肉羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)?；瘧?yīng)用中品種的影響

摘 要：旨在分析品種因素對(duì)OPU-IVEP商業(yè)化快繁效率的影響。本研究以經(jīng)品種鑒定的健康8月齡至3周歲黑頭薩?？恕⒑陬^杜泊、德克賽爾肉用種母羊?yàn)樵囼?yàn)供體，在內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司，采用OPU技術(shù)獲取卵母細(xì)胞并進(jìn)行體外胚胎工廠化生產(chǎn)或經(jīng)腹腔鏡輸精和手術(shù)沖胚獲得體內(nèi)胚胎，進(jìn)行胚胎移植，記錄卵母細(xì)胞回收、胚胎發(fā)育以及移植妊娠的相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較不同品種在體外胚胎規(guī)模化生產(chǎn)中卵母細(xì)胞回收效率、卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育能力、胚胎移植妊娠和產(chǎn)羔效率等方面的差異；同時(shí)，還比較了不同品種體內(nèi)、外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用效果。結(jié)果表明：1）3個(gè)品種間卵母細(xì)胞回收率差異極顯著（Plt;0.01），黑頭杜泊回收效率最高；2）3個(gè)品種的體外受精卵裂率無顯著差異（Pgt;0.05），但德克賽爾羊的囊胚發(fā)育率極顯著高于其他兩個(gè)品種（Plt;0.01）；3）無論體內(nèi)胚胎還是體外胚胎生產(chǎn)移植，各品種間胚胎移植受胎率和平均產(chǎn)羔數(shù)均無顯著差異（Pgt;0.05），且各品種內(nèi)，體內(nèi)胚胎和體外胚胎移植的平均受胎率和產(chǎn)羔率均無顯著差異（Pgt;0.05）。綜上所述，在工廠化、規(guī)?；瘧?yīng)用綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)過程中，不同品種間卵泡發(fā)育、回收卵母細(xì)胞數(shù)、囊胚發(fā)育率等存在差異，平均卵泡數(shù)和平均回收卵母細(xì)胞最少的德克塞爾羊的囊胚發(fā)育率最高；移植后受胎和產(chǎn)羔情況在不同品種間無顯著差異，體內(nèi)胚胎和體外胚胎單次生產(chǎn)獲得的后代數(shù)也無顯著差異，但OPU-IVEP的供體利用率遠(yuǎn)大于MOET。

關(guān)鍵詞：品種；肉羊；體外胚胎生產(chǎn)；胚胎移植；規(guī)?；?；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S826.92; S826.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2451-09

收稿日期：2023-10-10

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（2022E02017）；“科技創(chuàng)新2030”項(xiàng)目子課題（2022ZD040130305）；自治區(qū)重大專項(xiàng)（2023A02011）

作者簡(jiǎn)介：陳 瑩（1990-），女，湖北鐘祥人，博士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：88370828@qq.com；陳大勇（1981-），男，內(nèi)蒙古扎賚特旗人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：Chendayong81@126.com。陳瑩和陳大勇為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：汪立芹，主要從事動(dòng)物繁殖與胚胎生物技術(shù)研究，E-mail：wlq6304@126.com；安 磊，主要從事動(dòng)物繁殖與胚胎工程研究，E-mail：anleim@cau.edu.cn

Influence of Meat Sheep Varieties on the Scale Application of

in vitro Embryo Production Technology

CHENYing¹，CHENDayong³，WURiga³，QIUChunjuan³，F(xiàn)ANLihong³，BAOMeirong³，

YUEYuan²，LIANGHongyan¹，ZHANGJiaxin⁴，TIANJianhui²，ANLei^2*，WANGLiqin^1*

（1.Key Laboratory of Genetics Breeding and Reproduction of Grass Feeding Livestock of

Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Urumqi830011，China; 2.China

Agricultural University，Beijing100193，China; 3.Inner Mongolia Sino Sheep

Technology Co.Ltd.，Ulanqab011800，China; 4.Inner Mongolia Agricultural

University，Hohhot010018，China）

Abstract：The aim of this study was to explore the impact of breed factors on the efficiency of commercial rapid propagation of OPU-IVEP.This study used healthy8-month-old to3-year-old black headed Suffolk，black headed Dorper，and Texel meat breeding ewes identified by breed identification as donors.OPU technology was used to obtain oocytes at Inner Mongolia Saino Sheep Technology Co.，Ltd.for in vitro embryo factory production or in vivo embryos obtained through laparoscopic insemination and surgical flushing.Embryo transfer was performed，and relevant data of oocyte recovery，embryo development，and transfer pregnancy were recorded for statistical analysis.Compare tThe differences in oocyte recovery efficiency，oocyte in vitro fertilization and embryo development ability，embryo transfer pregnancy and lambing efficiency among different breeds in large-scale in vitro embryo production was compared; At the same time，the application effects of in vivo and in vitro embryo production technologies of different breeds were also compared.The results showed that：1）there was asignificant difference in oocyte recovery rates among the3breeds（Plt;0.01），with the highest recovery efficiency observed in the black headed Dorper; 2）There was no significant difference in the in vitro fertilization and cleavage rates among the3breeds（Pgt;0.05），but the blastocyst development rate of Texel sheep was significantly higher than the other2breeds（Plt;0.01）; 3）There was no significant difference（Pgt;0.05）in the conception rate and average number of lambs produced by embryo transfer between different breeds，whether in vivo or in vitro，and there was no significant difference（Pgt;0.05）in the average conception rate and lambing rate of in vivo and in vitro embryo transfer amongindifferent breeds.In summary，in the process of OPU-IVEP industrial and large-scale application in sheep in vitro embryo production，there are differences in the efficiency among different breeds，such as follicle development，number of retrieved oocytes，and blastocyst development rate.Texel sheep，which has the lowest average number of follicles and average number of retrieved oocytes，has the highest blastocyst development rate; The conception and lambing situation after transplantation，which directly affects the efficiency of rapid reproduction，did not show significant differences among different varieties，and there was no significant difference in the number of offspring obtained from single production of in vivo and in vitro embryos.However，the donor utilization rate of OPU-IVEP is higher than that of MOET.

Key words：breed; meat sheep; in vitro embryo production; embryo transfer; scaling; application

*Corresponding authors：WANG Liqin，E-mail：wlq6304@126.com; AN Lei，E-mail：anleim@cau.edu.cn

體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)（in vitro embryo production，IVEP）是卵母細(xì)胞回收、卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）、體外受精（in vitro fertilization，IVF）、體外胚胎培養(yǎng)（in vitro culture，IVC）、胚胎移植（embryo transfer，ET）、胚胎冷凍保存等技術(shù)的集成^[1-2]。其中任何環(huán)節(jié)都可能直接或間接地影響最終生產(chǎn)效率，比如供受體的品種^[3]及體況^[4]、激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育的處理方案^[5-7]、卵母細(xì)胞獲取方式^[8]、體外成熟和培養(yǎng)體系^[9-10]、移植胚胎等級(jí)和數(shù)量^[11]、生產(chǎn)季節(jié)^[12]等等。以品種因素為例，Denicolo等^[13]就在其研究中指出，東弗里升（East Friesian，EF）母羊在夏季妊娠率（60%）極顯著高于羅姆尼（Romney）母羊；另外，IVEP技術(shù)研究的深入和普及程度也與畜種的經(jīng)濟(jì)價(jià)值密切相關(guān)。因此，目前能實(shí)現(xiàn)IVEP技術(shù)規(guī)?；瘧?yīng)用的畜種還比較少。國際上，除了牛上規(guī)?；瘧?yīng)用的報(bào)道較多以外^[14]，鮮少見到關(guān)于綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物體外胚胎規(guī)?；瘧?yīng)用的報(bào)道。近年來，隨著國人生活水平的提高，羊肉的人均消費(fèi)量逐年提升，消費(fèi)者也更加注重羊肉的品質(zhì)，因而對(duì)優(yōu)質(zhì)肉用種羊的需求隨之增加。為了更好地滿足多元化的市場(chǎng)消費(fèi)需求，縮小我國與肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)國家之間的差距，著力提升企業(yè)育種規(guī)劃能力和育種技術(shù)水平，是國家打好種業(yè)翻身仗的關(guān)鍵舉措^[15]。

