產單核細胞李氏桿菌Lm4b_02325/26雙基因缺失株構建及部分生物學特性試驗

摘 要：旨在構建食源性產單核細胞李氏桿菌毒力島4（LIPI-4）中的抗轉錄終止子（Lm4b_02325）和未知蛋白（Lm4b_02326）基因的雙缺失株，研究Lm4b_02325/26基因對產單核細胞李氏桿菌（Listeria monocytogenes，LM）的部分生物學特性的影響。利用同源重組技術構建LM928ΔLm4b_02325/26雙缺失株，測定LM928和LM928ΔLm4b_02325/26雙缺失株在腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、不同EtOH濃度、不同NaCl濃度、不同pH、不同溫度下的D_600nm，繪制生長曲線；RT-qPCR檢測雙基因缺失前后體外BHI培養(yǎng)環(huán)境下部分毒力因子轉錄水平；平板計數測定其對鼠巨噬細胞RAW264.7的黏附、侵襲與胞內增殖情況；感染C57BL/6小鼠后檢測肝、脾、腦組織中的細菌數量。結果表明，成功構建具有遺傳穩(wěn)定性的雙缺失株LM928ΔLm4b_02325/26。在含0.5%～10%NaCl濃度和或3%～4.5%EtOH的培養(yǎng)基中，雙缺失株與野毒株生長沒有明顯差異，在pH=5條件下，雙缺失株的生長率顯著高于野毒株，pH=9條件下雙缺失株的生長率顯著低于野毒株。在不同溫度（4℃、37℃、42℃）BHI培養(yǎng)基中，雙缺失株與野毒株生長沒有明顯差異。Lm4b_02325/26基因雙缺失株在BHI培養(yǎng)基中毒力因子hly、inlC和PlcA極顯著上調（Plt;0.01），mpl、inlB、actA、inlP、PlcB、prfA、SigB、iap和inlA極顯著下調（Plt;0.01）；雙缺失株對RAW264.7細胞的黏附率（14.86%）和侵襲率（2.23%）明顯低于野毒株的黏附率（22.93%）和侵襲率（4.28%）（Plt;0.01）；3、6、12h時胞內增殖數量極顯著低于野毒株（Plt;0.01）；雙缺失株與野毒株感染小鼠后，載菌量在肝、脾中的數量沒有顯著差異，在腦組織中雙缺失株載菌量為10⁴，高于野毒株的10^3.07，差異極顯著（Plt;0.01）。綜上認為，LIPI-4的Lm4b_02325和Lm4b_02326基因參與LM毒力因子的表達和腦組織的定植能力，與弱酸強堿條件下適應力及對RAW264.7細胞的黏附、侵襲和胞內增殖有關。本研究為LIPI-4的功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：產單核細胞李氏桿菌；雙缺失株；黏附侵襲；胞內增殖；載菌量；生長曲線

中圖分類號：S852.61

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2578-10

收稿日期：2023-08-16

基金項目：國家自然科學基金（32160834；32160833；32260895）

作者簡介：任慧杰（1997-），男，河北邯鄲人，碩士生，主要從事動物傳染病診斷與防治研究，E-mail：2416113104@qq.com

*通信作者：馬 勛，主要從事病原微生物檢測及致病機理研究，E-mail：maxun779@126.com；王 靜，主要從事動物分子病原學與免疫學研究，E-mail：wjtry100@163.com

