基于轉(zhuǎn)錄組測序分析SOX18在湖羊毛囊毛乳頭細(xì)胞中的功能

摘 要：旨在初步探究SOX18基因在湖羊毛囊毛乳頭細(xì)胞中的功能。本研究首先采用免疫熒光染色試驗(yàn)對從湖羊毛囊中分離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，然后構(gòu)建SOX18基因過表達(dá)載體并通過qRT-PCR和Western blot檢測其過表達(dá)效率。將經(jīng)過鑒定且生長狀態(tài)良好的毛乳頭細(xì)胞分為兩組，分別轉(zhuǎn)染SOX18過表達(dá)載體和空載質(zhì)粒，每組3個(gè)重復(fù)。采用Trizol法提取6個(gè)樣本的總RNA并構(gòu)建cDNA文庫，利用Illumina Novaseq6000平臺(tái)進(jìn)行測序，然后對樣本相關(guān)性和差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類和KEGG通路注釋，尋找SOX18基因調(diào)控的相關(guān)候選基因和通路。為確認(rèn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。免疫熒光結(jié)果顯示，毛乳頭相關(guān)基因在所分離的細(xì)胞中高表達(dá)，表明所分離的毛乳頭細(xì)胞純度高。qRT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，SOX18基因過表達(dá)能夠增加毛乳頭細(xì)胞中SOX18的mRNA和蛋白水平，表明構(gòu)建的SOX18基因過表達(dá)載體可用于后續(xù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明樣本間相關(guān)性好，SOX18過表達(dá)組和對照組相比共發(fā)現(xiàn)157個(gè)基因差異表達(dá)，其中103個(gè)基因在SOX18過表達(dá)后上調(diào)，54個(gè)基因下調(diào)，qRT-PCR分析表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高。GO功能分析顯示，一些差異基因富集于細(xì)胞進(jìn)展和毛囊發(fā)育過程。KEGG富集分析表明，一些差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞增殖和毛囊發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路。GO功能分析和KEGG富集分析表明SOX18在毛乳頭細(xì)胞的增殖和毛囊發(fā)育過程中起作用。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)SOX18可能通過影響細(xì)胞增殖和毛囊發(fā)育相關(guān)的基因和信號(hào)通路來影響毛乳頭細(xì)胞增殖和毛囊生長發(fā)育，研究結(jié)果為解析SOX18基因在湖羊毛乳頭細(xì)胞和毛囊中的分子調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄組測序；SOX18；毛囊；毛乳頭細(xì)胞；湖羊

中圖分類號(hào)：S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2409-12

收稿日期：2023-09-25

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（BK20210810）；國家自然科學(xué)基金（32172689）；江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（PZCZ201739）；江蘇省“333工程”計(jì)劃項(xiàng)目（（2022）2-323）；江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（20KJB230003; 22KJA230001）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（23）1036）；揚(yáng)州大學(xué)“高端人才計(jì)劃-領(lǐng)軍人才”培養(yǎng)項(xiàng)目；教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室開放課題（JILAR-KF202103）；江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX23_3593）

作者簡介：何明亮（1995-），男，河南信陽人，博士，主要從事動(dòng)物遺傳與育種研究，E-mail：13013706620@163.com

*通信作者：孫 偉，主要從事羊品種資源與分子標(biāo)記育種研究，E-mail：dkxmsunwei@163.com；王善禾，主要從事羊品種資源與分子標(biāo)記育種研究，E-mail：shanhe12315@163.com

Function Analysis of SOX18in Hu Sheep Hair Follicle Dermal Papilla

Cells Based on Transcriptome Sequencing

HEMingliang¹，LüXiaoyang^2，3，JIANGYongqing⁴，SONGZhenghai⁵，WANGYeqing⁶，

YANGHuiguo⁷，WANGShanhe^{1，2，3*}，SUNWei^{1，2，3*}

（1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou225009，China;

2.Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of

Education of China，Yangzhou225009，China; 3.International Joint Research Laboratory in

Universities of Jiangsu Province of China for Domestic Animal Germplasm Resources and Genetic

Improvement，Yangzhou225009，China; 4.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou

310021，China; 5.Suzhou Wuzhong District Dongshan Animal Epidemic Prevention Station，

Suzhou215107，China; 6.Suzhou Taihu Dongshan Hu Sheep Industry Development Co.，Ltd，

