紅三葉草提取物對奶牛體外瘤胃發(fā)酵中微生物多樣性及尿素分解的影響

摘 要：旨在通過體外發(fā)酵研究紅三葉草提取物對瘤胃微生物組成和尿素代謝的影響。試驗分為空白對照組（不添加紅三葉草提取物）和添加紅三葉草提取物處理組，采集3頭健康奶牛瘤胃液混合均勻，進行體外發(fā)酵培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、0.5、1、2、4、6、24h收集發(fā)酵液樣品，測定尿素、氨氮（NH₃-N）、微生物蛋白、總游離氨基酸的含量。利用16S rRNA基因測序揭示瘤胃微生物多樣性、群落組成及功能的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉草提取物處理組在發(fā)酵4h內(nèi)顯著降低尿素分解速率，在發(fā)酵至2h后顯著降低氨氮含量，在發(fā)酵6h后顯著提高瘤胃微生物蛋白的含量，對總游離氨基酸含量無顯著影響。16S rRNA基因測序結(jié)果顯示，添加紅三葉草提取物顯著增加了體外發(fā)酵中微生物α多樣性的Chao1和Shannon指標，改變了體外發(fā)酵中瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)。添加紅三葉草提取物改變了瘤胃蛋白分解菌瘤胃桿菌屬（Ruminobacter）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）中ASV35和s_unidentified_rumen_bacterium_RF18的豐度，降低了致病菌嗜膽菌屬（Bilophila）的豐度。綜上所述，添加紅三葉草提取物可降低瘤胃微生物分解尿素的速率，提高瘤胃微生物利用氨氮轉(zhuǎn)化為自身蛋白的能力。

關(guān)鍵詞：紅三葉草提取物；瘤胃；尿素；菌群多樣性

中圖分類號：S823.911.5

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2510-09

收稿日期：2023-09-04

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2022YFD1301000）；中國農(nóng)業(yè)科學院重大任務（CAAS-ZDRW202308）；內(nèi)蒙古自治區(qū)重點項目（2021-國家乳創(chuàng)中心-2）；畜禽營養(yǎng)與飼養(yǎng)全國重點實驗室（2004DA125184G2108）

作者簡介：劉思佳（1994-），女，河北石家莊人，博士生，主要從事瘤胃微生物組學研究，E-mail：liusijia1214@163.com，Tel：010-62816069

*通信作者：趙圣國，主要從事反芻動物營養(yǎng)與瘤胃微生物組學研究，E-mail：zhaoshengguo1984@163.com

Effects of Red Clover Extract on Microbial Diversity and Urea Decomposition in

Rumen Fermentation of Dairy Cows in vitro

LIUSijia^1，2，ZHENGNan¹，WANGJiaqi¹，ZHAOShengguo^1*

（1.State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding，Institute of Animal Sciences，

Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China; 2.College of Pastoral

Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou730020，China）

Abstract：The purpose of this study was to investigate the effects of red clover plant isoflavoneextract on rumen microbial composition and urea metabolism in vitro.Rumen microbial samples were obtained from3healthy dairy cows.The experiment was divided into control group（no red clover plant isoflavoneextract added）and supplement with red clover plant isoflavoneextract treatment group.Rumen fluid collected from3healthy cows were mixed for in vitro fermentation.The samplesfermentation fluid samples were collected at0，0.5，1，2，4，6and24h of fermentation，respectively，and the contents of urea，ammonia nitrogen（NH₃-N），microbial crude protein and total amino acids were determined.16S rRNA sequencing was used to reveal the changes of microbial diversity，community composition and function in rumen.（Result）In this study，it was foundThe results showed that in the red clover plant isoflavoneextract treatment group，urea decomposition rate was significantly reduced within4h of fermentation，ammonia nitrogen content was significantly reduced after2h of fermentation，rumen microbial protein content was significantly increased after6h of fermentation，and total free amino acid content was not significantly affected.16S rRNA sequencing results showed that supplemented with red clover plant isoflavoneextract significantly increased the Chao1and Shannon indexes of microbial αdiversity and changed the rumen microbial community structure in the in vitro fermentation.The abundance of Prevotella（ASV35and s_unidentified_rumen_bacterium_RF18）and Ruminobacter were increasedchanged，Bilophil were decreased.（Conclusion）In summary，the addition of red clover plant isoflavoneextract can reduce the rate of urea hydrolyzing by rumen bacteria，and improving the ability of rumen bacteria to convert ammonia nitrogen into microbial crude protein.

