三株傳染性法氏囊病病毒重組毒株的致病性研究

摘 要：雞傳染性法氏囊病（IBD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起雛雞發(fā)病的一種高致病性免疫抑制性疾病，目前IBDV重組變異株性對雞養(yǎng)殖業(yè)有嚴(yán)重危害。本研究對三株傳染性法氏囊病病毒IBDV重組毒株進(jìn)行全基因序列分析并測定其致病性差異。通過雞胚分離鑒定并增殖三株病毒IBDV毒株，利用Mega11、MegAlign軟件與參考毒株進(jìn)行核苷酸同源性比對和氨基酸進(jìn)化樹繪制，將病原感染SPF雞測定致病性，用實時熒光定量PCR方法檢測臟器病毒拷貝量，結(jié)果顯示：GD-1株屬于A2dB3型，呈現(xiàn)新型變異A超強B特點，GD-2株和GD-3株同屬于A3B1型，分別呈現(xiàn)超強A新型變異B和超強A早期變異B特點；三株病毒均未引起雛雞死亡，GD-1株無明顯臨床癥狀，GD-2株和GD-3株在攻毒后7d出現(xiàn)精神沉郁，臥地不起；引起其法氏囊顯著萎縮、脾腫大，法氏囊載毒量要高于脾載毒量，在攻毒后第14天時GD-1株的法氏囊載毒量顯著高于GD-2株和GD-3株；三組試驗雞法氏囊濾泡均發(fā)生萎縮，且GD-2組和GD-3組病變更嚴(yán)重，脾則是GD-1組病變更嚴(yán)重。本研究測定三株病毒IBDV的序列、繪制進(jìn)化樹，測定致病性，顯示三株病毒都有新型變異株的變異趨勢，為研究病原IBDV致病機理和防控該病IBD提供參考。

關(guān)鍵詞：傳染性法氏囊病毒；序列分析；重組病毒；致病性

中圖分類號：S852.659.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2550-10

收稿日期：2023-07-18

基金項目：山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項目（2019L0371）

作者簡介：楊 坤（1998-），男，山西翼城人，碩士生，主要從事動物病毒學(xué)研究，E-mail：2560719098@qq.com

*通信作者：高詩敏，主要從事動物病毒學(xué)研究，E-mail：smgao@126.com

Pathogenicity of Three Recombinant Strains of Infectious Bursal Disease Virus

YANGKun，MAJingwen，ZHOUXinrui，LUOLiezhu，LIUZhe，

HUZiqiang，WUXingchen，LIANGLibin，GAOShimin^*

（College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）

Abstract：Infectious bursal disease is ahighly contagious，immunosuppressive disease of young chickens caused by infectious bursal disease virus（IBDV）.In recent years，recombinant IBDV mainly threats to the poultry industry.In our study，we characterized whole-gene sequence analysis of three recombinant strains of infectious bursal disease virus and assessed its pathogenicity in specific pathogen-free chickens.Three strains of virus were identified and amplified by chicken embryo isolation.The nucleotide homology and amino acid evolution tree were compared with the reference strain by Mega11and MegAlign software.The pathogen was infected with SPF chickens to determine the pathogenicity，and the viral copies in organs were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Phylogenetic analysis revealed that GD-1strain belonged to type A2dB3，and showed the characteristics of new variant A，very virulent B; Strain GD-2and strain GD-3belong to type A3B1，showed the characteristics of very virulent A，new variant Band very virulent A，early variant B.Pathogenicity assays showed that none of the three strains caused the death of chicks，GD-1strain had no obvious clinical symptoms，and GD-2strain and GD-3strain showed depression and lying on the ground7days after the attack.It caused significant atrophy of bursa of Fabricius and enlargement of spleen.The load of toxin in bursa of Fabricius was higher than that in spleen.On the day14days after challenge，the bursa of bursa of GD-1strain was significantly higher than that of GD-2strain and GD-3strain.Three groups of experimental chickens bursa of fabricius follicles are shrinking，and GD-2group and GD-3pathological changes is more serious，the spleen is aGD-1set of pathological changes is more serious.In this study，the sequence of the three strains was determined，the evolutionary tree was drawn，and the pathogenicity was determined.It may help to study the pathogenic mechanism and the prevention of infectious bursal virus in poultry.