Suzhou215107，China; 7.Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi830011，China）

Abstract：The purpose of this study was to preliminary investigate the function of the SOX18gene in Hu sheep hair follicle dermal papilla cells.In this study，immunofluorescence staining was used to identify cells isolated from the hair follicles of Hu sheep.Subsequently，an overexpression vector of the SOX18gene was conducted，and its overexpression efficacy was assessed using qRT-PCR and Western blot.The dermal papilla cells successfully identified and well-grown were divided into two groups.One group was transfected with SOX18overexpression vector，while the other was transfected with empty plasmid.Each group had3replicates.The total RNA was extracted from6samples using the Trizol method，followed by the construction of acDNA library.The Illumina Novaseq6000platform was used for sequencing.Subsequently，sample correlation and differentially expressed genes were analyzed.The differentially expressed genes were categorized based on GO and annotated using the KEGG pathway analysis to identify candidate genes and pathways associated with the regulation of the SOX18gene.To confirm the accuracy of the transcriptome data，9differentially expressed genes were randomly chosen for qRT-PCR analysis.The immunofluorescence results revealed dermal papilla-related genes had high expression in isolated cells，indicating ahigh purity of the isolated dermal papilla cells.qRT-PCR and Western blot results showed that overexpression of the SOX18gene could increase the mRNA and protein levels of SOX18in dermal papilla cells，indicating that the SOX18overexpression vector could be used for subsequent experiments.Transcriptome analysis results showed agood correlation between samples.A total of157genes were differentially expressed between the SOX18overexpression group and the control group，of which103genes were up-regulated after SOX18overexpression and54genes were down-regulated.qRT-PCR analysis showed high accuracy of transcriptome data.GO functional analysis showed that some differential genes were enriched in cell progression and hair follicle development.KEGG enrichment analysis showed that some differentially expressed genes were enriched in signaling pathways related to cell proliferation and hair follicle development.GO functional analysis and KEGG enrichment analysis indicated that SOX18played arole in the proliferation of dermal papilla cells and the development of hair follicles.In this study，transcriptome sequencing analysis found that SOX18may affect the proliferation of dermal papilla cells and the development of hair follicles by affecting genes and signaling pathways related to cell proliferation and hair follicle development.The study results provide atheoretical basis for understanding the molecular regulatory mechanism of the SOX18gene in Hu sheep dermal papilla cells and hair follicles.

Key words：transcriptome sequencing; SOX18; hair follicles; dermal papilla cells; Hu sheep

*Corresponding authors：SUN Wei，E-mail：dkxmsunwei@163.com; WANG Shanhe，E-mail：shanhe12315@163.com

羊毛作為羊毛紡織品的重要原材料，其生產(chǎn)對世界紡織業(yè)有著重大影響。因此，關(guān)注羊毛生產(chǎn)對于羊毛產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展是不可或缺的。眾所周知，羊毛是從毛囊中生長出來的，毛囊的生長不可避免地會(huì)影響羊毛的生產(chǎn)。毛囊（hair follicles，HFs）是由毛囊上皮細(xì)胞和毛囊間充質(zhì)細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，毛囊上皮包括毛干、內(nèi)根鞘、伴生層、外根鞘和毛囊基質(zhì)，毛囊基質(zhì)又包括真皮乳頭和結(jié)締組織鞘，這些細(xì)胞通過相互調(diào)節(jié)參與毛囊生長、分化和周期性生長的調(diào)節(jié)過程^[1]。毛乳頭位于毛球的中心區(qū)域，它可以激活毛基質(zhì)細(xì)胞來維持和啟動(dòng)毛囊生長周期^[2]。毛乳頭細(xì)胞（dermal papilla cells，DPCs）被認(rèn)為能夠通過外泌體在HFs的生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用^[3]。Kwack等^[4]發(fā)現(xiàn)，人DPCs中提取的外泌體可以促進(jìn)DPCs和外根鞘細(xì)胞的增殖，還能夠誘導(dǎo)小鼠毛發(fā)從休止期進(jìn)入生長期并促進(jìn)小鼠毛干伸長，這表明DPCs可以通過其外泌體調(diào)節(jié)毛囊中其他細(xì)胞的活性來促進(jìn)毛發(fā)生長。此外，毛乳頭的存在也有助于完整毛囊的形成，并促進(jìn)頭發(fā)生長^[5]。因此，開展對DPCs的研究有助于了解其對毛囊生長的調(diào)控作用。

