宏基因組技術(shù)診斷親內(nèi)皮皰疹病毒感染致瀕危亞洲象死亡病例

摘 要：本研究旨在借助宏基因組測(cè)序分析技術(shù)快速發(fā)現(xiàn)引起瀕危亞洲象死亡的可能病原，再結(jié)合常規(guī)診斷技術(shù)，對(duì)大象病因進(jìn)行分析和確診，為大象相關(guān)疫病的快速診斷和預(yù)防提供參考。對(duì)死亡大象進(jìn)行尸檢，取心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、肌肉、胃、十二指腸、空腸、結(jié)腸、盲腸、胰腺等器官制備切片，進(jìn)行HE染色和病理切片分析；取腹股溝淋巴結(jié)進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析；使用特異性PCR方法對(duì)特征基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)繪制進(jìn)化樹，分析其與其他毒株的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示，死亡大象的剖檢和病例切片結(jié)果符合象親內(nèi)皮皰疹病毒感染的特征，宏基因組分析結(jié)果顯示，大象的腹股溝淋巴結(jié)中含有大量的象β皰疹病毒1型（即親內(nèi)皮皰疹病毒）。該大象死亡的原因可能是象親內(nèi)皮皰疹病毒感染所致，宏基因組技術(shù)對(duì)大象親內(nèi)皮皰疹病毒感染以及其他瀕危動(dòng)物病例的快速診斷具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：亞洲象；親內(nèi)皮皰疹病毒；宏基因組分析

中圖分類號(hào)：S858.93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2569-09

收稿日期：2023-09-18

基金項(xiàng)目：重大外來動(dòng)物疫病阻斷與防控技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目（2022YFD1800500）

作者簡(jiǎn)介：沈青春（1976-），男，湖北麻城人，正高級(jí)獸醫(yī)師/研究員，博士，主要從事動(dòng)物支原體、布魯氏菌病流行病學(xué)與防控技術(shù)及生物信息學(xué)研究，E-mail：shenqingchun@caas.cn；劉 青（1983-），山東威海人，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事野生動(dòng)物疾病檢測(cè)工作，E-mail：liuqing0631@163.com；仉 偉（1979-），山東泰安人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事野生動(dòng)物疾病防治工作，E-mail：13176688152@163.com。沈青春、仉偉和劉青為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：范學(xué)政，主要從事人畜共患病、重大傳染病獸用新型疫苗、新型診斷試劑研發(fā)工作，E-mail：fanxuezheng@caas.cn；李 偉，主要從事野生動(dòng)物疾病相關(guān)研究，E-mail：1279257279@qq.com

Diagnosis of Death Cases of an Endangered Asian Elephants Caused by Endothelial

Herpesvirus Infection with Metagenomic Technology

SHENQingchun¹，ZHANGWei²，LIUQing²，LIUYiduo³，QIANJiahao¹，ZHANGBoyuan¹，

ZHOUShizhong¹，ZHANGYichen¹，XINGQianru¹，DINGJiabo¹，ZHOUXiangmei³，

ZHANGGuangzhi¹，LIQiuchen¹，LIWei^2*，F(xiàn)ANXuezheng^1*

（1.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，

China; 2.Jinan Park Development Service Center，Jinan250099，China; 3.College of

Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Abstract：This study aims to use metagenomic sequencing analysis technology to quickly diagnose the possible pathogens causing the death of an Asian elephant，and then combine with conventional diagnostic techniques to analyze and confirm the etiological cause of elephant diseases，so as to provide reference for rapid diagnosis and prevention of elephant-related diseases.Autopsies were performed on dead elephant，and organs such as the heart，liver，spleen，lungs，kidneys，lymph nodes，muscles，stomach，duodenum，jejunum，colon，cecum，and pancreas were removedcollected and sectioned for HE staining and pathological analysis; Metagenomic sequencing analysis was performed on the inguinal lymph nodes; species-specific PCR were used to amplify and sequence the characteristic genes，and an evolutionary tree was drawn to analyze its phylogenetic relationship with other strains.Data showed that necropsy and case biopsy results of dead elephant are consistent with the clinical characteristics of endothelial herpesvirus infection in elephants.Metagenomic analysis detected alarge number of elephant betaherpesvirus type1（i.e.，parent endothelial herpes virus）in the inguinal lymph nodes of elephants.The death of the elephant was probably caused by endothelial herpesvirus infection.Metagenomic technology offers valuable application prospects for the rapid diagnosis of endothelial herpesvirus infection in elephants as well as other endangered animal clinical infectious cases.