Key words：infectious bursal disease virus; sequence analysis; recombinant virus; pathogenicity

*Corresponding author：GAO Shimin，E-mail：smgao@126.com

雞傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的雞的一種急性、高度接觸性疾病。IBDV主要損傷法氏囊（bursae of Fabricius，BF）中的B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致3～6周齡雛雞對其他病原體的感染概率上升并且產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制^[1]，甚至引起死亡。

IBDV屬于雙RNA病毒科，其基因組由A、B兩個節(jié)段組成，片段A編碼VP5、VP2、VP3、VP4，片段B僅編碼VP1^[2]。IBDV根據(jù)致病性差異分為兩種血清型，血清Ⅰ型可分為經(jīng)典毒株、變異毒株和超強毒株，血清Ⅱ型對雞不具有致病性^[3-4]。超強毒株（vvIBDV）在1989年率先在歐洲流行^[5-6]，隨后傳入我國并廣泛流行，死亡率達(dá)60%以上。但自2017年以來，我國多個省份相繼出現(xiàn)不同于早期IBDV變異株的新型IBDV變異株，感染雞出現(xiàn)亞臨床癥狀，可以逃避當(dāng)前疫苗保護(hù)，引起嚴(yán)重免疫抑制，降低雞的生產(chǎn)性能^[3，7]。近年來不斷報道的重組毒株是以超強毒株、新型變異毒株、經(jīng)典毒株為供體毒株組合而成，對雞的致病力也大不相同^[7]。

本研究對已經(jīng)分離出的三株雞傳染性法氏囊病毒進(jìn)行遺傳演化分析，并研究這三株病毒對雛雞的致病性差異，為進(jìn)一步研究其致病與免疫機制以及研發(fā)新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和毒株

DF-1細(xì)胞、三株IBDV毒株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實驗室保存。SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

Trizol、異丙醇、DEPC水購自天津凱通化學(xué)試劑有限公司；氯仿購自廣州化學(xué)試劑廠；2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）、HiScript II QSelect RT SuperMix for qPCR購自諾唯贊公司。

1.3 病毒擴(kuò)增及TCID₅₀的測定

將保存的三株病毒通過尿囊膜接種到9～10日齡SPF雞胚進(jìn)行增殖，3d后收集尿囊膜，研磨成勻漿進(jìn)行RT-PCR鑒定，無菌分裝后凍存于-80冰箱。將三株IBDV病毒液感染DF-1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)，盲傳至第五代出現(xiàn)細(xì)胞病變。把適應(yīng)細(xì)胞的病毒液按10^-1～10^-8倍比稀釋逐列加入鋪有DF-1細(xì)胞的96孔板，最后兩列為空白對照。逐日觀察到第7天記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計算病毒的TCID₅₀。

1.4 病毒全基因組序列的同源性及進(jìn)化樹分析

三株IBDV毒株由本實驗室施鑫娣^[8]通過接種SPF雞胚分離純化，其序列登錄號依次是OR493443、OR493444；OR493445、OR493448；OR493446、OR493447。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，從GenBank中選取參考序列（表1）。利用MegAlign對測序所得的3株IBDV與26株參考株分別進(jìn)行A片段與B片段的同源性分析和氨基酸序列分析，并利用MEGA11軟件的Neighbor-Joining法分別進(jìn)行A片段與B片段的遺傳進(jìn)化分析，Bootstrap值重復(fù)1000次。

1.5 三株IBDV毒株對SPF雞的致病性試驗

1.5.1 動物分組情況

將48只21日齡SPF雞隨機分成4組：GD-1組、GD-2組、GD-3組和空白組，每組12只。攻毒組通過滴鼻點眼接種純化好的病毒液，劑量為100TCID₅₀，0.1mL·只^-1，對照組以同樣途徑接種等量PBS。攻毒后分別在第3、7、11、14天每組隨機選三只解剖，記錄發(fā)病、死亡情況和剖檢變化，并從發(fā)病雞的組織器官中進(jìn)行病毒分離。