制約綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物體外胚胎規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵因素是卵母細(xì)胞資源的獲取方式和利用率^[16]。活體采卵（ovum pick-up，OPU）可以有效解決該問題，將其與IVEP技術(shù)結(jié)合，可大大提高具有高遺傳價(jià)值優(yōu)秀母畜的利用率和繁殖效率，批量生產(chǎn)系譜齊全、遺傳背景清楚的胚胎及其后代，緩解胚胎來源匱乏的問題，促進(jìn)胚胎移植的商業(yè)化進(jìn)程^[17-18]，同時(shí)也有助于增加選擇強(qiáng)度和縮短世代間隔^[19-20]，有利于優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源繁殖潛力的深度挖掘^[21]。健全的體外胚胎生產(chǎn)體系還能為大量科學(xué)研究提供所需的胚胎，如為細(xì)胞核移植、基因編輯、胚胎干細(xì)胞等試驗(yàn)研究提供材料^[22]，以及用于拯救瀕危保護(hù)動(dòng)物物種^[23-24]。

為了優(yōu)化綿羊體外胚胎規(guī)?；瘧?yīng)用技術(shù)體系，加快肉用種羊的繁殖速度和遺傳改良進(jìn)程，本研究系統(tǒng)分析了品種因素對(duì)體外胚胎生產(chǎn)效率和規(guī)?；瘧?yīng)用的影響。為OPU-IVEP技術(shù)在黑頭杜泊、黑頭薩福克、德克賽爾種羊上的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為該技術(shù)在其他肉用綿羊品種上的應(yīng)用提供借鑒。同時(shí)，如此大規(guī)模的完整且高效的綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用體系，也將為相關(guān)研究和生產(chǎn)工作起到良好的示范作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供、受體的選擇

本研究所用的黑頭薩?？四秆?、黑頭杜泊母羊、德克賽爾母羊等供體來源于內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司，均為經(jīng)種畜鑒定符合各品種特征、體格健壯、膘情適中、無繁殖疾病的8月齡至3周歲良種母羊。受體母羊?yàn)榻】禑o繁殖疾病的蒙古羊，由與賽諾公司有長(zhǎng)期合作關(guān)系的養(yǎng)殖戶提供，飼養(yǎng)管理方式按照公司統(tǒng)一要求進(jìn)行。在同期發(fā)情處理前半個(gè)月，將受體母羊從合作社運(yùn)送至公司做適應(yīng)性訓(xùn)練。

1.1.2 精液的選擇

根據(jù)品種選育規(guī)劃，本研究所用凍精全部為進(jìn)口定制凍精，由公司聘請(qǐng)專人前往生產(chǎn)國進(jìn)行供精種公羊的篩選，購買后由凍精生產(chǎn)公司代為生產(chǎn)。黑頭杜泊羊細(xì)管凍精由ALLSTOCK（WA）公司（澳大利亞）生產(chǎn)；黑頭薩?？撕偷驴速悹栄蚣?xì)管凍精由ANIMAL BREEDING SERVICE公司（新西蘭）生產(chǎn)。

1.1.3 激素及試劑耗材

供受體同期發(fā)情用孕酮海綿栓購自Zoetis（澳大利亞）公司；卵泡刺激素（FSH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）、黃體酮等購自寧波三生藥業(yè)有限公司（寧波）；體外胚胎生產(chǎn)所使用的抽卵液、IVM液、IVF液、IVC液、移植液等均為博瑞鼎^?體外胚胎培養(yǎng)系列產(chǎn)品（新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊）。其它生化試劑除特別注明外均為Sigma公司（中國）生產(chǎn)。