轉(zhuǎn)錄因子SOX18是SOX家族的成員，該家族由一類與早期胚胎發(fā)育有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子組成^[6]。研究表明，SOX18突變會(huì)導(dǎo)致人類少毛癥-淋巴水腫-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（HLT）綜合征的發(fā)生^[7]。在小鼠中，SOX18突變能夠誘導(dǎo)小鼠RA表型的產(chǎn)生，其中雜合子小鼠表現(xiàn)出粗糙的毛發(fā)，而純合子小鼠則完全無毛^[8]。Pennisi等^[9]通過構(gòu)建SOX18^-/-小鼠發(fā)現(xiàn)了RA小鼠毛發(fā)缺陷的原因是皮膚毛囊總數(shù)減少^[10]。目前，綿羊毛囊中關(guān)于SOX18的報(bào)道較少。在我們本課題組之前的研究中，通過對湖羊花紋表型羊毛毛囊和直毛表型羊毛毛囊進(jìn)行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)SOX18在DPCs中特異性表達(dá)，因此我們猜測SOX18可能在DPCs中發(fā)揮重要作用^[11]。

本研究旨在了解SOX18在湖羊毛DPCs中的作用，本研究的結(jié)果為解析綿羊羊毛生長的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究中用于細(xì)胞分離的皮膚組織采集于蘇州湖羊種羊場養(yǎng)殖的3日齡湖羊母羊。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

湖羊DPCs的分離：首先使用眼科剪刀切割皮膚組織，然后將其分割為小塊皮膚組織并從中分離出處于生長期的單個(gè)毛囊。接下來，用鑷子獲取毛囊的膨大末端，然后使用鑷子破壞該組織完整性以使其內(nèi)部細(xì)胞能夠遷移出來。最后，將經(jīng)鑷子破壞后的膨大末端接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直到DPCs生長。湖羊DPCs的培養(yǎng)：用DMEM-F12（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國）培養(yǎng)基培養(yǎng)湖羊DPCs，DMEM-F12培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（Gibco，長島，紐約州，美國）和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素（Solarbio，北京，中國）。所有湖羊DPCs在37 ℃、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）中培養(yǎng)。

1.3 RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR

用Trizol（TaKaRa，大連，中國）從DPCs中提取總RNA，并在-80 ℃下儲(chǔ)存。本研究使用分光光度計(jì)（Thermo，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）檢測RNA的質(zhì)量和濃度。然后，使用一步逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Tiagen，北京，中國）進(jìn)行基因的cDNA合成，使用2×TSINGKE^?Master-qPCR Mix（擎科，南京，中國）檢測組織和細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)水平，定量反應(yīng)體系和程序均按照2×TSINGKE^?Master-qPCR Mix（擎科，南京，中國）試劑盒說明書。以綿羊GAPDH為參考基因，對每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測。使用2^-ΔΔCT方法計(jì)算相對表達(dá)量^[12]。

1.4 qRT-PCR引物

本研究使用Premier Primer5.0軟件（Premier Biosoft International，帕羅奧圖，加利福尼亞州，美國）設(shè)計(jì)相關(guān)基因的引物。所有引物均由南京擎科生物公司合成。引物序列如表1所示。

1.5 SOX18過表達(dá)載體的構(gòu)建

為了構(gòu)建SOX18的過表達(dá)載體，首先使用PrimeSTAR^?Max DNA聚合酶（TaKaRa，大連，中國）擴(kuò)增SOX18基因的編碼序列（CDS），并分離和純化PCR產(chǎn)物。然后，將擴(kuò)增的片段克隆到pcDNA3.1+載體中。限制性酶切位點(diǎn)內(nèi)切酶為HindⅢ和BamH I（TaKaRa，大連，中國）。最后，將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序以確保SOX18基因的CDS片段被成功插入。引物如表2所示。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在本研究中，jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑（polyplus，斯特拉斯堡，法國）用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序均按照制造商的方案進(jìn)行。

