單寧酸對脂多糖應激仔豬肝組織的功能、抗氧化能力和炎癥應答的影響

摘 要：旨在研究斷奶仔豬飼糧添加單寧酸（tannic acid，TA）對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）應激斷奶仔豬肝組織功能、抗氧化能力、炎癥應答反應及相關基因表達的影響。本試驗分為兩部分。第一部分選擇72頭體重相近、健康狀況良好的28日齡三元雜交（杜×長×大）斷奶仔豬，隨機分為2組，分別為基礎飼糧飼喂組（飼喂基礎飼糧）和單寧酸飼喂組（飼喂在基礎飼糧中額外添加1000mg·kg^-1單寧酸的試驗飼糧），每組6個重復，每個重復6頭豬，試驗期為28d。第二部分于第一部分試驗結(jié)束時，分別從基礎飼糧飼喂組和單寧酸飼喂組各選取12頭體重接近平均體重、健康狀況良好的56日齡仔豬，將其隨機分為4組，每組6頭仔豬。對照組（CON）和LPS應激組（LPS）的仔豬來自第一部分試驗的基礎飼糧飼喂組；單寧酸組（TA）和單寧酸+LPS組（TA+LPS）的仔豬來自第一部分試驗的單寧酸飼喂組。在仔豬56日齡早上8：00，給LPS組和TA+LPS組仔豬腹腔注射1.5mL濃度為1mg·mL^-1的LPS，給CON組和TA組仔豬腹腔注射1.5mL生理鹽水，注射1.5h后屠宰采樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS應激提高增加了仔豬的肝臟指數(shù)，增加提高了血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性，降低了仔豬肝組織過氧化氫酶（catalase，CAT）和總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）水平，提高了仔豬肝組織基因Kelch-1ike ECH-associated protein-1（Keap1）、Toll-like receptor4（TLR4）、Myeloid differentiation factor88（MyD88）、Nod-like receptor protein3（NLRP3）、Interleukin-6（IL-6）和Tumor necrosis factor-α（TNF-α）的表達水平，降低了Nuclear factor erythroid2-related factor2（Nrf2）、NADH Quinone Oxidoreductase1（NQO1）、Copper/zinc superoxide dismutase（Cu/Zn-SOD）、Manganese superoxide dismutase（Mn-SOD）和Catalase（CAT）的表達水平（Plt;0.05）。飼糧中添加TA可降低仔豬血清中AST和ALT水平，提高仔豬肝組織CAT和T-SOD水平，降低顯著影響仔豬肝組織IL-6、IL-10和TNF-α含量，下調(diào)仔豬肝組織基因Keap1、TLR4、MyD88、NLRP3、IL-6和TNF-α的表達水平，上調(diào)Nrf2、NQO1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的表達水平（Plt;0.05）。與CON組相比，TA+LPS組仔豬血清中AST的水平降低（Plt;0.05）。與LPS組相比，TA+LPS組血清中AST和ALT水平降低，IL-6和TNF-α含量減少，基因Keap1、TLR4、NLRP3、IL-6和TNF-α表達水平降低，Mn-SOD和CAT的表達量增加（Plt;0.05）。綜上，在本試驗條件下，單寧酸通過調(diào)節(jié)仔豬肝臟指數(shù)，改善肝抗氧化能力，抑制肝組織炎癥因子的分泌，調(diào)控Nrf2信號、TLR4信號和NLRP3炎癥小體信號相關基因表達，緩解LPS應激引起的仔豬肝應激損傷狀態(tài)。

關鍵詞：單寧酸；脂多糖；豬；肝；應激

中圖分類號：S828.5

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2519-11

收稿日期：2023-09-15

基金項目：浙江省領軍型創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊項目（2020R01015）；浙江省重點研發(fā)計劃項目（2021C02008）; 浙江省尖兵領雁計劃項目（2022C02059）；杭州市農(nóng)業(yè)和社會發(fā)展一般項目（202203B18）；浙江省重點農(nóng)業(yè)企業(yè)研究院項目（2021Y30004）

作者簡介：周琦璐（2003-），女，浙江諸暨人，本科生，主要從事動物營養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控研究，E-mail：zql04102022@163.com

*通信作者：張瑞強，主要從事動物營養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控研究，E-mail：zrq1034@163.com

