褪黑素緩解白消安損傷小鼠睪丸的機理研究

摘 要：旨在揭示褪黑素（melatonin，MT）緩解白消安損傷睪丸的機理，提高白消安制備精原干細胞移植受體的效率，并探究其對白消安毒害雄性生精機能的治療作用。本研究以6～7周ICR雄鼠為模型動物，分為對照組，白消安處理組和白消安+褪黑素處理組，每組8個重復，于注射后第7天取樣。通過ELISA檢測睪丸組織的炎性細胞因子水平，并對睪丸和附睪進行HE染色。此外，免疫組化或免疫熒光檢測血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）相關(guān)蛋白的表達情況，以分析MT對BTB影響。結(jié)果表明，小鼠經(jīng)白消安注射后，聯(lián)合MT處理，觀察到MT顯著緩解了睪丸重和睪體率下降的趨勢，并減緩了精子數(shù)量下降的速度；睪丸組織HE染色和炎性細胞因子檢測發(fā)現(xiàn)，MT顯著減緩了核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transportation factor κB，NF-κB）、p-NF-κB、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-α）及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）水平的上升趨勢，從而減少了組織中炎性細胞浸潤；免疫組化或免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，MT緩解了白消安處理導致的BTB組成蛋白（Occludin、connexin-43、N-cadherin）和細胞骨架蛋白（F-actin和Vimentin）含量的下降。綜上，MT通過下調(diào)睪丸組織中炎性細胞因子水平，緩解白消安誘發(fā)的小鼠睪丸炎癥反應；并通過減緩BTB相關(guān)蛋白含量的下降，緩解白消安對BTB和支持細胞的損傷，進而緩解小鼠生精機能的損傷。

關(guān)鍵詞：褪黑素；白消安；睪丸炎；血睪屏障；細胞骨架

中圖分類號：S814.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2486-12

收稿日期：2023-11-14

基金項目：國家自然科學基金（31772595）

作者簡介：吳開慧（1996-），女，貴州安順人，碩士生，主要從事動物繁殖研究，E-mail：2840259661@qq.com

*通信作者：王 棟，主要從事動物繁殖研究，E-mail：dwangcn2002@vip.sina.com；龐云渭，主要從事動物繁殖研究，E-mail：pangyunwei@caas.cn

Study on the Mechanism of Melatonin Relieving Testicular Damage in Mice

Induced Busulfan

WUKaihui¹，ZHANGLiuguang²，WANGChao^1，3，XUShiyuan^1，3，LIUSongqi¹，

YUANKaimin^1，3，WANGDong^1*，PANGYunwei^1*

（1.Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing

100193，China; 2.Center for Reproductive Medicine，Haikou Mary Hospital，

Haikou570203，China; 3.College of Animal Science and Technology，Jilin

Agricultural University，Changchun130118，China）

Abstract：The study aimed to reveal the mechanism of melatonin in alleviating testicular damage caused by busulfan，improve the efficiency of busulfan in preparing spermatogonial stem cell transplantation recipients，and explore its therapeutic effect on male spermatogenic function caused by busulfan′s toxicity.In this study，ICR male mice at6-7weeks were used as model animals and divided into control group，a white busulfan treatment group，and awhite busulfan+melatonin treatment group.Each group had8replicates and samples were taken on the7th day after injection.Detect tThe levels of inflammatory cytokines in testicular tissue was detected using ELISA，and perform HE staining on the testes and epididymis.In addition，immunohistochemistry or immunofluorescence were used to detect the expression of blood testis barrier related proteins to analyze the effect of melatonin on BTB.The results showed that after injection of busulfan into mice，combined with melatonin treatment，the trend of decreased testicular weight and testicular body rate was significantly alleviated，and the rate of decrease in sperm count was slowed down; HE staining of testicular tissue and detection of inflammatory cytokines showed that melatonin significantly slowed down the upward trend of nuclear transportation factor κB，p-NF-κB，interleukin-1β，tumor necrosis factor-α and myeloperoxidase，thereby reducing the infiltration of inflammatory cells in the tissue; immunohistochemical or immunofluorescence detection showed that melatonin slowed down the decrease in the levels of blood testis barrier constituent proteins（Occludin，connexin-43，N-cadherin）and cytoskeletal proteins（F-actin and Vimentin）caused by busulfan treatment.Melatonin alleviates the mouse orchitis response induced by busulfan by down regulating the levels of inflammatory cytokines in testicular tissue; and by slowing down the decreasing trend of BTB related proteins content，the damage of busulfan to BTB and supportingsertoli cells is alleviated，thereby alleviating the damage to mouse spermatogenic function.