Construction and Partial Biological Characteristics Trial of Lm4b_02325/26

Double Gene Deletion Strain of Listeria monocytogenes

RENHuijie，MAXun^*，WANGJing^*，LIUCaixia，ZENGDongdong，KOULijun，

SHIWeidi，LüShuangfei，QIANRuixuan，GAOShengjie

（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi832003，China）

Abstract：The aim of this experiment was to construct adouble-deletion strain of antitranscriptional terminator（Lm4b_02325）and unknown protein（Lm4b_02326）in Listeria pathogenicity island4（LIPI-4）of foodborne Listeria monocytogenes（LM）.In order to study the effect of Lm4b_02325/26gene on somepartial biological characteristics of LM.LM928ΔLm4b_02325/26double-deletion strain was constructed by homologous recombination technology.The D_600nm of LM928and LM928ΔLm4b_02325/26double-deletion strains were detected under BHI，different EtOH and NaCl concentrations，different pH and different temperatures，and the growth curves were plotted.The transcription level of some virulence factors of LM in BHI culture were detected by RT-qPCR.The adhesion，invasion and intracellular proliferation of LM-infected murine macrophages RAW264.7were measured by plate count.And the bacterial load in liver，spleen and brain of C57BL/6mice infected with LM intraperitoneal injection were detectedmeasured by plate count.The results showed that，a genetically stable double-deletion strain LM928Δ Lm4b_02325/26was successfully constructed.In the medium containing0.5%～10%NaCl concentration andor3%～4.5%EtOH，there was no significant difference between the growth of LM928ΔLm4b_02325/26and LM928.The growth rate of LM928ΔLm4b_02325/26strain was significantly higher than that of LM928under the condition of pH5，and the growth rate of LM928Δ Lm4b_02325/26strain was significantly lower than that of LM928under the condition of pH9.In BHI medium at different temperatures（4℃，37℃，42℃），there was no significant difference between the growth of double-deficient strains and wild strains.The hly，inlC and PlcA genes of LM928Δ Lm4b_02325/26strain in BHI were significantly upregulated（Plt;0.01），while mpl，inlB，actA，inlP，PlcB，prfA，SigB，iap，and inlA genes were significantly downregulated（Plt;0.01）.The adhesion rate（14.86%）and invasion rate（2.23%）of LM928Δ Lm4b_02325/26strain to RAW264.7cells were significantly lower than those of wild strains（with adhesion rate of22.93%and invasion rate of4.28%）（Plt;0.01）.The number of bacteria in RAW264.7cells infected by LM928Δ Lm4b_02325/26strain was significantly lower than that of LM928strain at3，6and12h after infection（Plt;0.01）.In animal experiment，after the infection of mice，there was no significant difference in bacterial load between the two strains in the liver or spleen of mice，but in the brain tissue，the bacterial load of LM928Δ Lm4b_02325/26strain was10⁴，which was higher than that of the LM92810^3.07，and the difference was extremely significant（Plt;0.01）.In summary，the Lm4b_02325and Lm4b_02326genes of LIPI-4are involved in the expression of LM virulence factors and the colonization ability of brain tissues，and are related to adaptability under weak acid and strong base conditions and the adhesion，invasion and intracellular proliferation of LM to RAW264.7cells.This study lays abase for the functional study of LIPI-4.

Key words：Listeria monocytogenes; double deletion strain; adhesion invasion; intracellular proliferation; bacterial load; growth curve

*Corresponding authors：MA Xun，E-mail：maxun779@126.com; WANG Jing，E-mail：wjtry100@163.com

產單核細胞李氏桿菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種高發(fā)病率和死亡率的食源性病原菌，有很強的抗應激能力^[1]，可以在極端條件下存活，如pH4.5～9.6、4～42℃、高NaCl（10%NaCl）等^[2]，雖然相對于其他食源性感染，其感染率較低，但是其感染后的高病死率是其成為重大公共衛(wèi)生問題的重要原因^[3]。