Effects of Tannic Acid on Liver Tissue Function，Antioxidant Ability and

Inflammatory Response in Lipopolysaccharide Stressed Piglets

ZHOUQilu¹，LIUJinsong²，WUChao¹，YANGCaimei²，LIUYulan²，ZHANGRuiqiang^1*

（1.Zhejiang Provincial Engineering Laboratory for Animal Health Inspectionamp;Internet

Technology，Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of

Zhejiang Province，College of Animal Science and Technology，College of Veterinary

Medicine，Zhejiang Agricultural and Forestry University，Hangzhou311300，China;

2.Zhejiang Vegamax Biotechnology Co.Ltd，Vegamax Green Animal Health Products

Key Agricultural Enterprise Research Institute，Anji313300，China）

Abstract：This study aimed to investigate the effects of tannic acid added to the diet of weaned piglets on liver index，inflammatory response，antioxidant function，and related gene expression in weaned piglets under lipopolysaccharide stress.The trial was divided into two parts.In the first part，a number of7228-day-old ternary hybrid weaned piglets（Duroc×Landrace×Yorkshire）with similar weight and good health condition were randomly divided into2groups with6replicates each and6piglets per replicate.The basal diet feeding group was fed abasal diet，and the tannin feeding group was fed the basal diet supplemented with1000mg·kg^-1tannic acid for28days.At the end of the first part of the experiment，a total of12twelve56-day-old piglets with the body weight close to average weight were selected from the basal diet feeding group and the tannin feeding group，respectively，and then randomly divided into4groups of6piglets in each group.The piglets in control group（CON）and LPS stress group（LPS）were from the basal diet-feeding group of the first part of trial; The piglets in tannin group（TA）and the tannin+LPS group（TA+LPS）were from the tannin feeding group of the first part of trial.At8am of the day when the piglets are56-day-old，the piglets in the LPS group and TA+LPS group were injected intraperitoneally with1.5mL of LPS at aconcentration of1mg·mL^-1，and piglets in CON and TA groups were injected intraperitoneally with1.5mL of normal saline.After1.5h of injection，piglets were slaughtered and sampled.The results showed that，LPS stress increased the liver index，enhanced serum aspartate aminotransferase（AST）and alanine aminotransferase（ALT）levels，decreased catalase（CAT）and total superoxide dismutase（T-SOD）activities in liver，and enhanced the mRNA levels of Kelch-1ike ECH-associated protein-1（Keap1），Toll-like receptor（TLR4），Myeloid differentiation factor88（MyD88），Nod-like receptor protein3（NLRP3），Interleukin-6（IL-6）and Tumor necrosis factor-α（TNF-α），reduced the mRNA levels of Nuclear factor erythroid2-related factor2（Nrf2），NADH Quinone Oxidoreductase1（NQO1），Copper/zinc superoxide dismutase（Cu/Zn-SOD）、Manganese superoxide dismutase（Mn-SOD）and Catalase（CAT）of liver in piglets（Plt;0.05）.The addition of TA to the feed reduced the levels of AST and ALT in serum，increased the levels of CAT and T-SOD of liver，and reducedsignificantly affect the contents of IL-6，IL-10and TNF-α in liver，and down-regulated the mRNA levels of Keap1，TLR4，MyD88，NLRP3，IL-6and TNF-α in liver，and up-regulated the mRNA levels of Nrf2、NQO1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD and CAT in liver of piglets（Plt;0.05）.Compared with the CON group，the decreased level of AST was displayed in serum of piglets in TA+LPS group（Plt;0.05）.Compared with the LPS group，the serum AST and ALT levels decreased in TA+LPS group，the contents of IL-6and TNF-α reduced，the expression levels of genes Keap1，TLR4，NLRP3，IL-6and TNF-α decreased，and the expression levels of Mn-SOD and CAT increased in liver of piglets（Plt;0.05）.In conclusion，under the circumstances of the current study，tannic acid can alleviate the liver stress damage state caused by LPS stress through improving the liver index，enhancing liver antioxidant capacity，inhibiting the secretion of liver inflammatory factors，and regulating the expression of genes related to Nrf2signaling，TLR4signaling and NLRP3inflammasome signaling.