1.2 體外胚胎生產(chǎn)及移植

1.2.1 供體激素處理及卵母細(xì)胞回收

誘導(dǎo)供體羊卵泡發(fā)育的方法參考本研究室相關(guān)文獻(xiàn)^[25]。即在供體母羊發(fā)情周期的任意1d放置孕酮海綿栓，放栓當(dāng)天記為第0天，放栓的第10～12天，早晚2次肌肉注射FSH，每?jī)纱巫⑸溟g隔時(shí)間約12h，F(xiàn)SH總劑量為480IU。注射第6針FSH12h后，應(yīng)用微創(chuàng)活體采卵技術(shù)（OPU）采集卵母細(xì)胞，采集完成后取出海綿栓，每只供體的平均采卵間隔周期為1個(gè)月。供體羊只術(shù)前36h禁食、12h禁飲。采集卵母細(xì)胞時(shí)，使用穿刺器分別在距離乳房腹中線的左側(cè)、中間和右側(cè)各穿刺一小孔，左側(cè)孔插入腹腔鏡光源，中間孔插入采卵針，右側(cè)孔插入抓鉗；利用抓鉗固定卵巢，打開負(fù)壓泵開始抽吸卵泡液，體式鏡下?lián)烊』厥盏穆亚?卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complexes，COCs），記錄數(shù)量并統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞回收率。

1.2.2 卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)

卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)方法參考本研究室相關(guān)文獻(xiàn)^[25]。即回收的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體用抽卵液洗滌3遍，IVM液洗滌3遍后，將每只供體回收的卵母細(xì)胞單獨(dú)放入平衡好的IVM孔內(nèi)培養(yǎng)。

經(jīng)IVM培養(yǎng)22～26h后的COCs取出置于0.1%的透明質(zhì)酸酶中輕吹，去除卵母細(xì)胞周圍大塊卵丘細(xì)胞，用IVF液洗滌3遍，放入對(duì)應(yīng)的IVF4孔板內(nèi)。解凍后的進(jìn)口凍精置于IVF液中上游獲能30min，按照1×10⁶個(gè)·mL^-1的密度將精子沉淀加入已放置卵母細(xì)胞的IVF孔內(nèi)，與卵母細(xì)胞共孵育。

精卵共孵育22～24h，取出假定受精卵置于平衡好的IVC液中輕輕吹吸，洗去周圍的卵丘細(xì)胞和殘留精子，放入對(duì)應(yīng)的IVC4孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)（5%CO₂，5%O₂，90%N₂），受精48h統(tǒng)計(jì)卵裂胚胎數(shù)。

1.2.3 體外胚胎移植

分別于受精第6和第7天統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育率，并應(yīng)用腹腔鏡進(jìn)行子宮角胚胎移植。根據(jù)胚胎質(zhì)量與受體數(shù)量情況，每只受體移植1或2枚胚胎。剩余的胚胎用玻璃化冷凍方法進(jìn)行冷凍保存。

受體的同期發(fā)情處理：與供體同時(shí)放栓，在放栓后的第12天撤栓，同時(shí)注射333IU的PMSG。先查看兩側(cè)卵巢上的黃體情況，將胚胎移植至有黃體或者黃體較好一側(cè)的子宮角內(nèi)。移植后35～40d進(jìn)行B超妊娠檢查，統(tǒng)計(jì)受胎率。

1.3 體內(nèi)胚胎生產(chǎn)及移植

1.3.1 供體激素處理及腹腔鏡深部輸精

供體激素處理方案同體外胚胎。注射第5次FSH時(shí)，撤出海綿栓，同時(shí)肌肉注射PG（0.1mg·只^-1），注射第6次FSH后試情，發(fā)情母羊肌肉注射LH（200IU·只^-1）。發(fā)情14～18h應(yīng)用腹腔鏡進(jìn)行子宮角輸精，每側(cè)輸入有效精子數(shù)不少于1×10⁷個(gè)。

1.3.2 手術(shù)沖胚及胚胎移植

在超排發(fā)情后6～7天，應(yīng)用手術(shù)方式從子宮角采集發(fā)育到桑葚胚或囊胚階段的胚胎。胚胎移植和體外胚胎相同，每只受體依據(jù)胚胎質(zhì)量移植1或2枚。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”和百分率（%）表示，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 品種對(duì)激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞回收的影響