LM大部分毒力基因都存在于毒力島中，目前發(fā)現的毒力島主要為LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3、LIPI-4。其中LIPI-1中包含prfA、plcA、actA、plcB、hly、mpl等毒力基因，LIPI-2是內化素基因；LIPI-3中包含lisA、lisG、lisH等毒力基因^[3]；Maury等^[4]于2016年發(fā)現產單核細胞李氏桿菌毒力島4（LIPI-4），并證實LIPI-4是對LM感染宿主中樞神經系統和胎盤起重要作用的毒力因子。LIPI-4由麥芽糖-6′-磷酸葡萄糖苷酶、抗轉錄終止子、與磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）系統相關的未知蛋白以及EIIA、EIIB、EIIC等6個基因組成^[3]，Maury等^[4]在將LIPI-4缺失后發(fā)現LM穿越血腦和血胎屏障的能力下降，對其他組織的定植沒有影響但沒有影響其定植其他組織的能力。LIPI-4中的Lm4b_02325編碼抗轉錄終止子^[5]，目前對于LM抗轉錄終止子的相關研究較少，不過對大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中的抗轉錄終止子BglG和LicT已有一定的研究基礎^[6]。其中，大腸桿菌的抗轉錄終止子（BglG）的功能是以二聚體的形式結合在Bgl轉錄物的特定位點，以此來穩(wěn)定RNA的二級結構使RNA聚合酶繼續(xù)轉錄^[7]。BglG的活化主要由HPr對其進行活化，PTS系統中的EⅡ通過磷酸化DomainＩ中的His101來抑制BglG的活性。BglG的調控由β-葡萄糖苷磷酸轉移酶（BglF）進行正向調控，PTS系統中的EI對其進行負向調控；Lm4b_02326已知是與LM PTS系統相關的未知蛋白，目前相關研究較少。LIPI-4中的Lm4b_02325（抗轉錄終止子）和Lm4b_02326（未知蛋白）能否影響LM的生長特性和毒力尚不清楚。因此，本研究利用同源重組技術構建Lm4b_02325/26基因的缺失株，為進一步研究LIPI-4在LM中的生物學特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及主要試劑

LM928株由新疆農墾科學院食品檢測中心分

離鑒定后交與本實驗室使用；溫敏穿梭質粒pKSV7由浙江大學動物科學學院分子微生物與食品安全實驗室饋贈；pMD19-T（Simple）載體、T4DNA連接酶和限制性內切酶（EcoR I、Pst I）均購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、5K DNAMarker、RNA提取試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、質粒小提試劑盒、2×Taq Master Mix（DyePlus）、DL2000Plus DNA Marker和Pfu DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Amp、HEPES、氯霉素、溶菌酶、慶大霉素和卡那霉素購自北京博奧拓達科技有限公司；腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基和發(fā)酵管購自青島海博生物技術有限公司；C57BL/6小鼠購自河南斯克貝斯生物科技有限公司。

1.2 引物設計與合成

參照GenBank中LM09-00558菌株全基因序列（登錄號：GCA_001565535.2）用PrimerPremier5.0軟件設計相關引物，基因擴增引物及雙缺失株鑒定引物見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 雙基因缺失株的構建

將-80 ℃凍存的LM928在BHI平板劃線，37 ℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落于液體BHI培養(yǎng)基中，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA并以之為模板，通過上游臂引物56-F1、56-R1（10mmol·L^-1）和下游臂引物56-F2、56-R2（10mmol·L^-1）分別擴增出ΔLm4b_02325/26的上游臂和下游臂后進行純化回收；通過重疊延伸PCR技術（Gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）法上、下游臂融合后用56-F1和56-R2擴增并純化回收得到雙缺失片段ΔLm4b_02325/26。將雙缺失片段克隆至pMD19-T質粒，雙酶切法和基因測序得到重組質粒pMD19-T-ΔLm4b_02325/26。將pMD19-T-ΔLm4b_02325/26重組質粒和pKSV7溫敏穿梭質粒用Pst I和EcoR I分別進行雙酶切后純化回收酶切產物。將酶切產物中pKSV7和ΔLm4b_02325/26在4 ℃條件下加入T4連接酶過夜連接，用冷、熱激法將連接產物pKSV7-ΔLm4b_02325/26轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中擴繁并保存。提取擴繁后含有pKSV7-ΔLm4b_02325/26質粒的大腸桿菌的重組質粒，電轉化法轉化到LM928的感受態(tài)細胞中，用含氯霉素抗性的BHI平板篩選陽性轉化菌，在含氯霉素抗性（10μg·mL^-1）的BHI液體培養(yǎng)基42 ℃恒溫搖床培養(yǎng)箱條件下同源重組傳代，在PCR鑒定同源重組完成后，30℃BHI條件下丟失pKSV7-ΔLm4b_02325/26質粒，獲取在氯霉素抗性下無菌落生長的菌體，通過對菌體PCR擴增和基因測序鑒定，獲得雙缺失株LM928ΔLm4b_02325/26，之后將LM928ΔLm4b_02325/26雙缺失株在37 ℃無抗性條件下傳15～20代，期間用旁外側引物對雙缺失株進行遺傳穩(wěn)定性PCR檢測。擴增上、下游臂PCR反應體系為50μL，其中dNTP Mix1 μL，2×phanta Max Buffer25μL，T4DNA連接酶1μL，DNA模板4μL，上、下游引物（10mmol·L^-1）均為2μL，ddH₂O補齊反應體系。擴增融合片段PCR反應條件為95 ℃預變性5min; 95 ℃變性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10min。