Key words：tannic acid; lipopolysaccharide; pig; liver; stress

*Corresponding author：ZHANG Ruiqiang，E-mail：zrq1034@163.com

早期斷奶可造成仔豬發(fā)生應激反應，引起仔豬抗氧化功能失衡、免疫抑制、肝損傷、抗病力降低、發(fā)病率和死亡率增加、生長性能下降等，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失^[1]。肝是機體應對氧化應激和發(fā)揮免疫防御功能的重要部位；同時是機體營養(yǎng)代謝和解毒的主要中樞器官，更易受到各種內(nèi)外環(huán)境影響產(chǎn)生氧化應激和炎癥反應^[2]。因此，探尋可緩解仔豬肝應激損傷的有效措施，對豬的健康養(yǎng)殖和高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。

單寧酸又稱為鞣酸、鞣質(zhì)、單寧和二倍酸，化學式為C₇₆H₅₂O₄₆，是一種天然的植物多酚，多存在于五倍子、石榴等植物的樹皮及果實內(nèi)^[3]。研究指出，單寧酸作為天然植物提取物，具有抗氧化、抗病毒、抗炎和良好的自由基清除能力^[4]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，當單寧酸的濃度為0.6mg·mL^-1時，對自由基的清除率為86.59％^[5]。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，單寧酸能夠清除機體內(nèi)因活性氧（reactive oxygen species，ROS）失衡而產(chǎn)生的過量氧負離子及羥基自由基^[6]。此外，在飼糧中添加0.19%的水解單寧酸可提高豬的體重、日增重和飼料利用率^[7]。在豬飼糧中添加單寧酸可降低血清肌酸激酶和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，顯著提高血清中總超氧化物歧化酶水平^[8]。

研究表明，細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是多種疾病發(fā)生的致病因素，可導致肝腫大和肝功能受損，常用來構(gòu)建動物炎癥和氧化應激模型^[9]。本試驗以仔豬為研究對象，通過LPS構(gòu)建仔豬肝應激損傷模型，探究單寧酸對斷奶仔豬肝臟指數(shù)、肝功能指標、抗氧化能力、炎癥因子及相關基因表達的影響，以期為提高豬的養(yǎng)殖健康和單寧酸在飼料中的精準營養(yǎng)技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用大腸桿菌脂多糖（LPS）構(gòu)建應激模型，該大腸桿菌的血清型為O55：B5，LPS購自Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗設計和飼養(yǎng)管理

本試驗分為兩部分。第一部分為單寧酸對斷奶仔豬生長性能的影響研究，選擇72頭體重相近、健康狀況良好的28日齡三元雜交（杜×長×大）斷奶仔豬，將其隨機分為2個試驗組，每組6個重復，每個重復6頭，基礎飼糧飼喂組飼喂基礎飼糧，單寧酸飼喂組飼喂在基礎飼糧中額外添加1000mg·kg^-1單寧酸的試驗飼糧，試驗期為28d。單寧酸購自浙江萬方生物科技有限公司，純度為53.4％。記錄試驗期間仔豬的初體重、末體重和采食量。

第二部分為單寧酸對LPS應激仔豬肝損傷的保護作用研究。于第一部分試驗結(jié)束時，分別從基礎飼糧飼喂組和單寧酸飼喂組各選取12頭體重接近平均體重、健康狀況良好的56日齡仔豬，將其隨機分為4個組，每組6頭仔豬，對照組（control，CON）和LPS應激組（LPS）的仔豬來自第一部分試驗的基礎飼糧飼喂組；單寧酸組（tannic acid，TA）和單寧酸+LPS組（TA+LPS）的仔豬來自第一部分試驗的單寧酸飼喂組。在仔豬56日齡（第一部分試驗結(jié)束當天）早上8：00，給LPS組和TA+LPS組仔豬腹腔注射1次1.5mL濃度為1mg·mL^-1的LPS，給CON組和TA組仔豬腹腔注射1次1.5mL生理鹽水，注射1.5h后進行屠宰并采樣。試驗在杭州正興牧業(yè)有限公司進行，試驗期間，不限制試驗仔豬采食與飲水，并且按照養(yǎng)殖場的常規(guī)流程和制度對場所及物品進行消毒。斷奶仔豬飼喂的基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

1.3 樣品采集

參考俞曉蓉等^[10]的描述，在對斷奶仔豬腹腔注射LPS或生理鹽水應激1.5h后，對斷奶仔豬進行前腔靜脈采血，之后屠宰并快速采集肝組織樣品、稱重，用于肝臟指數(shù)計算，肝臟指數(shù)（g·kg^-1）=肝質(zhì)量（g）/活體質(zhì)量（kg）。剪取部分仔豬肝組織置于凍存管中，將血清和肝組織保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)各項指標的測定。