Key words：melatonin; busulfan; orchitis; blood testis barrier; cytoskeleton

*Corresponding authors：WANG Dong，E-mail：dwangcn2002@vip.sina.com; PANG Yunwei，E-mail：pangyunwei@caas.cn

白消安可導致細胞DNA交聯(lián)，阻礙細胞生長，已被廣泛用于癌癥化療。但由于其可高效摧毀內(nèi)源生殖細胞，也被廣泛用于制備精原干細胞移植受體^[1]，開辟了精原干細胞移植和精子發(fā)生機制研究新方向。然而，白消安毒性會嚴重影響雄性生育功能，使癌癥治療及精原干細胞移植受體制備都面臨較大安全隱患^[2]。深入研究白消安的生精毒害機制，并探究烷化劑作用下雄性生精機能防護，將為促進其科學應用提供重要理論支撐。

研究發(fā)現(xiàn)，白消安處理小鼠后血清炎性因子水平顯著升高，間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的細胞浸潤^[3-4]，說明白消安誘發(fā)了小鼠睪丸炎。進一步的研究表明，注射白消安36h后，在曲細精管內(nèi)檢測到了生物素信號，說明白消安也破壞了BTB完整性^[3]，而諸多細胞因子和相關(guān)分子共同調(diào)控BTB的周期性重構(gòu)，以維持正常的精子發(fā)生^[5-6]。其中，全氟辛酸連續(xù)灌胃試驗增加了試驗鼠血清TNF-α水平，并顯著降低BTB相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-11和connexin-43水平，破壞了BTB完整性，導致雌鼠懷孕率顯著降低^[7]。因此推測，白消安通過引起睪丸炎癥毒害睪丸生精機能。

褪黑素（melatonin，MT）具有多效性，不但可抗氧化，還具有抗炎作用^[8-9]。體外研究表明，MT能顯著降低精原干細胞炎性細胞因子水平，緩解脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的精原干細胞炎癥反應^[10]。類似地，LPS處理可上調(diào)牛支持細胞白介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β水平，顯著降低ZO-1和Occludin蛋白水平，損傷BTB。而聯(lián)合MT處理后，炎性細胞因子水平顯著降低，ZO-1和Occludin蛋白水平增加^[11]。綜上，MT通過降低炎性細胞因子水平，緩解了睪丸細胞炎癥反應，并緩解了BTB損傷。為此，本研究以小鼠為模型動物，在睪丸注射白消安后，聯(lián)合MT處理，探究MT對白消安引起的睪丸細胞及BTB損傷的緩解作用，進而探索其能否緩解生精機能損傷及機理，以期為高效制備精原干細胞移植受體，有效防范白消安等烷化劑毒副作用，提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取6～7周齡繁殖性能正常的ICR雄鼠21只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），隨機分為對照組、白消安處理組（7、14、21d）和白消安+褪黑素組（7、14、21d），每組3只。其中，對照組無處理，白消安組每側(cè)睪丸注射0.05mL的白消安溶液（6mg·mL^-1），白消安+褪黑素組在白消安處理12h后，腹腔注射40（mg·kg）^-1·d^-1的褪黑素溶液^[3，12]。進行預試驗的探索后，發(fā)現(xiàn)7d后可明顯緩解小鼠睪丸損傷，因此后續(xù)選擇7d進行機理研究。將6～7周繁殖性能正常的24只ICR雄鼠隨機分為對照組（Con）、白消安組（Bu）和白消安+褪黑素組（Bu+MT），每組8只。其中對照組每側(cè)睪丸注射0.05mL的50%DMSO溶液，白消安組和白消安+褪黑素組處理方式同上。整個試驗過程中，試驗鼠在20～25℃條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，每周更換一次墊料。試驗鼠及試驗方法均符合中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗動物倫理審查（No.IAS2019-13）要求。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 稱重