去除非熟練掌握活體采卵技術(shù)人員的采卵數(shù)據(jù)，要求詳細(xì)記錄采集供體的卵泡數(shù)和回收的卵母細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如表1所示：經(jīng)外源激素處理后，德克賽爾羊的卵泡發(fā)育效果極顯著低于黑頭杜泊羊（Plt;0.01），顯著低于黑頭薩?？搜颍≒lt;0.05），而黑頭杜泊羊和黑頭薩?？搜蛑g無顯著差異（Pgt;0.05）。黑頭杜泊羊的卵母細(xì)胞回收效率回收效果最好，平均達(dá)到21.19枚·次^-1；德克賽爾羊效果最差，僅為13.2枚·次^-1；黑頭薩?？私橛诙咧g，為17.44枚·次^-1；3個(gè)品種間卵母細(xì)胞回收率差異極顯著（Plt;0.01）。

2.2 品種對(duì)卵母細(xì)胞體外受精及胚胎發(fā)育效果的影響

通過對(duì)2020年1月至2021年6月間獲得的40103枚3個(gè)肉羊品種的卵母細(xì)胞體外受精及移植早期胚胎后剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的發(fā)育數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)（表2）：3個(gè)品種的體外受精卵裂率間無顯著差異（Pgt;0.05），平均為73.11%。但德克賽爾羊的囊胚發(fā)育率極顯著高于黑頭薩?？撕秃陬^杜泊（69.09%vs53.54%和57.06%，Plt;0.01），后兩者間囊胚率無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3 不同品種體外和體內(nèi)胚胎生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用效果比較

應(yīng)用OPU-IVEP技術(shù)，將獲得的不同品種體外胚胎進(jìn)行移植。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，各品種間胚胎移植受胎率和平均產(chǎn)羔數(shù)沒有差異，平均每只供體單次可得到3.28只后代（表3）。而每只供體終身可進(jìn)行15次以上OPU-IVEP^[16]，即終身可得到約49.2只后代。

對(duì)比體內(nèi)胚胎生產(chǎn)技術(shù)，對(duì)5479只次供體應(yīng)用MOET技術(shù)的生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每只供體單次平均可得到5.20枚可用胚胎，移植后懷孕率為71.49%，平均每只供體可得到3.12只后代，各品種間回收可用胚胎數(shù)、移植受胎率和平均產(chǎn)羔數(shù)皆無顯著差異（Pgt;0.05，表4）。按照每只供體平均能夠進(jìn)行3次MOET計(jì)算，終身獲得后代數(shù)為9.36只。

3 討 論

體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)獲得的后代在人類醫(yī)學(xué)中被稱為試管嬰兒，自1978年首例試管嬰兒在英國誕生以來^[26]，該技術(shù)已經(jīng)在各類動(dòng)物的相關(guān)研究中得到廣泛應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)在于：能充分利用母畜的卵母細(xì)胞資源，快速擴(kuò)繁優(yōu)質(zhì)種群數(shù)量^[27]；能縮短世代間隔，對(duì)新品種培育意義重大^[28]；結(jié)合現(xiàn)代分子育種技術(shù)，在胚胎階段即能實(shí)現(xiàn)品種改造^[29]。本研究關(guān)注品種因素對(duì)體外胚胎生產(chǎn)過程中卵母細(xì)胞回收效率、體外發(fā)育卵裂率和囊胚率、胚胎移植受胎率和妊娠產(chǎn)羔率等數(shù)據(jù)的影響。