1.4 血清中肝功能相關指標

血清肝功能相關指標谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）使用試劑盒測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，各項指標按照對應的試劑盒說明書步驟進行檢測。

1.5 肝組織抗氧化功能指標

取0.1g肝組織樣品，加入1mL生理鹽水，使用勻漿機進行充分勻漿，4000×g離心10min，取上清檢測抗氧化指標。檢測指標包括過氧化氫酶（catalase，CAT）活性（鉬酸銨法）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性（WST-1法）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）（比色法）和丙二醛（MDA）含量（TBA法）。檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，各項指標按照對應的試劑盒說明書步驟進行檢測。

1.6 肝組織炎癥因子指標

ELISA試劑盒檢測肝組織樣炎癥因子水平，包括白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），試劑盒購自南京奧青生物科技有限公司，各項指標按照對應的試劑盒說明書步驟進行檢測。

1.7 肝組織基因表達

肝組織總RNA使用RNAiso Plus試劑（TaKaRa）提取，利用超微量分光光度計檢測提取RNA的濃度，使用PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒將1μL濃度為500ng·μL^-1的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后將cDNA儲存在-80℃冰箱備用。以cDNA為模板，分別選取與肝抗氧化功能、肝炎癥因子和TLR4信號通路相關的基因進行熒光定量PCR，引物序列見表2。定量檢測操作按照TB Premix EX TaqTMⅡ說明書，于CFX96熒光定量PCR儀檢測。試驗的反應體系：5μL TB Green Premix，1μL cDNA，0.3μL上游引物，0.3μL下游引物，3.4μL DEPC水。試驗的反應程序：95℃30s；95℃5s；60℃30s；40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCT法對計算分析所需基因相對表達量。

1.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2019初步整理后，使用SPSS25.0軟件進行雙因素方差分析，分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，Plt;0.05表示差異顯著。采用Graphpad prism8進行作圖，試驗結(jié)果均以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 單寧酸對斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可得，飼糧中添加單寧酸對斷奶仔豬的P-value平均初體重/kg Average initial body weight8.92±0.408.98±0.390.984平均末體重/kg Average final body weight17.41±0.7118.07±0.750.853平均日采食量/g Average daily feed intake505.79±22.17548.53±32.390.472平均日增重/g Average daily gain301.01±16.04324.31±15.320.979料重比F/G1.69±0.051.69±0.040.528

平均末重、平均日采食量、平均日增重和料重比無顯著影響（Pgt;0.05）。

2.2 單寧酸對LPS應激斷奶仔豬肝臟指數(shù)的影響

由圖1可得，LPS應激會顯著提高仔豬的肝臟指數(shù)（Plt;0.05），飼糧中添加TA和LPS應激對仔豬肝臟指數(shù)的影響存在交互效應。CON組、TA組和TA+LPS組仔豬肝臟指數(shù)均顯著低于LPS組（Plt;0.05）。CON組和TA+LPS組仔豬的肝臟指數(shù)無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3 單寧酸對LPS應激仔豬血清AST和ALT的影響

由圖2可得，飼糧中添加TA可顯著降低仔豬血清中AST和ALT水平（Plt;0.05），LPS應激會顯著提高血清中AST和ALT含量（Plt;0.05），飼糧中添加TA和LPS應激對仔豬血清ALT水平的影響存在交互效應。與CON組相比，TA+LPS組仔豬血清中AST的水平顯著降低（Plt;0.05），ALT的水平無顯著差異（Pgt;0.05）。與LPS組相比，TA+LPS組血清中AST和ALT的水平顯著降低（Plt;0.05）。

2.4 單寧酸對LPS應激斷奶仔豬肝組織抗氧化功能的影響

由圖3可得，飼糧中添加TA可顯著提高仔豬肝組織CAT和T-SOD水平（Plt;0.05），并顯著降低MDA含量（Plt;0.05）; LPS應激會顯著降低仔豬CAT和T-SOD水平（Plt;0.05），顯著增加MDA含量（Plt;0.05）。與CON組相比，TA組CAT的水平顯著增加（Plt;0.05），TA+LPS組CAT、T-SOD、T-AOC和MDA水平無顯著變化（Pgt;0.05）。

2.5 單寧酸對LPS應激斷奶仔豬肝組織中炎癥因子的影響

由圖4可得，飼糧中添加TA可顯著降低影響仔豬IL-6、IL-10和TNF-α的含量（Plt;0.05），LPS應激會顯著提高IL-6和TNF-α的含量（Plt;0.05）。與CON組相比，TA+LPS組IL-6、IL-10、IL-β和TNF-α的含量無顯著差異（Pgt;0.05）。與LPS組相比，TA+LPS組IL-6和TNF-α的含量顯著減少（Plt;0.05）。