1.5.2 免疫器官指數(shù)測定

空腹稱重，采集各組雞第3、7、11、14天法氏囊、脾，進(jìn)行臟體比和臟器指數(shù)計算。免疫器官臟體比=（免疫器官重/體重）×100；囊體比=（法氏囊重/體重）×100；脾體比=（脾重/體重）×100。免疫器官指數(shù)=（試驗組免疫器官體比/對照組免疫器官體比）×100；囊指數(shù)=試驗組囊體比/對照組雞囊體比；脾指數(shù)=試驗組脾體比/對照組雞脾體比。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)囊指數(shù)＜0.7時判為法氏囊萎縮；免疫器官指數(shù)＞1.2時判為腫大。稱重后采集部分法氏囊、脾放入4％多聚甲醛中固定，送至公司制作病理切片。病變評分標(biāo)準(zhǔn)：0=無病變，1=出現(xiàn)的病變剛超過正常范圍，2=可以觀察到病變，但尚不嚴(yán)重，3=病變明顯，而且很可能更加嚴(yán)重，4=病變非常嚴(yán)重（病變已占據(jù)整個組織器官）。

1.5.3 三株IBDV重組毒株拷貝數(shù)測定

無菌采集各組雞第3、7、11、14天法氏囊和脾，RNA抽提完后反轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行熒光定量PCR。參照何秀苗等^[9]方法對法氏囊中IBDV拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測。構(gòu)建VP2基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18 T-VP2，引物序列為“VP2-F：ACCGGCACCGACAACCTTA；VP2-R：

CCCTGCCTGACCACCACTT”，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為117bp，并建立實時熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS、GraphPad prism軟件對囊指數(shù)、脾指數(shù)、器官病毒載量進(jìn)行統(tǒng)計分析，**表示差異顯著（Plt;0.01），***表示差異極顯著（Plt;0.001），ns表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 三株傳染性法氏囊病毒TCID₅₀的測定

三株IBDV毒株接種雞胚致死率為：GD-1株不致死雞胚，GD-2株和GD-3株對雞胚完全致死。利用Reed-Muench方法計算得到GD-1毒株TCID₅₀為10^-3.95·0.1mL^-1；GD-2毒株TCID₅₀為10^-4.5·0.1mL^-1；GD-3毒株TCID₅₀為10^-6.42·0.1mL^-1。

2.2 三株IBDV全基因組核苷酸同源性、特征性氨基酸位點比對及進(jìn)化樹分析

2.2.1 三株IBDV片段A、B核苷酸同源性比對

利用DNAStar軟件對三株毒株的片段A、B全長進(jìn)行核苷酸同源性比對。結(jié)果顯示GD-1毒株片段A與SHG19、SHG358新型變異毒株相似性為98.5％、99.0％。GD-2和GD-3毒株片段A與HLJ-0504超強毒株相似性分別為99.3％、97.1％。GD-1毒株片段B與HLJ-0504超強毒株相似性為98.9％，GD-2毒株片段B與SHG19新型變異毒株相似性為99.0％，GD-3毒株片段B與9109早期變異毒株相似性為99.7％。

2.2.2 三株IBDV片段A、B遺傳進(jìn)化樹分析

基于A片段的氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹顯示（圖1A），片段A被分為血清Ⅱ型和血清I型兩個分支：血清Ⅱ型不致??；血清I型的IBDV毒株可分為經(jīng)典毒株、弱毒株、變異毒株和超強毒株等不同分支。GD-1株與SHG19、SHG358新型變異毒株在同一分支上，其A片段來源于新型變異毒株，屬于A2d型；GD-2株與HLJ-0504超強毒株在同一分支上，其A片段來源于超強毒株，屬于A3型；GD-3株在超強毒株分支中形成一個單獨小分支，其A片段來源不確定，但仍屬于超強毒株分支，屬于A3型。

基于B片段的氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹顯示（圖1B），片段B被分為超強毒株、HLJ-0504like樣、經(jīng)典弱毒變異株三個分支。GD-1株與HLJ-0504位于同一分支上，其B片段來源于HLJ-0504like株，屬于B3型；GD-2株與SHG19位于同一分支上，其B片段來源于新型變異毒株，屬于B1型；GD-3株與9109位于同一分支上，其B片段來源于早期變異毒株，屬于B1型；A、B片段的氨基酸序列進(jìn)化樹與核苷酸同源性比對結(jié)果一致。

全基因序列分析顯示這三株毒均為重組毒株。GD-1毒株呈現(xiàn)新型變異A超強B特點，GD-2毒株呈現(xiàn)超強A新型變異B特點，GD-3毒株呈現(xiàn)超強A早期變異B特點。根據(jù)王雨龍^[10]建立的基因分型方法對該三株IBDV毒株進(jìn)行基因分型（表2）。