1.4 不同條件生長曲線測定

將LM928、LM928ΔLm4b_02325/26分別在BHI平板上劃線培養(yǎng)，分別挑取單菌落于不同NaCl濃度（0.5%、4.5%、7%和10%）、不同pH（pH=3、pH=5、pH=7和pH=9）、不同EtOH濃度（3%、3.5%和4.5%）的BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)，每隔2h取3個平行樣本于96孔細胞培養(yǎng)板中測定D_600nm值。另取單菌落于BHI液體培養(yǎng)基于不同溫度（4 ℃、37 ℃和42 ℃）的恒溫震蕩培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)，方法如上測定D_600nm值。

1.5 菌株黏附侵襲與胞內增殖試驗

將RAW264.7細胞接種于12孔板，在含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，待細胞生長至90%（細胞數量約2×10⁶個），將LM928、LM928ΔLm4b_02325/26以MOI=10侵染細胞，培養(yǎng)1h，PBS洗滌后，加入1mL0.2%的TritonX-100PBS溶液裂解細胞，收取黏附樣品；其余孔加入含100μg·mL^-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液，此時記為胞內增殖0h，繼續(xù)培養(yǎng)1h，PBS洗滌后，加入1mL0.2%的TritonX-100PBS溶液裂解細胞，收取侵襲樣品；其余孔加入含10μg·mL^-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)3、6、9和12h時收取胞內增殖樣品。每組樣品3個平行，采用梯度稀釋法和菌落計數法檢測，將BHI培養(yǎng)板37 ℃靜置培養(yǎng)24～36h后按照文獻[8-9]進行菌落計數及黏附率、侵襲率和胞內增殖菌量的計算。

1.6 LM928和LM928ΔLm4b_02325/26毒力基因轉錄水平檢測

收集在BHI中培養(yǎng)12h后的LM928和LM928ΔLm4b_02325/26，離心并收集菌體后倒入研缽（DEPC浸泡處理）后用液氮冷凍研磨，使用細菌總RNA抽提試劑盒提取LM928和LM928ΔLm4b_02325/26菌株總RNA，反轉錄收取對應cDNA并作為模板，按照陳健舜^[10]的qPCR方法檢測兩種菌株中毒力基因hly、prfA、actA、plcA、plcB、inlA、inlB、inlC和mpl的轉錄水平，利用GraphPadPrism8軟件對數據進行處理。

1.7 小鼠毒力試驗

將6～8周齡的C57BL/6小鼠隨機分為3組，試驗組每組6只，空白組3只，適應性飼養(yǎng)1周。將野毒株與缺失株接種于5mL BHI培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩過夜培養(yǎng)并離心富集菌體，PBS洗滌2次后稀釋至10⁷CFU，每只試驗鼠腹腔注射0.1mL菌液（10⁶CFU），空白對照鼠腹腔注射0.1mL PBS，試驗鼠實際感染劑量為2.1×10⁵CFU。飼養(yǎng)72h后安樂死小鼠并無菌條件下采集肝、脾和腦組織，在研缽中加入1mL PBS進行研磨。對研磨液稀釋后進行平板計數，統計小鼠肝、脾和腦組織的載菌量。