采樣前對各組小鼠體重進行稱量，安樂死后快速取出睪丸置于電子天平上稱重。

1.2.2 精子密度的測定

附睪置于含1mL生理鹽水的離心管中，并用眼科剪剪碎附睪組織。將離心管置于37℃金屬浴保存20min。在血球計數(shù)板的計數(shù)池上加蓋蓋玻片，吸取10μL精子懸液滴于蓋玻片邊緣，使精子懸液緩慢滲入并充滿計數(shù)池。靜置5～10min后，將計數(shù)板置于顯微鏡下進行計數(shù)。

1.2.3 制作石蠟切片

將固定好的睪丸和附睪組織依次置于梯度酒精中脫水，用二甲苯透明后，于石蠟中浸泡3h。包埋后，切成厚度為5μm的切片。將切片置于40℃左右溫水中展片，貼片后置于55℃恒溫干燥箱中烤片5h。

1.2.4 HE染色

石蠟切片經(jīng)脫蠟、復水后，切片放入蘇木素染液染3min，蒸餾水洗3min，分化液分化10s，蒸餾水洗2min，返藍液返藍20s，蒸餾水洗2min，伊紅染色8min，再用蒸餾水洗5min；依次放入梯度酒精脫水，再經(jīng)二甲苯透明后，用中性樹脂封片，置于正置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫熒光染色和免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)脫蠟、復水后，置于檸檬酸修復液進行高壓修復，TBST洗滌3次，每次5 min；切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加3%BSA封閉30min；4℃孵育一抗Occludin（1∶200）、connexin-43（1∶100）、N-cadherin（1∶50）、Vimentin（1∶200）和F-actin（1∶100）過夜；TBST洗滌3次；室溫避光孵育二抗50min；TBST洗滌。免疫熒光切片在圈內(nèi)滴加DAPI染液，室溫避光孵育10min；用少量防熒光猝滅劑封片。免疫組化切片則用DAB顯色5min，自來水終止顯色過程，蘇木精復染20s，自來水沖洗5min，分化液20s，自來水沖洗30s，返藍液20s，自來水沖洗5min，梯度脫水后用中性樹脂封片；利用正置熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.6 ELISA檢測小鼠睪丸組織NF-κB、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β和MPO的水平

（1）制備組織勻漿：將睪丸組織（g）：生理鹽水（mL）=1∶9的比例放入離心管中，機械勻漿后，將其放入低溫高速離心機內(nèi)2500r·min^-1離心10min，留取上清液存于-40℃；（2）加樣：設置酶標包被板的標準品孔和樣本孔，按說明書進行操作；（3）溫育：晃動酶標板混勻，用封板膜封板后37℃溫育30min；（4）洗滌：棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，重復5次，拍干；（5）加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外，用封板膜封板后置37℃溫育30min；（6）洗滌：同上操作；（7）顯色：每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，震蕩混勻，37℃避光顯色10min；（8）終止：每孔加終止液50μL，終止反應。使用酶標儀檢測各孔吸光度，以空白孔調(diào)零，450nm波長下測量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS26.0軟件對數(shù)據(jù)進行多重比較分析，Graphpad Prism9進行繪圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素處理緩解了白消安對小鼠睪丸的損傷

圖1A顯示，白消安處理顯著降低了睪丸重，而聯(lián)合MT處理7d后顯著緩解了睪丸重的降低；雖然白消安處理及聯(lián)合MT處理，小鼠體重均無顯著變化；但白消安處理顯著降低了睪體率，聯(lián)合MT處理7d后，也顯著增加了睪體率。HE染色結(jié)果顯示，對照組曲細精管管腔較小，管壁厚且生精細胞排列緊密（100×）。而白消安處理7d后，部分曲細精管管腔變大，出現(xiàn)少量的炎性細胞浸潤；14d后大量曲細精管管腔變大，細胞層數(shù)明顯減少；21d后，曲細精管大量空泡化，生殖細胞大量減少，且間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤。而聯(lián)合MT處理7d后，緩解了白消安處理導致的曲細精管管腔變大、細胞層數(shù)減少、炎性細胞浸潤的現(xiàn)象。因此，選擇白消安聯(lián)合MT處理7d進行后續(xù)的機理研究。圖1C顯示，與上述結(jié)果一致，聯(lián)合MT處理7d顯著的緩解了白消安引起的睪丸萎縮，顯著增加了睪丸重和睪體率，說明MT緩解了白消安引起的睪丸損傷。