Key words：Asian elephant; endothelial herpesvirus; metagenomic analysis

*Corresponding authors：FAN Xuezheng，E-mail：fanxuezheng@caas.cn; LI Wei，E-mail：1279257279@qq.com

亞洲象（Elephas maximus）為瀕危物種，全球僅存約5萬頭，其中我國(guó)境內(nèi)僅有約300頭^[1-2]。多種原因?qū)е聛喼尴蟮姆N群數(shù)量不斷下降，傳染性疾病給亞洲象保育工作帶來新的打擊，其中，象親內(nèi)皮皰疹病毒（elephant endotheliotropic herpesviruses，EEHV）感染可導(dǎo)致系統(tǒng)性出血性疾病，造成亞洲象急性死亡，致死率極高，是威脅亞洲象種群數(shù)量增長(zhǎng)的主要因素之一^[3-5]。2023年3月，某公園一頭圈養(yǎng)亞洲小公象不明原因突然死亡，排除飼料中毒等因素，作者借助宏基因組測(cè)序技術(shù)^[6]、特異PCR驗(yàn)證、基因同源性分析、病理學(xué)分析等，證明該象是由象親內(nèi)皮皰疹病毒1A型引起。本文對(duì)該起病例進(jìn)行了回顧性分析，以便為以后的防治工作提供參考。

1 發(fā)病情況

亞洲公象，2歲10個(gè)月，既往健康，膘情良好，突然發(fā)病經(jīng)搶救無效死亡，發(fā)病前無明顯癥狀，經(jīng)觀察皮張完整，無外傷；平躺，無掙扎痕跡；眼結(jié)膜、舌面發(fā)紺，初步排除飼料中毒等因素。

2 尸體剖檢與實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

2.1 尸體剖檢

按臨床一般程序進(jìn)行腹腔和胸腔剖檢，觀察各臟器大概病變情況，并采樣用于病理分析和檢測(cè)。

2.2 病理分析

取心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、肌肉、胃、十二指腸、空腸、結(jié)腸、盲腸、胰腺等組織，剪成1～2cm大小，浸入10%福爾馬林中固定12h，制備病理切片，然后采用HE染色，并進(jìn)行病理學(xué)分析。

2.3 宏基因組測(cè)序

取腹股溝淋巴結(jié)使用深圳華大智造科技股份有限公司生產(chǎn)的高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序，主要過程如下：提取核酸樣本，取1μg DNA，經(jīng)過DNA酶切片段化，片段篩選，末端修復(fù)、連接index接頭，環(huán)化、文庫富集、酶切消化、建立環(huán)形文庫。再經(jīng)過滾環(huán)復(fù)制，生成DNA納米球，通過MGISEQ-2000RS測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行2*150bp測(cè)序。將獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)使用KneadData流程（https：∥bitbucket.org/biobakery/kneaddata）進(jìn)行處理，采用Trimmomatic對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行質(zhì)控^[7]，再通過bowtie2建立亞洲象基因組（NCBI參考基因組GCF_024 166 365.1）的宿主庫^[8]，經(jīng)比對(duì)去除去宿主核酸序列，使用Kraken2對(duì)比到古菌archaea、細(xì)菌bacteria、載體UniVec_Core、病毒viral數(shù)據(jù)庫中^[9-10]，獲得物種及豐度信息，使用Krona對(duì)其進(jìn)行可視化展示^[11]。

2.4 特異PCR驗(yàn)證及測(cè)序

取脾、肝、腎、腸系膜淋巴結(jié)提取核酸，與宏基因組測(cè)序中提取的核酸樣本一起，參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行特異PCR驗(yàn)證^[12]，將PCR擴(kuò)增的目的條帶送公司測(cè)序。