2.6 單寧酸對LPS應激斷奶仔豬肝組織基因表達的影響

由圖5可得，飼糧中添加TA可顯著降低仔豬肝組織中基因Keap1、TLR4、MyD88、NLRP3、IL-6和TNF-α的表達水平（Plt;0.05），顯著提高Nrf2、NQO1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的表達水平（Plt;0.05）。LPS應激顯著提高了仔豬肝中的基因Keap1、TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、IL-6和TNF-α的表達水平（Plt;0.05），顯著降低了Nrf2、NQO1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的表達水平（Plt;0.05）。與CON組相比，TA組肝中的基因NQO1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的表達水平顯著增加（Plt;0.05），LPS組基因NLRP3的表達水平顯著增加（Plt;0.05）；與LPS組相比，TA+LPS組基因Keap1、TLR4、NLRP3、IL-6和TNF-α的表達水平顯著降低（Plt;0.05），Mn-SOD和CAT的表達水平顯著增加（Plt;0.05）。

3 討 論

仔豬在斷奶后由于斷奶應激的影響，會出現(xiàn)食欲不振和采食量下降等現(xiàn)象，嚴重影響其生長發(fā)育。研究表明，單寧酸具有良好的收斂性，可降低仔豬腸道蠕動，延長食糜在腸道的停留時間，有利于飼料消化吸收，在飼糧中添加750mg·kg^-1水解單寧可顯著提高斷奶仔豬的末重和平均日增重^[11]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與基礎飼糧飼喂組相比，飼糧中添加1000mg·kg^-1單寧酸，仔豬的平均末體重、平均日采食量、平均日增重和料重比未表現(xiàn)出顯著差異，這可能與仔豬品種、生長環(huán)境、飼料組成和單寧酸劑量的差異有關。

肝是應對氧化應激的靶向和效應器官，可直接影響動物生長潛能的發(fā)揮。LPS氧化應激會破壞肝細胞的生物膜和功能，造成肝損傷。劉英娜等^[12]研究結(jié)果顯示，單寧酸使LPS應激小鼠肝臟指數(shù)降低，能緩解肝腫大。本試驗研究結(jié)果與其相似，LPS應激仔豬肝臟指數(shù)提高，飼糧中添加單寧酸能夠降低LPS應激引起的肝臟指數(shù)增加，緩解LPS應激引起的肝變化。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）主要分布在肝組織中，是測定肝細胞損傷的標志指標物。當肝組織發(fā)生損傷時，血液中AST和ALT活性會異常升高。本試驗研究結(jié)果顯示，單寧酸可顯著降低仔豬血清中AST和ALT活性，并且減少LPS應激引起的血清AST和ALT活性的增加，表明單寧酸可以緩解LPS應激引起的斷奶仔豬肝損傷，這可能與單寧酸具有良好的抗炎作用有關，Cappai等^[13]研究表明，使用富含單寧酸的飼料可降低斷奶仔豬體內(nèi)的炎癥。

機體在正常情況下，自由基的產(chǎn)生和清除是動態(tài)平衡狀態(tài)，當異常情況發(fā)生時，造成自由基在細胞和組織中過度積蓄，平衡狀態(tài)被打破，從而造成氧化損傷^[14]?？寡趸甘且环N存在于細胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)，它能通過調(diào)控自由基清除效率，改善機體抗氧化平衡狀態(tài)^[15]。肝組織的T-AOC能一定程度上反映機體遭受過氧化損傷的程度，是衡量動物機體總抗氧化能力的綜合指標。SOD能催化超氧陰離子自由基生成過氧化氫（H₂O₂），過氧化氫進而與CAT反應生成水和氧氣，終止自由基鏈鎖反應^[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的穩(wěn)定終產(chǎn)物，其含量常常用來反映機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度和細胞損傷程度^[17]。單寧酸能夠清除機體內(nèi)因活性氧（ROS）失衡而產(chǎn)生的過量氧負離子及羥基自由基^[18]。王思甜等^[19]研究結(jié)果顯示，仔豬灌服單寧酸能顯著提高T-SOD活性，降低MDA含量。Frankicˇ和Salobir^[20]發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加0.3%栗木單寧酸，仔豬尿中MDA含量減少了31.7%。本試驗研究結(jié)果與上述研究相似，單寧酸可以提高仔豬肝中CAT和T-SOD的活性，降低LPS應激引起的肝MDA含量升高。以上結(jié)果表明在單寧酸的作用下，肝抗氧化應激能力增強，這可能與單寧酸具有良好的自由基清除能力有關^[21]。