2.2.3 三株IBDV片段A、B氨基酸位點比對

利用DNA Star軟件對三株IBDV片段A的VP2-4-3、VP5以及片段B的VP1氨基酸進(jìn)行分析。VP2-4-3氨基酸比對顯示，GD-1株與新型變異株SHG19具有相同的氨基酸位點，包括73I、77D、79S、187V、212D、213N、221K、222T、242V、249K、252I、254N、256V、279N、294L、308I、318D、323E、384V、419Y、680C、685K、686I、715P、751H、922Q、951L。其中222T、249K、286I和318D是IBDV變異株的典型氨基酸位點。存在299S→G、610G→L、612A→S、614D→Y、875V→I突變的氨基酸位點。與早期變異株Variant-E相比，77D、79S、187V、221K、252I、254N、951L僅出現(xiàn)在新型變異株中。GD-2株與超強毒株HLJ-0504具有相同的氨基酸位點，包括222A、256I、279D、284A、294I、299S六個vvIBDV關(guān)鍵位點，存在308I→L、570 M→T突變的氨基酸位點。GD-3株與超強毒株HLJ-0504相比，六個vvIBDV關(guān)鍵位點中存在222A→V突變，還存在318G→D、323D→E、419Y→C、642K→R、744P→L突變，這些位點突變可能與其形成一個新的vvIBDV小分支有關(guān)。

VP5氨基酸比對顯示，GD-1株與新型變異株SHG19存在82S→P、131T→V突變。GD-2株和GD-3株與HLJ-0504相比未發(fā)生突變。

VP1氨基酸比對顯示，GD-1株與超強毒株HLJ-0504存在288L→M突變。GD-2株與新型變異株SHG19相比存在239V→A突變。GD-3株與早期變異株9109相比存在515E→D突變。

2.3 SPF雞致病性試驗

攻毒后，GD-1株未引發(fā)雞出現(xiàn)明顯臨床癥狀，GD-2、GD-3株在攻毒7d后引起雞出現(xiàn)精神沉郁，臥地不起。3株病毒均未引起雛雞死亡。

2.3.1 免疫器官指數(shù)測定及眼觀病變

三組攻毒組的囊指數(shù)在攻毒后第7和14天時與空白組相比存在極顯著差異（Plt;0.001）（圖2A）。三組攻毒組的脾指數(shù)在攻毒后第7天時，GD-2組和GD-3組與空白對照組相比存在極顯著差異（Plt;0.001），GD-1組差異雖不顯著，但其指數(shù)也是大于1.2；在攻毒后第14天時，三組攻毒組的脾指數(shù)與空白對照組相比存在顯著差異（Plt;0.01）（圖2B）。攻毒第14天后的法氏囊與空白組相比發(fā)生萎縮，脾發(fā)生腫大，其中GD-2組和GD-3組法氏囊呈現(xiàn)“紫葡萄”狀（圖2C）。

A.法氏囊指數(shù)；B.脾指數(shù)；C.攻毒第14天后法氏囊、脾眼觀病變圖

A.Bursa index of Fabricius; B.Spleen index; C.Ocular lesion map of bursa and spleen of Fabricius on day14of challenge

圖2 各組試驗雞免疫器官指數(shù)及攻毒第14天后臟器病變圖

Fig.2 The immune organ index and organ lesion map of chickens afteron day14of challenge were tested in each group

2.3.2 法氏囊和脾IBDV拷貝數(shù)測定

三組試驗雞法氏囊中的病毒載量均在攻毒后第7天達(dá)到最高，在攻毒后第14天時GD-1株的法氏囊載毒量要顯著高于（Plt;0.001）另外兩株（圖3A）。脾病毒載量在攻毒后7d達(dá)到最高，且整體趨于穩(wěn)定，但病毒載量始終沒有法氏囊中的病毒載量高（圖3B）。