2.5 Blast比對(duì)及同源性分析

將測(cè)序所得序列去除兩端引物序列，截取中間484bp序列，在NCBI上利用Blast模塊檢索同源序列，設(shè)置覆蓋率（Query coverage）為100%，檢索出62條同源序列。利用MEGA7.0軟件繪制遺傳進(jìn)化樹，再經(jīng)iTOL在線工具（https：∥itol.embl.de/）優(yōu)化。

3 結(jié) 果

3.1 尸體剖檢

腹腔腸系膜有少量出血點(diǎn)，并伴有輕度水腫。

各段腸管漿膜均有大量出血斑點(diǎn)，尤以盲腸最為嚴(yán)重；胃、小腸（尤其回腸）黏膜腫脹，呈深紅色的彌漫性斑塊狀或點(diǎn)狀出血；盲腸和結(jié)腸黏膜出血，但程度較輕。胰腺腫大、散布點(diǎn)狀與斑塊出血；肝質(zhì)量30kg，表面有少量出血點(diǎn)；脾長(zhǎng)150cm，表面有出血點(diǎn)；腎包膜散布少量出血斑點(diǎn)。心包大量積液，質(zhì)地透明清亮；心肌松軟，心內(nèi)外膜、心肌出現(xiàn)大面積出血點(diǎn)斑。肺表面有少量出血斑點(diǎn)，切面基本正常。部分臟器病變見圖1。

3.2 病理組織學(xué)分析

各臟器均呈現(xiàn)嚴(yán)重/中度的出血，有炎性浸潤(rùn)，主要病變集中于血管：血管內(nèi)皮腫脹脫落，血管管壁平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松，可見透明血栓和混合血栓形成。本例動(dòng)物的病理變化以血液循環(huán)障礙為主，包括水腫、充血、淤血、出血和彌散性血管內(nèi)凝血等多種病理表現(xiàn)，出血性病變?yōu)槠渥钪饕奶卣?。具體如下：

心外膜大量出血，心肌纖維嗜伊紅深染，排列紊亂，結(jié)構(gòu)疏松，心肌間有大小不一的出血灶，可見部分心肌間有粉染的纖維蛋白（圖2A），血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、壞死脫落（圖2B）。

肝：低倍鏡下，可見肝臟被膜及實(shí)質(zhì)出血，實(shí)質(zhì)嚴(yán)重出血、淤血。高倍鏡下可見，肝細(xì)胞輕微腫脹，顆粒變性，排列紊亂，間質(zhì)增寬，其間充斥紅細(xì)胞及少量炎性細(xì)胞，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞（圖2C）；部分血管充血、淤血，周圍疏松水腫，可見一大血管破裂，破裂的血管中有血栓形成（圖2D）。

脾：脾嚴(yán)重出血，淋巴細(xì)胞彌漫性凋亡、壞死、崩解且明顯減少，脾小體幾近消失，僅在中央動(dòng)脈周圍殘留少量淋巴細(xì)胞; 紅髓中固有的細(xì)胞成分減少，脾髓內(nèi)充盈大量血液，小梁中的平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松。高倍鏡下，可見血管管壁平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松，血管內(nèi)皮變性脫落（圖2E）。

肺：肺間質(zhì)增寬；肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有的部位可見紅細(xì)胞黏集，可見透明血栓（圖2F）；細(xì)支氣管可見大量脫落的上皮細(xì)胞、藍(lán)染黏液及炎性細(xì)胞（圖2G）。

腎：腎臟嚴(yán)重出血；腎間質(zhì)增寬，充斥大量紅細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞從基底膜脫落，可見蛋白管型/細(xì)胞管型（圖2H）；腎小球毛細(xì)血管充血，有透明血栓形成。部分血管管壁平滑肌、膠原纖維和彈性纖維腫脹、溶解，排列疏松，血管內(nèi)皮變性脫落（圖2I）。

肌肉：肌纖維間隙增寬，纖維間可見出血及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2J）。

淋巴結(jié)：淋巴細(xì)胞凋亡、壞死、消失，出血，皮髓結(jié)構(gòu)完全破壞，未見正常的淋巴小結(jié)?？梢娡淌杉t細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，還可見散在分布的嗜堿性藍(lán)染的淋巴細(xì)胞團(tuán)（圖2K）。