Key words：red clover extract; rumen; urea; bacterial diversity

*Corresponding author：ZHAO Shengguo，E-mail：zhaoshengguo1984@163.com

尿素作為一種非蛋白氮，可以替代反芻動物日糧中的部分優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，降低動物飼養(yǎng)成本^[1]。尿素進入瘤胃后，會被瘤胃微生物分泌的脲酶分解為氨和二氧化碳。來自尿素分解的氨可被瘤胃微生物利用合成自身蛋白，在動物后腸道被消化吸收，供宿主機體利用^[2-3]。微生物蛋白是宿主生長及合成乳蛋白的重要氮來源^[4-5]。尿素在反芻動物日糧中的應用已經(jīng)有100多年的歷史^[1]，作為一種瘤胃可高效降解的氮源，不僅為微生物蛋白質(zhì)合成提供了充足的氮，還可以改善瘤胃發(fā)酵^[6-7]。然而，瘤胃中脲酶活性過高，尿素水解成氨的速度往往超過氨的利用率，導致反芻動物尿素的利用效率較低^[8]。因此，需要開發(fā)新型天然綠色的脲酶抑制劑降低尿素分解速率，提高反芻動物對尿素中氮的利用效率^[9-10]。

有報道稱，將抗生素作為飼料添加劑可調(diào)節(jié)瘤胃菌群以降低氨的生成，增加氮利用率^[11]。目前，我國已經(jīng)全面禁止在飼料中添加抗生素，因此，從植物中提取物天然產(chǎn)品開發(fā)綠色天然飼料添加劑調(diào)節(jié)瘤胃氮代謝是當下研究的首要任務。天然的植物功能組分可調(diào)控瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)、降低瘤胃甲烷生成、改善宿主健康、提高動物的生產(chǎn)性能^[12-13]。黃酮類化合物廣泛分布于各種植物中，是最常見的天然植物功能組分，其種類豐富，超過8000種^[14]。植物提取物中通常含有多種黃酮類化合物，在調(diào)控瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中具備“組合效應”^[13]。大豆的異黃酮含量為1.2～4.2mg·g^-1干物質(zhì)（DM），苜蓿為0.05～0.3mg·g^-1DM，紅三葉草中異黃酮含量最高，為10～25mg·g^-1DM，是動物飼料中異黃酮的重要來源^[15]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵的作用^[16]。

許多研究已經(jīng)揭示了紅三葉草及其有效成分在反芻動物養(yǎng)殖中的生物學功能。然而，目前對紅三葉草提取物對反芻動物尿素代謝的影響仍未有報道。因此，本研究旨在通過體外發(fā)酵闡明紅三葉草提取物對瘤胃微生物及尿素代謝的影響，為開發(fā)新的脲酶抑制劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液采集

選取3頭體重（550±23）kg的健康泌乳荷斯坦奶牛，經(jīng)瘤胃瘺管于晨飼前采集瘤胃液，四層紗布過濾，使固體與液體分離，液體立即使用注射器轉(zhuǎn)移到含有厭氧存儲液的血清瓶中。置于保溫箱運回實驗室備用。

1.2 厭氧緩沖液的配置

根據(jù)He等^[10]的方法稍做調(diào)整制備厭氧緩沖液，具體成分為：38mL溶液2（6g K₂HPO₄，超純水定容至1L），38mL溶液3（1.6g CaCl₂·2H₂O，6g KH₂PO₄，12g NaCl，2.5g MgSO₄·7H₂O，超純水定容至1L），8g NaHCO₃，1mL刃天青0.1%，0.5g鹽酸半胱氨酸。

燒杯中加入溶液2、溶液3、煮沸的去離子水，置于磁力攪拌器上攪拌，并向瓶中持續(xù)通二氧化碳，待溶液冷卻后加入1mL0.1%刃天青，持續(xù)通二氧化碳至溶液顏色變淺或褪色，加入NaHCO₃，滅菌水定容至1L，調(diào)節(jié)pH為6.7，加入0.5g鹽酸半胱氨酸，迅速撤出二氧化碳通氣管并蓋好瓶蓋，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱除氧。