1.7 免疫熒光染色

使用24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)DPCs，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的密度約為30%。在細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)密度后用1×PBS（Solarbio，北京，中國）洗滌細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛（Solarbio，北京，中國）固定細(xì)胞，并用0.5%Triton X-100（Solarbio，北京，中國）對細(xì)胞進(jìn)行通透。接下來，用5%BSA（Solarbio，北京，中國）在37 ℃條件下對細(xì)胞進(jìn)行封閉。最后，將封閉細(xì)胞中加入一抗并在4 ℃條件下避光孵育過夜。第二天，用1×PBST（Solarbio，北京，中國）洗滌細(xì)胞，并使用二抗在37 ℃條件下孵育1 h，最后用DAPI（Beyotime，上海，中國）對細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色完成后使用倒置熒光顯微鏡（Nikon，東京，日本）觀察并拍攝染色的細(xì)胞。一抗及其稀釋比例如下：兔抗ACTA1抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗CRABP1抗體（Santa Cruz Biotech，圣克魯斯，玻利維亞，1∶400），兔抗CRABP2抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗IGFBP3抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗PDGFRA抗體（生工，上海，中國，1∶400），兔抗VCAN抗體（Santa Cruz Biotech，圣克魯斯，玻利維亞，1∶400），兔抗SOX18抗體（Bioss，北京，中國，1∶400）。二抗及其稀釋比例為：山羊抗兔IgG Hamp;L（Alexa Fluor^?594）（Abcam，劍橋，英國，1∶400）。

1.8 Western blot檢測

使用6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)DPCs以收集蛋白質(zhì)樣品，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的密度約為50%。轉(zhuǎn)染48h后，用胰蛋白酶消化和收集細(xì)胞（Solarbio，北京，中國）。收集完畢后，用RIPA細(xì)胞裂解物（Beyotime，上海，中國）和蛋白酶抑制劑（Beyotime，上海，中國）裂解細(xì)胞以收集蛋白并用BCA蛋白定量試劑盒（Vazyme，南京，中國）測定濃度。蛋白樣品變性后，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得目的蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF（BIO-RAD，赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國）中。然后，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜并使用一抗將PVDF膜置于4 ℃條件下孵育過夜。第二天，用1×TBST（Solarbio，北京，中國）洗滌PVDF膜，然后用二抗在室溫條件下孵育PVDF膜。最后，使用1×TBST洗滌PVDF膜，并將化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）（Beyotime，上海，中國）用于蛋白印跡顯色。

1.9 基因文庫構(gòu)建和測序

使用Trizol試劑盒（Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）提取總RNA。RNA質(zhì)量通過Agilent2100生物分析儀（Agilent Technologies，帕羅奧圖，加利福尼亞州，美國）檢測，并使用不含RNase的瓊脂糖凝膠電泳檢測。cDNA文庫由NEB Next Ultra RNA文庫制備試劑盒（NEB#7530，New England Biolabs，伊普斯威奇，馬薩諸塞州，美國）生成。使用Gene Denovo Biote的Illumina Novaseq6000對所得cDNA文庫進(jìn)行測序。

1.10 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將測序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控以獲得高質(zhì)量的Clean reads，然后將其與綿羊參考基因組比對，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理以獲得FPKM值，綿羊參考基因組為GCF_016 772 045.1。

1.11 樣本相關(guān)性分析

通過R軟件計(jì)算兩個(gè)樣本之間的相關(guān)系數(shù)以評估樣本之間的重復(fù)性，相關(guān)系數(shù)越接近1，兩個(gè)平行試驗(yàn)之間的重復(fù)性越好。兩個(gè)平行試驗(yàn)的相關(guān)性提供了對試驗(yàn)結(jié)果可靠性和操作穩(wěn)定性的評估。

1.12 差異表達(dá)基因篩選

通過DESeq2軟件分析SOX18過表達(dá)組（SOX18-OE）和對照組（SOX18-K）間的差異表達(dá)基因。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05且差異倍數(shù)（Fold Change）≥2的基因/轉(zhuǎn)錄物被認(rèn)為是差異表達(dá)基因/轉(zhuǎn)錄本。

1.13 GO和KEGG通路富集分析

注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID）用于SOX18-OE與SOX18-K（157個(gè)基因）組間差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.14 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS25.0軟件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利諾伊州，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。只有當(dāng)P＜0.05（*）或P＜0.01（**）時(shí)，數(shù)據(jù)才被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，每個(gè)試驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)測定，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±SEM（平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）”表示。