Nrf2是調(diào)控氧化應激最關鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，Keap1/Nrf2信號通路是抗氧化應激機制中最重要的通路之一^[22]。生理情況下，細胞質(zhì)中的Nrf2與其負性調(diào)控蛋白Keap1偶聯(lián)后以失活狀態(tài)固定于胞質(zhì)內(nèi)，泛素化后由26S蛋白酶體所降解，當遭受ROS、親電試劑或磷酸化刺激后，Keap1被氧化，發(fā)生構(gòu)象改變，隨后與Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2釋放后轉(zhuǎn)位入細胞核內(nèi)，與抗氧化反應元件結(jié)合，誘導下游醌氧化還原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶相關基因的轉(zhuǎn)錄和表達^[23]。研究表明，植物多酚類物質(zhì)主要通過激活Nrf2/ARE信號通路，調(diào)節(jié)機體內(nèi)抗氧化酶基因的表達，提高抗氧化酶的活性^[24]。單寧作為一種天然的植物多酚，可提高仔豬抗氧化能力^[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS應激使仔豬肝中Keap1表達水平顯著增加，而單寧酸可上調(diào)由LPS刺激引起的Cu/Zn-SOD和CAT基因表達水平的降低，下調(diào)Keap1基因表達水平，從而改善機體的抗氧化狀態(tài)。Meng等^[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加植物多酚激活了仔豬Keap1-Nrf2抗氧化信號通路，上調(diào)了T-SOD的蛋白表達量。以上研究均提示單寧酸可能通過激活Keap1/Nrf2信號通路調(diào)節(jié)機體抗氧化能力，緩解肝氧化應激損傷。

NF-κB是一種多向調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子，TLR4作為NF-κB的上游受體，在免疫應答反應中發(fā)揮重要作用，可特異性識別病原體相關分子，誘導NF-κB進入細胞核形成磷酸化的NF-κB（p-NF-κB），進而激活免疫調(diào)節(jié)通路的級聯(lián)以及下游關鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等一系列炎癥因子的表達，產(chǎn)生炎癥反應^[27]。Alameddine等^[28]提出單寧酸可誘導抗炎細胞因子的產(chǎn)生，并在TLR4刺激下，抑制炎性細胞因子的分泌。Song等^[29]研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸可通過阻斷細胞內(nèi)TApase-1的切割，抑制IL-1β分泌，抑制炎癥小體的激活。本試驗研究結(jié)果與上述研究相似，單寧酸具有抗炎癥的功能，可使LPS應激仔豬肝中IL-6和TNF-α含量降低，IL-10含量升高，降低了促炎因子的分泌，促進了抗炎因子的釋放。本試驗亦發(fā)現(xiàn)，單寧酸能夠降低LPS應激引起的仔豬肝組織基因IL-6和TNF-α表達的異常升高。單寧酸的抗炎作用可能歸因于其可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路的激活，改善機體炎癥應答反應。本試驗顯示，單寧酸能夠下調(diào)LPS應激引起的仔豬肝組織TLR4和NLRP3信號的升高。類似的研究亦指出，單寧酸可抑制細胞中ROS的形成和NF-κB通路的激活，降低TLR4信號通路誘導的細胞中ROS、一氧化氮（NO）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）的產(chǎn)生^[30]。Matsumura等^[31]研究發(fā)現(xiàn)，柿子單寧可顯著降低小鼠骨髓巨噬細胞（BMDMS）中過高的炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA表達量，進而有效緩解炎癥反應。

4 結(jié) 論

綜上所述，本試驗條件下，單寧酸能夠調(diào)節(jié)仔豬肝臟指數(shù)，改善肝抗氧化能力，抑制肝炎癥因子的分泌，調(diào)控Nrf2信號、TLR4信號和NLRP3炎癥小體信號相關基因表達，緩解LPS應激引起的仔豬肝應激損傷狀態(tài)。本試驗研究結(jié)果可為緩解仔豬應激損傷和促進單寧酸在飼料中的精準營養(yǎng)技術(shù)研究提供理論參考。

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（編輯 范子娟）