卵母細(xì)胞的回收效率可以通過平均回收卵母細(xì)胞數(shù)（回收卵母細(xì)胞數(shù)/供體采卵次數(shù)）和卵母細(xì)胞回收率（回收卵母細(xì)胞數(shù)/卵泡數(shù)）體現(xiàn)。較高的回收效率首先要通過保證供體母羊有較好的激素反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，即卵泡數(shù)量多且飽滿健康^[30-31]。本研究中3個(gè)肉羊品種的激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育效果均較好，單個(gè)每對(duì)卵巢達(dá)到13～18個(gè)發(fā)育卵泡，且卵母細(xì)胞回收率都接近甚至超過100%，使得平均供體回收的可用卵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到13～21枚·只^-1，略高于當(dāng)前該應(yīng)用研究領(lǐng)域的平均水平：綿羊10枚·只^-1，山羊14枚·只^-1可用卵母細(xì)胞^[32]。卵母細(xì)胞回收率反映了采卵人員技術(shù)水平，越趨近于100%說明采卵人員技術(shù)越熟練、經(jīng)驗(yàn)越豐富，卵母細(xì)胞回收過程中的人為損失越少。出現(xiàn)超過100%的情況，可能是由于腹腔鏡采卵時(shí)，針對(duì)卵巢上緊密排列的小卵泡會(huì)一次進(jìn)針串聯(lián)吸取，存在將串連起來的小卵泡記數(shù)小于實(shí)際數(shù)量的情況，使得回收到的卵母細(xì)胞數(shù)高于卵泡數(shù)^[33]。因此我們推斷，本研究中不同品種間OPU回收效率的不同，并非采卵人員的技術(shù)水平差異，而是3個(gè)品種對(duì)激素的反應(yīng)水平不同。有研究人員比較了5個(gè)優(yōu)質(zhì)肉用綿羊品種的超數(shù)排卵效果，發(fā)現(xiàn)杜泊羊平均黃體數(shù)為16.00個(gè)·只^-1，其次為德克塞爾13.80個(gè)·只^-1，均顯著高于白頭薩?？恕⒑陬^薩?？艘约懊览颍≒lt;0.05），說明杜泊羊?qū)に氐姆磻?yīng)效果最好^[34]，這與本研究3個(gè)品種中黑頭杜泊羊平均卵泡數(shù)最高的結(jié)果一致。然而該研究中杜泊羊回收的可用胚胎數(shù)卻并非最高，僅有6.25枚·只^-1，比理論排卵數(shù)（16.00）減少了一半以上。巧合的是，本研究中卵母細(xì)胞回收效果最好的黑頭杜泊羊體外受精后胚胎繼續(xù)發(fā)育至囊胚比例也是最低的?？梢娖贩N間的胚胎發(fā)育能力確實(shí)存在差異。值得一提的是，岳媛等^[35]在賽諾種羊科技有限公司2019-2021年間不同品種對(duì)OPU-IVEP效率影響的分析研究中，黑頭薩?？?、黑頭杜泊、德克塞爾羊的卵裂率分別為74.77%、66.88%、66.47%，囊胚率分別為58.30%、51.62%、61.08%，與本研究中卵裂率（76.77%、72.94%、71.98%）和囊胚率（57.06%、53.54%、69.09%）數(shù)據(jù)的規(guī)律基本一致，更加說明了數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，數(shù)值上稍有偏差是由于統(tǒng)計(jì)的整體數(shù)據(jù)量不同導(dǎo)致，本研究?jī)H統(tǒng)計(jì)了2020年1月至2021年6月的數(shù)據(jù)。此外，有研究表明，荷斯坦奶牛OPU試驗(yàn)中，卵泡直徑小于或等于4mm的卵母細(xì)胞回收率高于卵泡直徑大于4mm的回收率（Plt;0.01）^[36]。由此推斷，本研究中黑頭杜泊羊卵泡直徑相對(duì)較小。有研究指出，從不同直徑綿羊卵泡中回收的卵母細(xì)胞體外受精后囊胚發(fā)育能力不同，直徑大于等于3mm卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率（（11.1±0.9）%）高于直徑小于3mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞（（6.5±0.7）%）。小卵泡液中的雌二醇（E₂）、孕激素（P）含量以及二者的比值（E₂：P）均比較低，可能是導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量及后續(xù)體外胚胎發(fā)育能力低下的原因^[37]。