2 結(jié) 果

2.1 湖羊毛乳頭細(xì)胞相關(guān)基因的鑒定

在本研究中，首先選用免疫熒光染色對湖羊DPCs中相關(guān)基因進(jìn)行檢測以鑒定所分離的細(xì)胞是否為DPCs，檢測結(jié)果顯示真皮乳頭細(xì)胞標(biāo)記基因α-SMA（ACTA1）在所分離的細(xì)胞中表達(dá)（圖1）。根據(jù)前期單細(xì)胞測序結(jié)果，本研究也篩選了5個(gè)在湖羊DPCs中高表達(dá)基因CRABP1、CRABP2、IGFBP3、PDGFRA和VCAN進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示這些基因也都在所分離的細(xì)胞中表達(dá)（圖1）。這些結(jié)果表明所分離的細(xì)胞為DPCs，能夠用于下一步試驗(yàn)。

2.2 毛乳頭細(xì)胞中SOX18基因的鑒定及過表達(dá)載體構(gòu)建

前期單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)SOX18在湖羊DPCs中特異性表達(dá)，本研究中免疫熒光染色也表明SOX18在湖羊DPCs中表達(dá)（圖2A）。因此，我們推測SOX18在湖羊DPCs中發(fā)揮作用。為了研究SOX18在湖羊DPCs中的功能，本研究構(gòu)建了SOX18的過表達(dá)載體以用于后續(xù)試驗(yàn)（圖2B）。首先，將帶有GFP標(biāo)簽的pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染進(jìn)湖羊DPCs，結(jié)果顯示該載體在湖羊DPCs中的轉(zhuǎn)染效率較高（圖2C）。然后，將構(gòu)建成功的pcDNA3.1-SOX18轉(zhuǎn)染進(jìn)湖羊DPCs中，qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示pcDNA3.1-SOX18能夠上調(diào)SOX18的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平（圖2D，E）。這些結(jié)果表明，pcDNA3.1-SOX18載體可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

為了進(jìn)一步了解湖羊DPCs中SOX18基因的功能，本研究在湖羊DPCs中過表達(dá)SOX18后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后，相關(guān)性分析結(jié)果顯示同一組中的重復(fù)樣本高度相似（圖3A）。為了直觀地獲取每個(gè)樣本中的基因豐度，使用小提琴圖來顯示數(shù)據(jù)分布和基因表達(dá)的分散程度（圖3B）。結(jié)果顯示，同一組中的中位數(shù)、四分位間距和基因表達(dá)分布相似，這表明同一組平行樣本的可重復(fù)性很高。樣本相關(guān)性和小提琴圖的結(jié)果均表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可供進(jìn)一步分析。

2.4 差異表達(dá)基因篩選

本研究一共在兩組（SOX18-OE與SOX18-K）間共鑒定出157個(gè)差異表達(dá)基因，其中103個(gè)上調(diào)基因，54個(gè)下調(diào)基因（圖4A），火山圖（圖4B）顯示了基因表達(dá)水平的差異。此外，所有差異表達(dá)基因的分級(jí)聚類結(jié)果顯示來自同一組的兩個(gè)樣本被聚類在同一聚類中，這進(jìn)一步表明測序數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的（圖4C）。

2.5 GO功能注釋和KEGG pathway通路富集分析

為了進(jìn)一步了解差異基因的功能及其可能參與的途徑，本研究對所有差異基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析?；虮倔w論功能注釋結(jié)果顯示，157個(gè)差異表達(dá)基因中有137個(gè)被注釋，20個(gè)未被注釋。根據(jù)功能注釋的結(jié)果，137個(gè)差異表達(dá)基因分別富集于生物過程（BP）（圖5A）、細(xì)胞成分（CC）（圖5B）、分子功能（MF）（圖5C）。本研究主要關(guān)注生物過程（BP）所富集的基因，其中一些與細(xì)胞進(jìn)展有關(guān)，如細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)（GO：0042127）、細(xì)胞過程的負(fù)調(diào)節(jié)（GO：0048523）和細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)（GO：0008284）。此外，一些差異表達(dá)基因被注釋到毛囊發(fā)育相關(guān)生物過程中，如毛發(fā)周期（GO：0042633）、毛發(fā)周期過程（GO：0022405）和毛囊發(fā)育（GO：00001942）。KEGG pathway通路分析的結(jié)果如圖5D所示，差異表達(dá)基因主要富集在IL-17信號(hào)通路（ko04657）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（ko04060）和TNF信號(hào)通路（ko04668）中。