胃腸道：可見黏膜上皮壞死脫落，黏膜下層疏松水腫，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2L），肌層出血嚴(yán)重，肌纖維間隙明顯增寬，其間充斥大量紅細(xì)胞；炎性細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞。

根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道的相關(guān)癥狀及病理切片，以及以上鏡下表現(xiàn)推測(cè)，大象的死亡可能與毒血癥相關(guān)，結(jié)合急性死亡，推測(cè)可能為象親內(nèi)皮皰疹病毒（EEHV）感染引起出血性病變而導(dǎo)致。

3.3 宏基因組測(cè)序分析結(jié)果

取死亡大象的腹股溝淋巴結(jié)，提取核酸后，采用MGISEQ-2000RS-高通量PE150試劑盒（v3.1）構(gòu)建測(cè)序文庫，使用MGISEQ-2000RS測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行2*150bp測(cè)序，得到上下游原始數(shù)據(jù)各24 G，使用kneaddata、trimmomatic和bowtie2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和出宿主DNA處理后，再用kraken2進(jìn)行物種注釋和物種豐度信息計(jì)算，在使用krona進(jìn)行結(jié)果展示，如圖3。

從宏基因組分析結(jié)果來看，各分類物種中占比最大的為象β皰疹病毒1型（Elephantid betaherpesvirus1），其特異性核酸占總體核酸的6%，其次是布魯氏菌（Brucella），特異性核酸占比為1%。由于病毒基因組相對(duì)較小，6%特異性核酸的占比對(duì)應(yīng)的病毒數(shù)量則占絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，因而可以確定該大象感染了象β皰疹病毒1型，可能是大象的死亡原因。象β皰疹病毒1型（Elephantid betaherpesvirus1），又稱象親內(nèi)皮皰疹病毒（elephant endotheliotropic herpesviruses，EEHV），屬于Proboscivirus屬（即長(zhǎng)鼻動(dòng)物病毒屬）的成員^{[12，16]}。

結(jié)合臨床癥狀和病例切片檢測(cè)結(jié)果，可判斷該頭亞洲象是感染象親內(nèi)皮皰疹病毒（EEHV），出現(xiàn)敗血癥引起的急性死亡。

3.4 特異PCR驗(yàn)證及測(cè)序

取脾、肝、腎、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)淋巴結(jié)組織，提取核酸，進(jìn)行EEHV特異PCR擴(kuò)增，結(jié)果均擴(kuò)增出約537bp左右的特異條帶（圖4），證明其中含EEHV核酸成分。

3.5 Blast比對(duì)及同源性分析

Sanger測(cè)序所得序列通過Blast比對(duì)，共檢索出62條覆蓋率100%的序列，結(jié)果顯示與EEHV1A毒株高度同源（相似性96.7%～100%）。然后整理此次大象分離EEHV1A序列及62條檢索序列同源區(qū)484bp序列，最后通過MEGA7.0和iTOL繪制進(jìn)化樹，由此發(fā)現(xiàn)此次大象分離EEHV1A序列與歐美分離株（MF579 070.1、KT007 218.2、JF692 770.1、HM568 510.1）進(jìn)化關(guān)系較近，相似性達(dá)100%，對(duì)應(yīng)的毒株名稱為IP222、North American NAP72、European EP14、North American NAP11（圖5）。