2.3.3 病理組織切片觀察

GD-1組法氏囊可見淋巴濾泡內(nèi)少量空泡，且有上皮組織脫落，淋巴濾泡外逸（圖4B）。GD-2組和GD-3組法氏囊可見局灶性的濾泡萎縮，體積減小，淋巴組織減少，排列疏松，間隙增寬，其中GD-3組可見有出血（圖4C和D）?？瞻讓φ战M法氏囊濾泡結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量豐富，分界清晰，未見明顯異常（圖4A）。GD-1組脾組織可見較多的淋巴細(xì)胞壞死，胞核固縮深染，體積減小（圖4F）。GD-2組和GD-3組脾組織只是白髓處淋巴細(xì)胞減少，病變較輕（圖4G和H）。空白對照組脾組織紅白髓混合分布，未見明顯異常（圖4E）。

在法氏囊病變評分中GD-2組和GD-3組較高，GD-1組較低。在脾病變評分中GD-1組較高，GD-2組和GD-3組較低（圖4I）。

3 討 論

1957年，經(jīng)典IBDV在美國首次被發(fā)現(xiàn)，1985年，在美國又出現(xiàn)了IBDV早期變異株，能夠突破經(jīng)典毒株疫苗的保護(hù)^[11]。vvIBDV首次出現(xiàn)于1989年的歐洲，之后在全球范圍內(nèi)傳播，中國于1991年分離到vvIBDV^[12]。它能突破母源抗體的保護(hù)，攻擊雛雞法氏囊，使雛雞出現(xiàn)急性死亡^[13]。自2017年起，我國出現(xiàn)了不同于美國早期變異株的新型變異毒株（NvIBDV），感染雞臨床癥狀不明顯，但引起嚴(yán)重的免疫抑制，目前，我國主要流行的毒株是vvIBDV和NvIBDV^[14-15]。

導(dǎo)致出現(xiàn)新型變異毒株的內(nèi)在原因之一是IBDV基因組節(jié)段重組，雙節(jié)段的基因組使得其極易在不同毒株間發(fā)生重組現(xiàn)象^[16-18]。近年來，已報道許多重組毒株的出現(xiàn)，陳睿等^[19]分離到一株A3B3型（超強A獨特B）IBDV毒株，具有較強致病性。Cui等^[20]分離到一株A8B2型（弱A超強B）IBDV毒株，表現(xiàn)出更高的致病性。Jackwood等^[21]分離到一株A1B2型（經(jīng)典A超強B）IBDV毒株，致病力與經(jīng)典毒株相似。具有超強毒力的HLJ-0504like毒株長期以來是中國的主要流行毒株^[16]，通過長期的環(huán)境選擇和疫苗壓力下發(fā)生基因突變和節(jié)段重組，產(chǎn)生了新型變異A超強B和超強A新型變異B，黃宇^[22]分離到一株新型變異毒株（新型變異A超強B），該毒株法氏囊萎縮程度要高于nvIBDV。重組毒株的大量出現(xiàn)需要重新監(jiān)控IBDV的流行情況，并了解其分子特征。

目前，對IBDV分子流行病學(xué)研究集中片段A的VP2基因高變區(qū)，VP2基因與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原的變異以及毒力有關(guān)^[23]，VP2高變區(qū)氨基酸變化較大，因此對該區(qū)域的分子特征進(jìn)行研究不僅可以發(fā)現(xiàn)IBDV的抗原性變化，還可提供IBDV毒株遺傳進(jìn)化信息^[24]。在片段A氨基酸位點比對中，新型變異株SHG19在VP2高變區(qū)中具有212D、221K、222T、242V、249K、252I、254N、256V、279N、286I、294L、318D、323E這13個特征性氨基酸，其中氨基酸222T、249K、286I和318D已被證明與IBDV抗原變異密切相關(guān)^[25]。GD-1株的13個特征性氨基酸均符合以上特點，但299G不符合超強毒株、弱毒株特征，其具體功能尚未驗證。其中279（D→N）突變是IBDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)所必須的重要氨基酸位點之一^[26]。范林進(jìn)^[27]證實318D和323E氨基酸突變是IBDV新型變異株逃匿vvIBDV抗體中和活性的關(guān)鍵因素之一。存在2個不同于美國早期變異株的氨基酸^[25]（221K、252I），表明GD-1變異株屬于IBDV新型變異株。

GD-2和GD-3株VP2高變區(qū)的212N、249Q、256I、279D、284A、294I、299S均符合超強毒株HLJ-0504的特征^[28-31]。綜上，片段A氨基酸位點的分析說明GD-1株為新型變異株，GD-2和GD-3株為超強毒株。