2.2 褪黑素緩解了白消安處理鼠附睪精子數(shù)量下降的趨勢

為進一步分析MT對白消安處理鼠附睪精液的影響，對試驗鼠附睪精液進行精子密度檢測，發(fā)現(xiàn)白消安處理組精子密度顯著降低（Plt;0.05），而聯(lián)合MT處理后，顯著減緩了白消安處理導致的精子密度降低（Plt;0.05，圖2A）。附睪切片HE染色顯示（圖2B），白消安處理后，附睪尾精子數(shù)量明顯少于對照組（100×），而聯(lián)合MT處理后，附睪尾精子數(shù)量減少現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，說明MT緩解了白消安引起的精子發(fā)生障礙，精子生成有所好轉(zhuǎn)。

2.3 褪黑素緩解了白消安誘發(fā)的小鼠睪丸炎

為進一步明確MT的抗炎機理，對睪丸組織的NF-κB、p-NF-κB、TNF-α和IL-1β水平進行ELISA檢測，結(jié)果顯示（圖3），白消安處理組NF-κB、p-NF-κB、p-NF-κB/NF-κB、TNF-α和IL-1β水平顯著升高，而聯(lián)合MT處理則顯著抑制了NF-κB、p-NF-κB、p-NF-κB/NF-κB、TNF-α和IL-1β的升高；進一步檢測反映睪丸炎性細胞浸潤的MPO發(fā)現(xiàn)，白消安處理組MPO水平顯著升高，而聯(lián)合MT處理則顯著緩解了MPO水平升高，說明MT抑制了NF-κB信號通路的激活，降低了炎性細胞因子水平，減少了炎性細胞浸潤，從而緩解了白消安誘發(fā)的小鼠睪丸炎。

2.4 褪黑素緩解了白消安對BTB的損傷

BTB是維持精子發(fā)生龕環(huán)境的重要成分，為探究MT對白消安損傷BTB的影響，本研究通過免疫組化或免疫熒光檢測了BTB組成蛋白Occludin、connexin-43和N-cadherin的表達情況，結(jié)果顯示（圖4），緊密連接蛋白Occludin的棕褐色陽性信號出現(xiàn)在生殖細胞周圍（400×）。白消安處理后，曲細精管管壁變薄，生殖細胞大量減少，Occludin陽性信號明顯減少。而聯(lián)合MT處理后，緩解了曲細精管管壁變薄、生殖細胞大量減少、Occludin陽性信號明顯減少現(xiàn)象，說明MT緩解了白消安對緊密連接的損傷。

間隙連接蛋白connexin-43的免疫熒光染色顯示（圖5），connexin-43陽性信號出現(xiàn)在曲細精管基底層細胞附近（200×），并將生精細胞和支持細胞包圍起來，使之與基底膜分離。白消安處理后，基底層附近陽性信號減少，連續(xù)性降低，而聯(lián)合MT處理后，緩解了connexin-43陽性信號減少、連續(xù)性降低的現(xiàn)象，說明MT緩解了白消安對間隙連接的損傷。

免疫熒光檢測外質(zhì)特化相關(guān)蛋白N-cadherin結(jié)果顯示（圖6），發(fā)現(xiàn)陽性信號圍繞在曲細精管基底處精原干細胞和支持細胞附近。白消安處理后，基底層附近的陽性信號大幅減少，連續(xù)性降低（400×）。而聯(lián)合MT處理后，N-cadherin陽性信號大幅減少，連續(xù)性降低的趨勢明顯緩解，說明MT緩解了白消安對基底外質(zhì)特化的損傷。綜上所述，MT通過緩解白消安處理導致的Occludin、connexin-43和N-cadherin蛋白含量減少的趨勢，緩解了白消安對BTB的損傷。