4 討 論

亞洲象為瀕危物種，我國(guó)存量稀少，極為珍貴。傳染性疾病給亞洲象帶來極大威脅，其中，象親內(nèi)皮皰疹病毒感染可導(dǎo)致系統(tǒng)性出血性疾病，造成亞洲象急性死亡，致死率極高，是威脅亞洲象種群數(shù)量增長(zhǎng)的主要因素之一^[17-19]?；谄蕶z觀察，本病例以內(nèi)臟出血性病變?yōu)橹?。根?jù)病理分析，本起大象死亡可能與敗血癥相關(guān)，常見的引起象敗血癥的感染性病原體包括：象親內(nèi)皮皰疹病毒（EEHV）、大腸桿菌、沙門菌或金黃色葡萄球菌等。其中象親內(nèi)皮皰疹病毒（EEHV）是最常報(bào)道的導(dǎo)致象急性、致命性和出血性疾病的病原體。該病的臨床癥狀主要包括面部腫脹、舌發(fā)紺、血小板減少、單核細(xì)胞減少和內(nèi)臟器官出血^{[13，20]}。Perrin等^[21]對(duì)27例致命性大象嗜內(nèi)皮性皰疹病毒出血性疾病的回顧性分析顯示，EEHV感染引起明顯的彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）。本病例的病理結(jié)果與上述報(bào)道高度吻合。大象死亡歸因于廣泛的血管損傷和多器官功能障礙，包括嚴(yán)重的急性心肌出血和隨后的心力衰竭。Perrin等^[21]還發(fā)現(xiàn)在沒有細(xì)菌感染的情況下觀察到的全身炎癥可能與細(xì)胞因子釋放綜合征有關(guān)，并強(qiáng)調(diào)了EEHV病毒血癥期間研究細(xì)胞因子反應(yīng)和止血的必要性，支持抗炎治療與抗病毒治療和心血管支持聯(lián)合使用。

在北美，圈養(yǎng)的4個(gè)月至15歲的年輕活產(chǎn)亞洲象死亡中，60%是由EEHV造成的。該病的臨床病程非?？?，僅1～5d，表現(xiàn)為嗜睡、水腫和舌紫，病理檢查顯示各主要內(nèi)臟器官出現(xiàn)微血管損傷、出血和局變性壞死病變^[22-23]。EEHV樣皰疹病毒還不知道是否存在于象種之外，也沒有在細(xì)胞培養(yǎng)中被分離出來，沒有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，給EEHV的免疫機(jī)制、致病機(jī)制研究帶來障礙。

宏基因組測(cè)序技術(shù)（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是基于二代或三代高通量測(cè)序技術(shù)的一種新興微生物檢測(cè)鑒定技術(shù)，能夠快速識(shí)別病原微生物，在發(fā)現(xiàn)未知病原體、難以培養(yǎng)的病原體和疑難感染早期診斷方面有顯著優(yōu)勢(shì)^{[6，24-25]}。mNGS技術(shù)應(yīng)用于大象等野生動(dòng)物已有相關(guān)報(bào)道，主要用于腸道微生物調(diào)查及流行病普查，還沒有用于發(fā)病或死亡大象病例的病原學(xué)診斷的報(bào)道^[26-29]。由于缺乏敏感細(xì)胞系，象親內(nèi)皮皰疹病毒分離培養(yǎng)存在困難。本病例中，先由宏基因組測(cè)序?qū)Σ≡M(jìn)行識(shí)別，為病因快速精準(zhǔn)識(shí)別提供了技術(shù)手段。結(jié)合尸檢和病理切片結(jié)果及PCR驗(yàn)證和測(cè)序分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了該病例是由EEHV1A型引起的死亡。

在我國(guó)，亞洲象存量?jī)H300多頭，十分珍貴^[1]。鑒于該病感染率高、死亡快，無有效治療藥物，且大象野性強(qiáng)，難以接觸，對(duì)其進(jìn)行專項(xiàng)檢測(cè)，及早采取良好的預(yù)防措施就顯得極為重要。感染期間可采用抗炎治療與抗病毒治療和心血管支持聯(lián)合使用^[21]。另外，鑒于亞洲象種群少，病毒無敏感細(xì)胞，全病毒疫苗制備難度大，是否可采取亞單位疫苗或mRNA疫苗進(jìn)行免疫，值得探討。另一方面，要給斷奶后的小象提供營(yíng)養(yǎng)全面的飼料（特別要添加奶粉），增強(qiáng)其自身抵抗力；還要做好館舍日常消毒和監(jiān)測(cè)工作，防止患有皰疹病的人或帶毒成年象接觸小象引起感染。

保護(hù)象群自然棲息地，對(duì)其生存至關(guān)重要^[30]。我國(guó)對(duì)于瀕危野生動(dòng)物的關(guān)注度不斷增加，相關(guān)疫病監(jiān)測(cè)和針對(duì)性防控技術(shù)研究不斷深入，給類似疫病防控帶來福音，有利于延續(xù)大象這個(gè)物種。宏基因組測(cè)序分析技術(shù)用于對(duì)珍稀野生動(dòng)物的疫病調(diào)查和疑難病的快速診斷上，具有十分明顯的優(yōu)勢(shì)，無論其病因是細(xì)菌、病毒，還是真菌、寄生蟲等均具有較高的檢測(cè)率，有望成為瀕危珍稀野生動(dòng)物的保護(hù)和流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。