1.3 體外發(fā)酵培養(yǎng)

試驗分為空白對照組（不添加紅三葉草提取物）和紅三葉草提取物處理組（10mg·g^-1日糧）。將采集的瘤胃液與厭氧緩沖液按1∶2比例混合均勻后置于厭氧培養(yǎng)瓶，發(fā)酵體系為100mL，每個處理設置5個重復，全程于厭氧培養(yǎng)箱進行操作。體外發(fā)酵的日糧組成為：玉米青貯62.09%、苜蓿干草7.66%、玉米粉10.25%、豆粕17.87%、預混料2.13%。飼料烘干粉碎后全部通過1mm篩網(wǎng)，配制好后，以干物質(zhì)含量計算精準稱取1g日糧、200mg尿素和10mg（紅三葉草提取物處理組）/0mg（空白對照組）紅三葉草提取物于厭氧培養(yǎng)瓶中，置于39℃孵育培養(yǎng)。

1.4 樣品采集與指標測定

分別于發(fā)酵0、0.5、1、2、4、6、24h取2mL發(fā)酵液，12000×g離心5min，取500μL上清立即添加500μL25%偏磷酸（V∶V），用于測定氨氮（NH₃-N）濃度，剩余上清用于測定尿素和氨基酸濃度。沉淀于-20℃保存，用于提取微生物DNA和測定微生物蛋白濃度。

氨氮（NH₃-N）濃度利用苯酚次氯酸的方法測定^[17]。尿素濃度利用二乙酰一肟法尿素檢測試劑盒測定（建成生物工程，南京，中國），氨基酸濃度利用總氨基酸測定試劑盒測定（建成生物工程，南京，中國），根據(jù)制造商的說明書進行操作。微生物蛋白濃度利用珠磨破碎結(jié)合BCA蛋白定量試劑盒測定微生物蛋白（碧云天，上海，中國），微生物沉淀重懸于2mL PBS溶液，取500μL菌，用PBS清洗3遍，加入200mg二氧化硅/鋯玻璃珠（0.15～0.21mm），利用珠磨儀（Retsch，Haan，Germany）進行破碎（30m·s^-1，1～2min），暫停1min后重復1次，12000×g離心5min，取上清，根據(jù)制造商的說明書進行操作。

1.5 16S rRNA基因測序

取1.5mL發(fā)酵24h時PBS重懸后的菌液，離心（13000×g，4℃，10min），去除上清，保留微生物沉淀。利用CTAB方法提取瘤胃微生物DNA^[18]。加入0.5g二氧化硅/鋯玻璃珠（0.15～0.21mm）和800μL CTAB緩沖液（100mm Tris-HCl，pH8.0; 1.4mol·L^-1NaCl; 20mmol·L^-1EDTA），利用珠磨儀（Retsch，Haan，Germany）破碎1min（30m·s^-1）。70℃孵育20min，13000×g離心10min，取上清液與600μL苯酚、氯仿、異戊醇溶液（體積25∶24∶1）混合，13000×g，4℃離心5min。取上層溶液轉(zhuǎn)移到新離心管中，添加0.8倍體積的異丙醇以沉淀DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行定性鑒定，Nanodrop^TM光譜儀（Thermo Scientific，USA）進行定量。將DNA的濃度稀釋至50ng·μL^-1，作為模板進行PCR擴增。

利用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-G-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物擴增V3-V4區(qū)。PCR擴增反應體系為50μL：5μL10×PCR緩沖液（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），1μL dNTP混合物（10mmol·L^-1），正向和反向引物各1.5μL（10mmol·L^-1），0.25μL DNA聚合酶（Invitrogen），2μL微生物DNA，38.75μL無菌ddH₂O。利用MyCycler Thermal Cycler（Bio-Rad，USA）進行PCR，擴增程序為：95 ℃3min；95 ℃30s，55 ℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72 ℃反應15min。利用2%瓊脂糖凝膠和瓊脂糖凝膠回收試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union，CA，USA）純化回收約469bp的片段。純化的片段在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina MiSeq平臺測序。