1.8 數據統計分析

細菌黏附率計算公式為：（胞內細菌數＋胞外細菌數）/加入孔內的細菌數×100%。侵襲率計算公式為：胞內細菌數/加入孔內的細菌數×100%。內增殖取對3、6、9和12h細胞裂解后平板計數結果取對數表示胞內增殖量。

試驗數據采用SPSS20.0軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 重組穿梭質粒pKSV7-ΔLm4b_02325/26的構建及鑒定

以LM928的DNA為模板，PCR擴增出Lm4b_02325/26基因上、下游同源臂，SOE-PCR融合后電泳結果與預期片段大小一致的上、下游同源臂產物分別為488和339bp，融合片段為827bp（圖1A）。將融合后的片段ΔLm4b_02325/26克隆到pMD19-T質粒并測序鑒定。將pMD19-T-ΔLm4b_02325/26和pKSV7質粒雙酶切后對產物進行純化回收，回收產物用T4DNA連接酶連接并構建pKSV7-ΔLm4b_02325/26重組質粒，再進行雙酶切鑒定，產物大小為827bp（圖1B），其與預期片段一致。證實pKSV7-ΔLm4b_02325/26重組質粒構建成功。

2.2 ΔLm4b_02325/26基因缺失株的構建及其遺傳穩(wěn)定性檢測

將重組質粒pKSV7-ΔLm4b_02325/26用電轉化法轉化到LM928的感受態(tài)細胞中，電轉后用56-F1和56-R2引物進行PCR檢測，得到對應目的條帶（827bp）。在42 ℃搖床培養(yǎng)與含氯霉素抗性條件下實現同源重組，用旁外側引物（56-DF、56-DR）進行PCR篩選重組成功的陽性菌，利用ΔLm4b_02325/26旁外側引物進行遺傳穩(wěn)定性檢測，電泳結果顯示均得到1318bp的條帶（圖1C）。表明構建成功的缺失株具有遺傳穩(wěn)定性。

2.3 BHI中生長曲線

LM928和LM928ΔLm4b_02325/26在BHI中37 ℃培養(yǎng)12h，缺失株LM928ΔLm4b_02325/26在生長適應期和對數生長期略低于野毒株LM928，在進入平臺期后差別較小（圖2）。

2.4 不同EtOH生長曲線

LM928和LM928ΔLm4b_02325/26在不同EtOH濃度的條件下，其生長適應期隨著EtOH濃度的升高而延長，其中3%EtOH濃度的生長適應期區(qū)間為4h，3.5%EtOH濃度的生長適應期區(qū)間為6h，4.5%EtOH濃度的生長適應期區(qū)間為10h。4.5%EtOH LM928ΔLm4b_02325/26略微比LM928高，但差異不顯著（圖3）。

總體表明Lm4b_02325/26基因的缺失對LM928在不同EtOH濃度條件下生長特性無顯著影響。

2.5 不同NaCl濃度生長曲線結果

LM928和LM928ΔLm4b_02325/26在不同NaCl濃度的條件下，其生長適應期隨著NaCl濃度的升高而延長，其中0.5%NaCl濃度的生長適應期區(qū)間為2h，4.5%NaCl濃度的生長適應期區(qū)間為4h，7%NaCl濃度的生長適應期區(qū)間為6h，10%NaCl濃度則一直停留在生長適應期。0.5%NaCl濃度在8h結束對數生長期，4.5%和7%NaCl濃度的對數生長期一直持續(xù)到觀測結束的12h。7%NaCl濃度時LM928ΔLm4b_02325/26略低于LM928的生長速度，其他NaCl濃度的生長曲線差異不顯著（圖4）。

2.6 不同pH生長曲線

如圖5所示，在不同pH的條件下顯示酸性可以很好地抑制LM928和LM928ΔLm4b_02325/26的生長，而堿性條件下影響并不明顯。LM928在pH=5條件下的生長顯著遲緩（Plt;0.01），低于LM928ΔLm4b_02325/26；pH=9條件下10h之內差異不大，10h之后LM928ΔLm4b_02325/26的生長速度顯著低于野毒株（Plt;0.01）。

