日本腦炎病毒免疫逃逸分子機(jī)制研究進(jìn)展

摘 要：日本腦炎（Japanese encephalitis，JE）是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種蚊媒性人獸共患傳染病，雖然已有商品化疫苗，但疫苗的預(yù)防具有一定的局限性且至今尚無(wú)有效藥物治療，一旦暴發(fā)將威脅人們的生命健康和公共安全，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。JEV含有數(shù)量眾多具有免疫逃逸功能的編碼蛋白，這些蛋白逃逸宿主免疫功能的機(jī)制多樣且復(fù)雜，但其機(jī)制仍不完全清楚。同時(shí)，JEV復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制可能是阻礙疫苗免疫保護(hù)效果的關(guān)鍵因素。因此，本文主要對(duì)JEV通過(guò)抑制干擾素反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬及宿主miRNA等多種途徑逃逸機(jī)體先天免疫和適應(yīng)性免疫機(jī)制進(jìn)行概述，以期為JEV致病機(jī)理的研究和疫苗研發(fā)提供思路與理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：日本腦炎病毒；免疫逃逸；天然免疫；適應(yīng)性免疫

中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）06-2368-11

收稿日期：2023-09-11

基金項(xiàng)目：貴州大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才[2018]5781-8）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31860716）

作者簡(jiǎn)介：何 松（1999-），男，貴州銅仁人，碩士生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究，E-mail：1740068560@qq.com

*通信作者：湯德元，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合研究及教學(xué)工作，E-mail：tdyuan@163.com

Advances inResearch Progress on the Molecular Mechanisms of Immune Escape of Japanese

Encephalitis Virus

HESong，TANGDeyuan^*，ZENGZhiyong，WANGBin，HUANGTao，MAOYinming，

ZHOUPiao，LIAOZhengbo，CHENXu，YUANShenglin，HUWenwen，ZHOUMin

（College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou550025，China）

Abstract：Japanese encephalitis（JE）is amosquito-borne animal disease caused by Japanese encephalitis virus（JEV），although there are commercially vaccines are availabe，however，the prevention of vaccines has certain limitations and there is no effective drug treatment so far，and once the outbreak will threatenoccurs，people′s life and health andas well as the public safety will be threatened，thus resulting in significant economic losses.JEV contains alarge number of encoded proteins with immune escape function.The mechanism of these proteins escaping host immune function is diverse and complex，and the mechanism is still not fully understoodof which still remains unclear.At the same time，the complex immune escape mechanism of JEV may be the key factor hindering the immune protection effect of vaccine.Therefore，this paper mainly summarizes the mechanism of JEV escaping innate and adaptive immunity by inhibiting interferon response，regulating apoptosis，pyroptosisdeath，autophagy and host miRNA to provide ideas and theoretical basis for the research of JEV pathogenesis and vaccine development.

Key words：Japanese encephalitis virus; immune escape; innate immunity; adaptive immunity

*Corresponding author：TANG Deyuan，E-mail：tdyuan@163.com

日本腦炎（Japanese encephalitis，JE）又稱乙腦，其病原為JE病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）。JE最先發(fā)現(xiàn)于日本，1934年日本學(xué)者從人和馬的腦組織中分離到了JEV，首次確定了該病的病原，我國(guó)于1939年分離到JEV^[1]。庫(kù)蚊是JEV主要的傳播媒介，豬是其主要的儲(chǔ)存宿主、擴(kuò)增宿主和傳染源，通?？尚纬伞柏i-蚊-人”的循環(huán)傳播模式。JE屬于自然疫源性疾病，人和多種動(dòng)物均可感染，其中人感染后會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒并發(fā)展為腦炎，對(duì)人的致死率高達(dá)30%，即使幸存，也有近50%的幾率出現(xiàn)神經(jīng)性后遺癥；豬群感染后可引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，公豬睪丸炎等繁殖障礙，其他動(dòng)物多為隱性感染^[2-3]。