5 結(jié) 論

本病例中導(dǎo)致大象死亡的原因可能是象親內(nèi)皮皰疹病毒感染。宏基因組技術(shù)在對(duì)大象病料檢測(cè)中表現(xiàn)出了快速、準(zhǔn)確和廣譜的特點(diǎn)，在大象等瀕危珍稀野生動(dòng)物疫病的快速診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)（References）：

[1]俞懿春，邢 雪，邵玉姿.美麗中國(guó)，人與自然和諧共生[N].人民日?qǐng)?bào)，2023-08-06（03）.

YU YC，XING X，SHAO YZ.Beautiful China，harmonious co-existence of human and nature[N].People′s Daily，2023-08-06（03）.（in Chinese）

[2]國(guó)家林業(yè)和草原局宣傳中心.林草動(dòng)態(tài)：人與自然和諧共生，繪就美麗中國(guó)新畫卷[R/OL].[2023-08-19].http：∥www.forestry.gov.cn/lyj/1/lcdt/20230819/517998.html.

Propaganda Center of National Forestry and Grassland Administration.Dynamic forest and grass：Harmonious coexistence of man and nature，beautiful Chinese painting[R/OL].[2023-08-19].http：∥www.forestry.gov.cn/lyj/1/lcdt/20230819/517998.html.（in Chinese）

[3]HAYWARD GS.Conservation：clarifying the risk from herpesvirus to captive Asian elephants[J].Vet Rec，2012，170（8）：202-203.

[4]SAHOO N，SAHU SK，DAS AK，et al.Elephant endotheliotropic herpesvirus hemorrhagic disease outbreak in an Indian zoo[J].J Zoo Wildl Med，2021，52（4）：1286-1297.

[5]楊 念，張 立.象親內(nèi)皮皰疹病毒及其研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào)，2020，55（8）：4-6.

YANG N，ZHANG L.Elephant endothelial Herpesvirus and its research updates[J].Bulletin of Biology，2020，55（8）：4-6.（in Chinese）

[6]ZHANG P，CHEN Y，LI SY，et al.Metagenomic next-generation sequencing for the clinical diagnosis and prognosis of acute respiratory distress syndrome caused by severe pneumonia：a retrospective study[J].PeerJ，2020，8：e9623.

[7]BOLGER AM，LOHSE M，USADEL B.Trimmomatic：a flexible trimmer for Illumina sequence data[J].Bioinformatics，2014，30（15）：2114-2120，doi：10.1093/bioinformatics/btu170.

[8]LANGDON WB.Performance of genetic programming optimised Bowtie2on genome comparison and analytic testing（GCAT）benchmarks[J].BioData Min，2015，8（1）：1.

[9]WOOD DE，LU J，LANGMEAD B.Improved metagenomic analysis with Kraken2[J].Genome Biol，2019，20（1）：257.

[10]LU J，RINCON N，WOOD DE，et al.Metagenome analysis using the Kraken software suite[J].Nat Protoc，2022，17（12）：2815-2839.

[11]ONDOV BD，BERGMAN NH，PHILLIPPY AM.Interactive metagenomic visualization in aWeb browser[J].BMC Bioinformatics，2011，12：385.

[12]LATIMER E，ZONG JC，HEAGGANS SY，et al.Detection and evaluation of novel herpesviruses in routine and pathological samples from Asian and African elephants：identification of two new probosciviruses（EEHV5and EEHV6）and two new gammaherpesviruses（EGHV3B and EGHV5）[J].Vet Microbiol，2011，147（1/2）：28-41.

[13]GUNTAWANG T，SITTISAK T，KOCHAGUL V，et al.Pathogenesis of hemorrhagic disease caused by elephant endotheliotropic herpesvirus（EEHV）in Asian elephants（Elephas maximus）[J].Sci Rep，2021，11（1）：12998.