2.5 褪黑素緩解了白消安對支持細胞骨架的損傷

白消安處理導致生精細胞脫落、細胞間隙增大，甚至出現(xiàn)空泡，推測白消安可能損傷了支持細胞的物理支撐作用，破壞了BTB完整性。為此，進一步通過免疫熒光檢測了支持細胞骨架蛋白Vimentin和F-actin的表達情況。結(jié)果顯示（圖7），對照組呈現(xiàn)較強Vimentin紅色熒光信號，該信號在曲細精管內(nèi)彌散分布，而白消安處理后，熒光信號明顯減少、強度減弱（400×）。聯(lián)合MT處理后，熒光信號減少、強度減弱的趨勢得到明顯緩解，說明MT緩解了白消安對Vimentin的損傷。

F-actin免疫熒光染色顯示（圖8），在基底外質(zhì)特化和頂端外質(zhì)特化位置呈現(xiàn)F-actin的綠色陽性信號。白消安處理后，基底層的陽性信號大幅減少、減弱，且?guī)缀蹩床灰姽芮粋?cè)陽性信號（400×）。而聯(lián)合MT處理后，基底層和管腔側(cè)F-actin陽性信號減少、減弱的趨勢明顯緩解（400×），說明MT緩解了白消安對F-actin的損傷。綜上表明，MT可緩解白消安導致的Vimentin和F-actin蛋白含量降低，增強了支持細胞骨架的支撐作用。

3 討 論

不同以往從降低氧化應激的角度緩解白消安對睪丸的損傷，本研究從炎癥角度驗證了MT可緩解白消安引起的睪丸損傷，揭示了白消安損傷睪丸和MT緩解損傷的機制，對提高精原干細胞移植受體制備效率、高效利用白消安等烷化劑進行癌癥治療并保護雄性生精機能提供了科學指導。

白消安處理顯著降低了睪丸重和睪體率，進一步降低了精子密度，而聯(lián)合MT處理后，緩解了睪丸重和睪體率下降的趨勢，也減緩了精子數(shù)量下降的速度，這也被以前已被以往的研究所證實^[13-15]，說明MT緩解了白消安對小鼠生精機能的損傷，對白消安誘導的睪丸損傷有保護作用，而具體機制尚不明確。

NF-κB是一種炎癥調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，可促進炎性細胞因子表達和釋放，誘導炎癥發(fā)生^[16]。前期研究表明，白消安處理損傷了生精細胞，使其釋放Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）的配體，激活支持細胞TLR2和TLR4，進而激活NF-κB信號通路，上調(diào)炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，誘導巨噬細胞浸潤到睪丸間質(zhì)，引發(fā)睪丸炎癥反應^[17-18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，白消安處理激活NF-κB信號通路，上調(diào)TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等水平，引起p53和Caspase-3蛋白水平增加，誘導小鼠生殖細胞凋亡^[19-20]。綜上，白消安可能通過NF-κB信號通路誘發(fā)睪丸炎，引起生精細胞凋亡，并進一步損傷生精機能。而MT可阻礙NF-κB轉(zhuǎn)運至細胞核，抑制NF-κB信號通路激活，降低促炎細胞因子TNF-α、IL-1β等的表達^[21-23]，這為利用MT緩解白消安誘發(fā)小鼠睪丸炎提供了理論支撐。本研究發(fā)現(xiàn)，注射白消安后，檢測到檢測到NF-κB、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β和MPO水平顯著上升，并且睪丸間質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞浸潤，證明白消安處理導致了小鼠睪丸炎。而聯(lián)合MT處理后，抑制了NF-κB信號通路激活，降低炎性細胞因子水平，減緩了炎性細胞標志因子MPO增加。因此，本研究證實了MT緩解白消安誘導的睪丸炎性細胞因子水平升高，從而減少組織中炎性細胞浸潤，減輕睪丸組織損傷。以往MT對白消安損傷睪丸的緩解作用，大多數(shù)報道從減少氧化損傷的角度闡明其保護機理^[12-13]，鮮見有關(guān)炎癥機制方面的結(jié)論。本研究指出，MT緩解了白消安誘發(fā)的小鼠睪丸炎，為白消安等烷化劑作用下雄性生精機能治療開辟了不同的視角。

