優(yōu)于攻蟲組和載體蛋白組，說明rEiMIC2能夠給宿主提供一定的保護作用。IL-2是多種細胞的生長因子，參與T細胞分化、B細胞發(fā)育和NK細胞活化，在機體的免疫反應中具有重要作用。IFN-γ由先天淋巴細胞和自然殺傷細胞分泌，在細胞免疫應答期間幫助宿主清除細胞內(nèi)病原體^[34]。在球蟲方面，IFN-γ和IL-2能夠促進蟲體從感染的宿主細胞中過早脫出^[35]，并且IL-2和IFN-γ作為免疫佐劑能夠增強疫苗的保護效果^[36]。IL-4作為一種典型的Th2細胞因子，負責調(diào)控體液免疫。IL-4可以有效地防御細胞外病原體，當暴露于細胞內(nèi)寄生蟲時，IL-4誘導的巨噬細胞的吞噬能力增強^[37]。IL-10是一種抗炎因子，它在調(diào)節(jié)免疫應答中起著重要作用。適度的IL-10產(chǎn)生有助于維持免疫平衡，防止過度的免疫反應，從而減少組織損傷^[38]。在本研究中，rEiMIC2免疫組的IFN-γ水平與其他組差異不顯著，但IL-2水平顯著低于未免疫攻蟲組，說明該蛋白可能不引起Th-1型免疫，在豬蛔蟲和西氏貝蛔蟲的重組抗原中也有類似的報道^[39-40]。本研究中，rEiMIC2免疫組血清IL-4和IL-10水平與其他組差異不顯著，但檢測抗體水平高于對照組。在之前的研究報道中，柔嫩艾美爾球蟲SAG4重組蛋白免疫組的IL-4和IL-10^[41]、堆型艾美爾球蟲MIC3重組蛋白免疫組的IL-2、IL-4水平與對照組相比也沒有明顯變化^[42]。然而通過對兔進行大型艾美爾球蟲MIC2重組蛋白的免疫后，發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-10和IFN-γ水平明顯高于對照組^[43]。這可能是由于兩個蟲種生物學特性之間的差異引起的，因為腸艾美爾球蟲具有比大型艾美爾球蟲更強的致病性^[2]。此外，EmMIC2蛋白的分子大小為18.69ku，而EiMIC2為57.68ku，這也表明它們之間的結(jié)構(gòu)與功能可能存在一定的差異。本研究中，rEiMIC2免疫組特異性IgG水平與未免疫攻蟲對照組對比，均具有顯著上升，雖然攻蟲后1周稍微下降，但總體保持較高水平且攻蟲后第2周繼續(xù)上升，與之前的研究報道相似^[43]，可見rEiMIC2可引發(fā)宿主體內(nèi)的體液免疫應答。因此，本次免疫保護試驗結(jié)果初步表明，EiMIC2可作為腸艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的候選抗原，為腸艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的開發(fā)研究提供了參考。

4 結(jié) 論

本研究成功表達并純化了腸艾美耳球蟲EiMIC2蛋白，然后進行了免疫保護性試驗。結(jié)果顯示rEiMIC2免疫兔后，能有效減少卵囊排出和增重損失，減輕腸道損傷，具有一定的保護效果。說明rEiMIC2可作為腸艾美耳球蟲基因重組亞單位疫苗的候選抗原。

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（編輯 范子娟）