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究隨機(jī)選擇了9個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行差異表達(dá)驗(yàn)證，qRT-PCR結(jié)果顯示9個(gè)基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（圖6），進(jìn)一步表明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3 討 論

DPCs是一種位于皮膚中的間充質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為能夠通過分化為不同的細(xì)胞類型來調(diào)節(jié)毛囊的生長發(fā)育^[13]。在毛囊生長過程中，細(xì)胞板和成纖維細(xì)胞凝結(jié)物之間的信號(hào)傳導(dǎo)引起上皮細(xì)胞增殖和新毛囊向下生長，然后上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞聚集在一起形成成熟的毛乳頭，毛乳頭再引導(dǎo)上皮細(xì)胞生長形成毛干和內(nèi)根鞘^[14-15]。因此，DPCs在毛囊生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

之前的一項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組測序表明SOX18可能與江南絨山羊毛囊發(fā)育有關(guān)^[16]。雷志惠等^[17]利用全基因組選擇信號(hào)研究發(fā)現(xiàn)SOX18與綿羊毛囊發(fā)育相關(guān)聯(lián)。本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步了解SOX18在湖羊DPCs和毛囊中的功能?；谵D(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，本研究在SOX18-OE組與SOX18-K組中篩選獲得157個(gè)差異表達(dá)基因（103個(gè)上調(diào)，54個(gè)下調(diào)），通過對這些差異基因的分析，初步了解了SOX18在湖羊DPCs增殖和毛囊發(fā)育中的潛在功能。

根據(jù)GO分析結(jié)果，一些與細(xì)胞進(jìn)展相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)可能作為SOX18的下游基因發(fā)揮重要作用，包括ANKRD1、SOX9、CXCL6等。ANKRD1是內(nèi)皮細(xì)胞中一種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的核蛋白，在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用^[18]。轉(zhuǎn)錄因子SOX9也被報(bào)道參與了細(xì)胞增殖和命運(yùn)調(diào)節(jié)等過程^[19，20]。CXCL6是CXC趨化因子家族的一員，可介導(dǎo)炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移^[21]。這些基因的功能表明，SOX18可能通過調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)水平來影響湖羊DPCs的生長。DPCs能夠通過儲(chǔ)存多能干細(xì)胞、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子來調(diào)節(jié)毛囊的生長^[13]。因此，我們本研究還注意到一些基因與毛囊發(fā)育有關(guān)。3個(gè)差異表達(dá)基因，SOX18、SOX9和PTGS2被注釋為與毛發(fā)周期、毛發(fā)周期過程和毛囊發(fā)育有關(guān)，這一結(jié)果表明SOX18在毛囊生長過程中可能發(fā)揮著重要作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，部分差異表達(dá)基因顯著富集于IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路，這些信號(hào)通路已經(jīng)被報(bào)道與細(xì)胞增殖有關(guān)^[22，23]。因此，我們推測SOX18可能通過IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路影響湖羊DPCs的增殖。在毛囊生長過程中，許多信號(hào)通路發(fā)揮著不可或缺的作用，如Wnt/β-Catenin、BMP、TGF-β和MAPK信號(hào)通路。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生和周期性生長^[24，25]。此外，一些WNT相關(guān)基因在毛發(fā)生長中的作用也已被研究，如Wnt2基因被報(bào)道在調(diào)控毛囊發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用^[26]。在本研究中，WNT2基因被發(fā)現(xiàn)在不同處理組中差異表達(dá)，并被富集到Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，這表明SOX18可能通過Wnt/β-Catenin信號(hào)通路影響湖羊DPCs增殖和毛囊生長。

4 結(jié) 論

在本研究中，SOX18被發(fā)現(xiàn)可能通過影響一些細(xì)胞增殖相關(guān)基因和信號(hào)通路來影響湖羊DPCs的增殖和毛囊生長發(fā)育。我們的本研究報(bào)道了SOX18在湖羊DPCs和毛囊中的潛在作用，拓寬了對SOX18基因在綿羊毛囊生長發(fā)育中作用的認(rèn)知，為解析SOX18基因在湖羊DPCs和毛囊中的分子調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

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（編輯 郭云雁）