支持細胞間及支持細胞和生精細胞間的緊密連接、間隙連接、外質(zhì)特化等成分構(gòu)成了BTB結(jié)構(gòu)，對維持精子發(fā)生環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮著關(guān)鍵作用^[24-26]。研究表明，雙酚A、鎘等環(huán)境毒物可上調(diào)炎性細胞因子水平，損傷BTB^[27-29]。同樣地，白消安也可上調(diào)炎性細胞因子，誘發(fā)睪丸炎，損傷BTB組成蛋白。另外，大鼠氣管滴注試驗進一步證明，PM2.5處理可提高睪丸組織炎性細胞因子水平，激活p38MAPK信號，降低BTB組成蛋白水平，破壞BTB完整性，阻礙精子發(fā)生，導致精子質(zhì)量下降^[30]。還有文獻表明，促炎細胞因子可破壞連接蛋白的內(nèi)吞、循環(huán)和降解過程，進而破壞BTB^{[6，31，32]}。綜上，細胞因子參與調(diào)控BTB的周期性重構(gòu)，以維持正常的精子發(fā)生。而MT處理則抑制NF-κB信號通路激活，緩解了LSP誘導的牛支持細胞炎癥反應，上調(diào)BTB組成蛋白ZO-1和Occludin水平^[11]。因此，本研究聯(lián)合MT處理小鼠，顯著緩解了白消安處理引起的炎性細胞因子水平升高趨勢，減緩了白消安處理導致的BTB組成蛋白Occludin、connexin-43和N-cadherin含量降低。推測，MT緩解了白消安誘發(fā)的小鼠睪丸炎，并減緩了BTB組成蛋白含量下降的趨勢，進而緩解了BTB結(jié)構(gòu)損傷。

白消安處理導致了睪丸炎，使曲細精管管腔變大，生精細胞大量脫落，一方面是因為破壞了BTB完整性，威脅到精子發(fā)生微環(huán)境的穩(wěn)定性，另一方面也可能是支持細胞萎縮的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，支持細胞骨架為BTB結(jié)構(gòu)完整性以及生精細胞發(fā)育提供物理支撐，若其受損，生精細胞將失去附著支撐，無法受到必要的信號轉(zhuǎn)導和營養(yǎng)供給等調(diào)控，危及精子發(fā)生^[33-34]。中間絲組成蛋白Vimentin與微管和微絲一起構(gòu)成了支持細胞的細胞骨架，對維持細胞形狀、分化及運動具有重要作用^[35]。另外，微絲組成蛋白F-actin為BTB相關(guān)蛋白提供了附著位點，以維持BTB的完整性^[36-38]。但研究發(fā)現(xiàn)，炎性細胞因子干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）、TNF-α、IL-6、白介素-8（interleukin-8，IL-8）和IL-1β分別處理心肌細胞，都導致了細胞骨架損傷^[39]，這說明高水平炎性細胞因子會損傷細胞骨架。而MT處理可提高細胞F-actin和Vimentin水平，促進微絲、微管和中間絲組裝成細胞骨架^[40-43]，這為利用MT緩解白消安損傷支持細胞骨架提供了理論支撐。本研究采用白消安處理小鼠，明顯降低睪丸組織Vimentin和F-actin含量，破壞了支持細胞骨架，使支持細胞萎縮，導致生精細胞萎縮、脫落，甚至消亡。而聯(lián)合MT處理緩解了白消安引起的F-actin和Vimentin含量下降趨勢。因此，MT可能通過下調(diào)睪丸組織中炎性細胞因子水平，增加細胞骨架蛋白F-actin和Vimentin水平，緩解白消安損傷支持細胞骨架和BTB結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本研究表明，MT通過降低TNF-α和IL-1β水平，減少炎性細胞浸潤，緩解了白消安誘發(fā)的小鼠睪丸炎，并通過減緩BTB組成蛋白（Occludin、connexin-43、N-cadherin）和細胞骨架蛋白（F-actin和Vimentin）含量下降，增強了支持細胞骨架的支撐作用，緩解了白消安對BTB和支持細胞的損傷，進而緩解了白消安損傷小鼠生精機能。

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（編輯 郭云雁）