1.6 測序數(shù)據(jù)處理

序列分析使用DADA2軟件包^[19]，根據(jù)通用流程去除接頭和引物，質(zhì)量過濾裁剪，計算錯誤率除去低質(zhì)量的讀長，去冗余，合并雙端序列，利用質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化數(shù)據(jù)獲得ASV（Amplicon Sequence Variant）代表序列和豐度信息。基于Greengenes數(shù)據(jù)庫13_5，利用RDP分類器進行分類^[20]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SAS（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）進行方差分析，紅三葉草提取物處理與空白對照組每段時間內(nèi)瘤胃NH₃-N、尿素、氨基酸和微生物蛋白的差異。P≤0.05表示差異顯著，Pgt;0.05表示差異無統(tǒng)計學意義。利用美吉生物云平臺進行微生物數(shù)據(jù)分析與可視化（https：∥cloud.majorbio.com/）。

2 結(jié) 果

2.1 紅三葉草提取物對尿素、NH₃-N、氨基酸和微生物蛋白的影響

隨發(fā)酵時間的增加，兩個處理組的尿素含量均不斷降低，發(fā)酵至24h后尿素被完全分解（圖1a）。添加紅三葉草提取物處理組在發(fā)酵0.5～4h顯著降低了尿素的分解速率（Plt;0.05，圖1a）。隨著發(fā)酵時間的增加，兩個處理組NH₃-N的濃度均不斷增加（圖1b）。添加紅三葉草提取物處理組在發(fā)酵2～24h顯著降低了NH₃-N的濃度（Plt;0.05，圖1b）。

發(fā)酵的0～4h，兩個處理組微生物蛋白含量均未增加。發(fā)酵4h后，微生物蛋白含量開始增加，發(fā)酵6～24h添加紅三葉草提取物處理組的微生物蛋白含量顯著高于空白對照組（Plt;0.05，圖1c）。氨基酸的含量隨發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)出一個動態(tài)變化，但兩個處理組間沒有顯著差異（圖1d）。

2.2 紅三葉草提取物對微生物多樣性的影響

總共測序獲得有效序列數(shù)為91436條。每個樣本的有效序列數(shù)范圍在8071～10014不等，代表序列數(shù)范圍在332～407不等。添加紅三葉草提取物顯著增加了體外發(fā)酵中微生物α多樣性的Chao1和Shannon指標（圖2a、b），表明紅三葉草提取物可提高體外發(fā)酵中瘤胃微生物物種豐度和多樣性。添加紅三葉草提取物處理組與空白對照組的主成分分析距離較遠（圖2c），表明紅三葉草提取物改變了體外發(fā)酵中瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)。

2.3 紅三葉草提取物對微生物組成的影響

物種分類后，鑒定了4個主要的細菌門，包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和Patescibacteria（圖3a）。鑒定的主要菌屬為普雷沃氏菌屬（Prevotella）、NK4A214_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、瘤胃桿菌屬（Ruminobacter）、解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、諾卡氏菌屬（norank_f__F082）和Prevotellaceae_UCG-003（圖3b）。

添加紅三葉草提取物增加了瘤胃桿菌屬（Ruminobacter）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）中ASV35（Bilophila）普雷沃氏菌屬（Prevotella）中ASV65、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）中ASV768、ASV809和ASV830、ASV126（g_unclassified_f_Rikenellaceae）、ASV201（g_Rikenellacea）、s_uncultured_bacterium_g_norank、ASV480（g_norank）、ASV102（g_Anaerovorax）和ASV792（g_Rikenellaceae）的豐度（圖4）。

2.4 紅三葉草提取物對微生物功能的影響

利用PICRUSt對體外發(fā)酵時瘤胃微生物功能進行預測分析，表明主要的COG功能包括碳水化合物運輸和代謝、氨基酸運輸和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝、次生代謝物的生物合成運輸和分解代謝、無機離子運輸和代謝、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換等22個功能家族（圖5）。添加紅三葉草提取物對瘤胃微生物功能沒有顯著影響（圖5）。