2.7 不同溫度生長曲線

如圖6所示，在不同溫度條件下，LM928和LM928ΔLm4b_02325/26在BHI培養(yǎng)基中的生長情況差異并不明顯。

2.8 LM928和LM928ΔLm4b_02325/26侵染RAW264.7細胞黏附侵襲及胞內增殖

LM928在缺失ΔLm4b_02325/26后黏附率和侵襲率明顯下降（Plt;0.01，圖7），并且在胞內增殖3、6和12h時胞內增殖數量顯著下降（Plt;0.01），但9h的差異不顯著（圖8）。

2.9 LM928和LM928ΔLm4b_02325/26體外培養(yǎng)毒力基因檢測

如圖9所示，雙基因缺失株毒力基因hly、inlC和PlcA極顯著上調（Plt;0.01），mpl、inlB、actA、inlP、PlcB、prfA、SigB、iap和inlA極顯著下調（Plt;0.01）。

2.10 組織載菌量

分別對感染后72h的C57BL/6小鼠組織器官研磨稀釋后進行平板計數，統計并計算肝、脾和腦組織中的細菌數量。結果顯示（圖10）試驗小鼠各組織內載菌量從高到低依次為肝、脾以及腦組織；缺失株和野毒株在肝和脾中載菌量比較相差不大（Pgt;0.05），缺失株在腦組織中載菌量與野毒株相較差異顯著（Plt;0.01）。

3 討 論

本試驗首先通過觀測LM928ΔLm4b_02325/26雙缺失株與野毒株在不同條件下生長曲線的差異，以探究雙基因缺失后對菌株生長特性的影響。Lm4b_02325/26基因的雙缺失并沒有影響野毒株在BHI培養(yǎng)基、不同鹽濃度、酒精濃度和不同溫度下的生長，但是缺失株在pH=5的條件下的生長速度高于野毒株，pH=9的生長速度要低于野毒株，表明Lm4b_02325/26基因參與LM的酸堿適應性。

RAW264.7細胞侵染試驗中缺失株黏附率和侵襲率及胞內增殖數均相較于野毒株降低。inlA和inlB的下調導致了LM在黏附和侵襲能力上的下降，這可能是雙缺失株感染RAW264.7黏附侵襲率下降的原因之一。細菌的胞內增殖能力取決于LM從吞噬體逃逸能力和基于actA的胞間傳播能力^[11]。有研究表明，inlB可以促進LM從吞噬細胞的吞噬體中逃逸^[12]從而進入胞漿進行增殖，而actA可以促進LM在細胞間的傳播，Lm4b_02325/26導致的胞內增殖的下降可能與其對inlB和actA的下調有關。

用菌株感染小鼠并檢測組織載菌量的試驗中，缺失株在腦組織中的載菌量相較于野毒株顯著增多的結果與Maury等^[4]在缺失LIPI-4后的結果相反，表明Lm4b_02325/26可能是抑制LIPI-4功能的基因。有研究表明inlC可以增強LM在侵染腦組織后，通過緩解皮質張力的作用提高LM在腦組織中的傳播能力^[13]，從而導致缺失株在腦組織中載菌量升高。

在缺失Lm4b_02325/26后毒力基因prfA極顯著下調，有研究表明prfA通常正向調控大部分毒力基因的轉錄水平^[14-15]，比如inlA、inlC和actA^[16]。但是LM928Lm4b_02325/26雙缺失株在下調prfA的同時卻極顯著上調hly和inlC。在劉彩霞等^[17]缺失EIIC后的結果是hly和inlC極顯著下調，相同的是PlcA均上調。證明inlC與hly的轉錄除受到prfA調控外還有其他調控機制共同調節(jié)。

4 結 論

本研究成功構建產單核細胞李氏桿菌Lm4b_02325/26雙基因缺失株，并在此基礎上發(fā)現LIPI-4的Lm4b_02325和Lm4b_02326基因參與LM毒力因子的表達和對腦組織的定植能力，與弱酸強堿條件下適應力及對RAW264.7細胞的黏附、侵襲和胞內增殖有關。

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006.（in Chinese）

（編輯 范子娟）