[14]GUNTAWANG T，SITTISAK T，SRIVORAKUL S，et al.Development of an immunochromatographic strip test for antigen detection of elephant endotheliotropic herpesvirus in Asian elephants（Elephas maximus）[J].J Virol Methods，2023，311：114627.

[15]KOCHAKUL V，BOONSRI K，TIWANANTHAGORN S，et al.Development of in situ hybridization for detection of elephant endotheliotropic herpesvirus in Asian elephants[J].J Vet Diagn Invest，2018，30（4）：628-632.

[16]DAVISON AJ，EBERLE R，EHLERS B，et al.The order Herpesvirales[J].Arch Virol，2009，154（1）：171-177.

[17]PAVULRAJ S，ESCHKE K，PRAHL A，et al.Fatal elephant endotheliotropic herpesvirus infection of two young Asian elephants[J].Microorganisms，2019，7（10）：396.

[18]OO ZM，AUNG YH，AUNG TT，et al.Elephant endotheliotropic herpesvirus hemorrhagic disease in Asian elephant calves in logging camps，Myanmar[J].Emerg Infect Dis，2020，26（1）：63-69.

[19]HARDMAN K，DASTJERDI A，GURRALA R，et al.Detection of elephant endotheliotropic herpesvirus type1in asymptomatic elephants using TaqMan real-time PCR[J].Vet Rec，2012，170（8）：205.

[20]SITTISAK T，GUNTAWANG T，SRIVORAKUL S，et al.Response of elephant peripheral blood mononuclear cells when stimulated with elephant endotheliotropic herpesvirus glycoprotein B（EEHV-gB）[J].Vet Immunol Immunopathol，2023，258：110577.

[21]PERRIN KL，KRISTENSEN AT，BERTELSEN MF，et al.Retrospective review of27European cases of fatal elephant endotheliotropic herpesvirus-haemorrhagic disease reveals evidence of disseminated intravascular coagulation[J].Sci Rep，2021，11（1）：14173.

[22]RICHMAN LK，MONTALI RJ，CAMBRE RC，et al.Clinical and pathological findings of anewly recognized disease of elephants caused by endotheliotropic herpesviruses[J].J Wildl Dis，2000，36（1）：1-12.

[23]RICHMAN LK，MONTALI RJ，GARBER RL，et al.Novel endotheliotropic herpesviruses fatal for Asian and African elephants[J].Science，1999，283（5405）：1171-1176.

[24]PAN TT，TAN RM，QU HP，et al.Next-generation sequencing of the BALF in the diagnosis of community-acquired pneumonia in immunocompromised patients[J].J Infect，2019，79（1）：61-74.

[25]HAN DS，LI R，SHI JP，et al.Liquid biopsy for infectious diseases：a focus on microbial cell-free DNA sequencing[J].Theranostics，2020，10（12）：5501-5513.

[26]FERRARI G，LISCHER HE L，NEUKAMM J，et al.Assessing metagenomic signals recovered from Lyuba，a42，000-year-old permafrost-preserved woolly mammoth calf[J].Genes（Basel），2018，9（9）：436.

[27]GüLLERT S，F(xiàn)ISCHER MA，TURAEV D，et al.Deep metagenome and metatranscriptome analyses of microbial communities affiliated with an industrial biogas fermenter，a cow rumen，and elephant feces reveal major differences in carbohydrate hydrolysis strategies[J].Biotechnol Biofuels，2016，9：121.

[28]ILMBERGER N，GüLLERT S，DANNENBERG J，et al.A comparative metagenome survey of the fecal microbiota of abreast-and aplant-fed Asian elephant reveals an unexpectedly high diversity of glycoside hydrolase family enzymes[J].PLoS One，2014，9（9）：e106707.

[29]ZHANG CB，XU B，HUANG ZX，et al.Metagenomic analysis of the fecal microbiomes of wild Asian elephants reveals microflora and enzymes that mainly digest hemicellulose[J].J Microbiol Biotechnol，2019，29（8）：1255-1265.

[30]ZHANG L，DONG L，LIN L，et al.Asian elephants in China：estimating population size and evaluating habitat suitability[J].PLoS One，2015，10（5）：e0124834.

（編輯 白永平）