3 討 論

在反芻動物日糧中，尿素被用作非蛋白氮以節(jié)約飼養(yǎng)成本，然而，瘤胃中脲酶活性過高，導致尿素在瘤胃中過快分解為氨，遠超微生物及宿主利用的速率，造成尿素利用率低和資源浪費^[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉草提取物能有效抑制瘤胃脲酶及尿素降解速率，從而降低瘤胃氨產(chǎn)量，氨的緩慢釋放增加了瘤胃微生物利用氨合成自身蛋白的效率，有助于為反芻動物提供更多可代謝蛋白質(zhì)^[22]，提高尿素利用率。紅三葉草是豆科的一種草本植物，富含異黃酮，特別是刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素A^[23]。有研究報道稱，鷹嘴豆芽素A可以抑制瘤胃細菌活性，從而影響氨的產(chǎn)生^[24]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆芽素A可以降低尿素的降解速率^[25]。以上研究結(jié)果與本研究的結(jié)果相一致。

瘤胃微生物可以利用NH₃-N和氨基酸等底物合成微生物蛋白，而宿主蛋白質(zhì)總需求量的50%～80%來自于微生物蛋白^[26]，添加紅三葉草提取物提高了微生物蛋白的含量，表明紅三葉草提取物促進了瘤胃發(fā)酵。有研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉草可以促進瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量^[27]，提高瘤胃氮的利用效率^[28]，促進奶牛的蛋白質(zhì)利用效率^[29]，這與本研究的結(jié)果相一致。同時，紅三葉草提取物增加了瘤胃微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)，但未改變瘤胃微生物組的功能，綜合來看，紅三葉草提取物主要是調(diào)控瘤胃氮代謝，提高反芻動物氮利用效率。

普雷沃氏菌（Prevotella）和瘤胃桿菌屬（Ruminobacter）為瘤胃微生物組的優(yōu)勢菌屬^[30]。瘤胃桿菌屬（Ruminobacter）是瘤胃中主要的淀粉降解菌之一，同時具有很強的降解蛋白質(zhì)的能力。普雷沃氏菌（Prevotella）是碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝的核心菌屬，廣泛存在于瘤胃且是數(shù)量最多的一類細菌，菌種間遺傳差異較大，與瘤胃健康代謝息息相關(guān)^[31-32]。有研究揭示了普雷沃氏菌（Prevotella）基因組豐富的功能代謝譜，包括氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、輔助因子、維生素和能量代謝（ATP）等，這反映了該菌屬多樣性及對生態(tài)位的高度適應性^[33-34]。添加紅三葉草提取物增加了瘤胃桿菌屬（Ruminobacter）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）中ASV35和s_unidentified_rumen_bacterium_RF18的豐度，可能是由于紅三葉草提取物抑制了尿素的分解，降低了氨態(tài)氮的含量，因此增加了蛋白分解菌的豐度，由此推測，普雷沃氏菌屬（Prevotella）中主要發(fā)揮蛋白質(zhì)分解功能的菌為ASV35和s_unidentified_rumen_bacterium_RF18。綜上所述，紅三葉草提取物可能是通過改變瘤胃微生物的組成，調(diào)控瘤胃氮代謝，從而促進瘤胃的有益發(fā)酵。

嗜膽菌屬（Bilophila）在動物體內(nèi)中的一些物種菌對動物來說是有用的共生細菌，一些物種而也有一些菌是機會致病菌，其豐度的增加會促進腸道炎癥的發(fā)生^[35]。此外，有研究表明，嗜膽菌屬（Bilophila）在重癥感染等疾病患者中的豐度增加，并認為這是由腸道菌群介導的^[36]。添加紅三葉草提取物顯著降低了瘤胃菌群中嗜膽菌屬（Bilophila）的豐度，突出了其說明了紅三葉草提取物對提高反芻動物免疫力和促進反芻動物胃腸道健康的重要性及應用潛力。

4 結(jié) 論

本研究通過體外發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)紅三葉草提取物可降低瘤胃尿素分解速率，提高瘤胃微生物利用氨氮合成微生物蛋白的能力，降低機會致病菌嗜膽菌屬（Bilophila）的豐度，提高反芻動物尿素氮利用效率，對充分發(fā)揮尿素飼料潛力，減少對進口大豆依賴具有重要作用。

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（編輯 范子娟）