本研究中，3個(gè)品種供體單次實(shí)施OPU獲得的平均產(chǎn)羔數(shù)為3.12只，各品種間移植受胎率和平均產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著差異（Pgt;0.05），同一肉羊品種在體內(nèi)和體外胚胎移植的受胎率和平均產(chǎn)羔數(shù)之間也沒有顯著差異。說明供體品種的影響主要體現(xiàn)在卵母細(xì)胞回收和早期胚胎發(fā)育階段，隨機(jī)選定胚胎移植后的受胎率以及產(chǎn)羔率不受供體品種的影響，但可能與受體的營養(yǎng)狀況、子宮容受性等因素相關(guān)^[38]。對(duì)比OPU-IVEP與MOET技術(shù)，OPU-IVEP過程具有侵入性小、短時(shí)間可重復(fù)操作次數(shù)多、不易造成供體動(dòng)物腹腔生殖系統(tǒng)粘連的優(yōu)點(diǎn)^[13]。在綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物中，按每只供體一生可以開展15次OPU計(jì)算，獲得后代數(shù)量是其開展3次MOET技術(shù)的近5倍（49.2vs.9.36），OPU-IVEP的胚胎生產(chǎn)效率遠(yuǎn)高于體內(nèi)胚胎^[39]。OPU-IVEP的應(yīng)用使得雌性動(dòng)物可繁殖出更多后代，是優(yōu)良種質(zhì)資源價(jià)值最大化的有力途徑。

項(xiàng)目組自2011年開始將綿羊卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)向生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。在應(yīng)用過程中逐漸研發(fā)新的配套技術(shù)，完善建成了完善的體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系。自2014年該技術(shù)在內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司和新疆部分養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)用以來，已在6個(gè)綿羊品種、3個(gè)山羊品種上展開應(yīng)用，包括黑頭杜泊、白頭杜泊、黑頭薩?？?、白頭薩福克、德克賽爾、東弗里升等綿羊品種，薩能、阿爾卑斯、吐根堡等山羊品種。生產(chǎn)的體外胚胎部分移植后，僅綿羊上已獲得了3萬多只試管種羊。部分胚胎培養(yǎng)至囊胚，應(yīng)用玻璃化冷凍技術(shù)進(jìn)行冷凍保存。

當(dāng)前，項(xiàng)目組開展了對(duì)綿羊OPU-IVEP技術(shù)的應(yīng)用與推廣工作，其規(guī)模在全國乃至全世界皆備受矚目。后期進(jìn)一步推廣和大規(guī)模應(yīng)用需要OPU-IVEP技術(shù)的精進(jìn)，應(yīng)該從兩個(gè)方面著手：一方面是進(jìn)一步提高腹腔鏡采卵效率，既要增加卵母細(xì)胞回收數(shù)量，還需保證卵母細(xì)胞質(zhì)量，在調(diào)整激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育方案^[40]、優(yōu)化抽吸條件、確保優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞占比等方面^[41]均有提升空間；另一方面是提高體外胚胎發(fā)育效率，有針對(duì)性地提高小卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育率，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞總利用率。OPU-IVEP技術(shù)應(yīng)用前景廣闊，無論從動(dòng)物福利角度，還是從胚胎生產(chǎn)、運(yùn)輸、移植的時(shí)效性考慮，都是當(dāng)前最為高效的兼具工廠化、個(gè)性化、規(guī)?；匦缘纳a(chǎn)技術(shù)。

4 結(jié) 論

本研究表明，不同肉羊品種間激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育情況和實(shí)施OPU卵母細(xì)胞回收率均存在差異，獲得的卵母細(xì)胞體外受精能力沒有顯著差異但囊胚發(fā)育率存在差異；平均卵泡數(shù)和回收卵母細(xì)胞最少的德克塞爾羊的囊胚發(fā)育率卻最高；移植后受胎和產(chǎn)羔情況在不同品種間無顯著差異，體內(nèi)胚胎和體外胚胎單次生產(chǎn)獲得的后代數(shù)無顯著差異，但OPU-IVEP的供體利用率遠(yuǎn)大于MOET，且手術(shù)間隔短、術(shù)后粘連少，企業(yè)開展體外胚胎商業(yè)化生產(chǎn)更為高效。

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（編輯 郭云雁）