在片段B VP1基因的編碼氨基酸位點分析中，GD-1毒株與超強毒株HLJ-0504僅存在一處突變，提示其片段B來自超強毒株。GD-2毒株與新型變異株SHG19僅存在一處突變，提示其片段B來自新型變異株。GD-3毒株與早期變異株9109僅存在一處突變，提示其片段B來自早期變異株。本研究的分離株在片段B氨基酸和片段A氨基酸上分類不一致，而片段B被認(rèn)為與病毒復(fù)制有關(guān)^[32-33]，片段A與病毒的抗原性、致病性有關(guān)。因此，對傳染性法氏囊病毒基因型分類時主要以片段A為主。

除此之外，本研究的毒力試驗和動物試驗證實了GD-1、GD-2、GD-3這三個病毒株能使雛雞發(fā)生明顯的感染癥狀和病變^[34]：腺胃肌胃交界處點狀出血，腿肌有出血點，法氏囊萎縮，脾腫大。在攻毒后第14天，GD-2和GD-3毒株感染雞法氏囊剖開后有出血點，GD-1毒株感染組雞剖開后有黃色膠凍樣流出。三組試驗雞均未發(fā)生死亡，但病理切片顯示法氏囊受到嚴(yán)重?fù)p傷，這可能與IBDV的兩個片段類型有關(guān)：GD-1毒株的新型變異A片段使得IBDV感染雞后不會顯示出明顯的臨床癥狀，而B片段是復(fù)制能力強的B3型，B3型使得其在攻毒后第14天時法氏囊載毒量顯著高于另外兩株。GD-2和GD-3毒株其B片段屬于復(fù)制能力弱的B1型，B1型使得其在攻毒后第14天時法氏囊載毒量顯著低于GD-1株，但超強A片段依然會使法氏囊損傷。高立^[35]證明超強毒株（B3型）的B片段可以促進(jìn)病毒在體內(nèi)外的復(fù)制，使IBDV的致病性增強。其拯救的rHuBAGtB和本文的GD-2、GD-3在基因分型上同屬于A3B1型，接種動物后剖檢未死亡雞，發(fā)現(xiàn)法氏囊萎縮，說明具有超強A片段和復(fù)制能力弱的B片段的IBDV仍然有較強致病性。

動物試驗中攻毒用的病毒液均為細(xì)胞適應(yīng)毒株，盡管組織毒與細(xì)胞毒之間存在適應(yīng)性突變，但是從實際可操作度上看，細(xì)胞適應(yīng)毒株還是有一定優(yōu)勢，方便在動物模型上評估其致病性。朱瑞良^[36]比較了vvIBDV GX8/99株原始毒（雞源囊毒）→雞胚毒→細(xì)胞適應(yīng)毒→細(xì)胞克隆化毒→回傳SPF雞傳代輪回過程中系列毒株致病性的變化規(guī)律，得到由強到弱，回傳SPF雞后又增強的規(guī)律。其動物攻毒試驗顯示各代次病毒均可引起法氏囊萎縮，脾腫大。崔言順^[37]認(rèn)為細(xì)胞適應(yīng)毒的氨基酸位點會發(fā)生改變，但這些位點改變僅限于細(xì)胞嗜性方面，適應(yīng)細(xì)胞的每一次改變都會提高感染性。祁小樂^[38]在建立IBDV反向遺傳系統(tǒng)時也是采用細(xì)胞適應(yīng)毒來研究VP2基因功能，其接種動物后法氏囊也是出現(xiàn)萎縮，胸肌、腿肌出血等癥狀。

4 結(jié) 論

三株重組IBDV的序列分析顯示，GD-1株呈現(xiàn)新型變異A超強B特點，GD-2株呈現(xiàn)超強A新型變異B特點，GD-3株呈現(xiàn)超強A早期變異B特點，且GD-2株、GD-3株具有向新型變異株進(jìn)化的趨勢。致病性上GD-1株無明顯臨床癥狀，GD-2株和GD-3株在感染雞后，雞出現(xiàn)臨床癥狀后又恢復(fù)正常。GD-2株和GD-3株對法氏囊損傷程度更嚴(yán)重，但GD-1株在法氏囊載毒量上要高于另外兩株。

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（編輯 孟 培）