JEV僅有一個(gè)血清型，根據(jù)E基因序列的同源性差異，可將JEV分為5個(gè)基因型（GⅠ～GⅤ），5種基因型在地理位置分布、毒力和宿主適應(yīng)性上具有一定的差異^[4]。JEV生物學(xué)特性復(fù)雜，編碼多種蛋白，目前已證實(shí)與逃逸相關(guān)的病毒蛋白有prM、E、NS1、NS1′、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5等，參與抑制Ⅰ型干擾素（IFN）反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬及宿主miRNA等信號(hào)通路并影響獲得性細(xì)胞免疫。本文總結(jié)了JEV逃逸天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)機(jī)制的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，以期為JEV的致病機(jī)理與疫苗研發(fā)提供思路。

1 JEV的結(jié)構(gòu)特征及其感染與復(fù)制

1.1 JEV的結(jié)構(gòu)特征

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種線性單鏈RNA病毒，基因組大小約為11kb，具有二十面體核衣殼，直徑大小40～60nm之間，外層被直徑約30nm的脂質(zhì)雙層包裹^[5]。由于脂質(zhì)雙層的存在，JEV很容易被有機(jī)溶劑滅活。JEV基因組在5′端具有甲基化帽結(jié)構(gòu)，但缺乏3′末端聚腺苷酸尾，并以保守的CU區(qū)域終止，在兩個(gè)短但高度結(jié)構(gòu)化的5′和3′非編碼區(qū)之間編碼一個(gè)超過(guò)1000個(gè)堿基的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（ORF），形成長(zhǎng)程分子內(nèi)RNA-RNA相互作用，以調(diào)節(jié)JEV翻譯和RNA復(fù)制^[6]。JEV基因組被釋放到細(xì)胞質(zhì)后，被翻譯成單一的多蛋白前體，多蛋白在宿主和病毒蛋白酶轉(zhuǎn)錄后被共翻譯和翻譯后加工成10種不同的產(chǎn)物，即3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、前膜prM和包膜蛋白E）及7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）^[7-8]。其中，JEV的衣殼蛋白C以反向平行方式二聚化，多個(gè)衣殼蛋白C二聚化形成球形核衣殼，包裹JEV基因組；多蛋白被信號(hào)肽共翻譯切割后分裂為prM，并開(kāi)始在含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡的病毒基因組RNA處組裝，之后，囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出芽并到達(dá)高爾基體網(wǎng)絡(luò)，prM被弗林蛋白酶切割成M蛋白，并在從宿主細(xì)胞釋放之前形成成熟的病毒顆粒；包膜蛋白E負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合并與宿主質(zhì)膜融合，在JEV入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起到關(guān)鍵作用；其他7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）參與了JEV生命周期各個(gè)階段，包括核酸復(fù)制、病毒顆粒組裝、免疫逃逸及病毒入侵等^[9]。此外，在感染JEV和其他JE血清群成員期間，由于NS2A密碼子8-9處發(fā)生-1核糖體移碼，額外添加52個(gè)氨基酸，還會(huì)產(chǎn)生NS1衍生物NS1′。

1.2 JEV的感染及復(fù)制

JEV對(duì)宿主細(xì)胞的感染是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括病毒的入侵、復(fù)制、組裝和釋放，涉及多種宿主因子與病毒間的相互作用。首先，病毒顆粒在細(xì)胞表面附著受體糖氨基聚糖（GAGs）^[10]、硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）^[11]、樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3（ICAM-3）^[12]等作用下在細(xì)胞周圍聚集并與靶細(xì)胞結(jié)合。隨后，病毒顆粒與熱休克蛋白（HSP）70^[13]、αvβ3^[14]、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）等進(jìn)入受體相互作用，從而觸發(fā)受體介導(dǎo)的依賴性網(wǎng)格蛋白或非依賴性網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用。內(nèi)化后，病毒顆粒穿過(guò)內(nèi)體成熟途徑，在酸性條件下誘導(dǎo)病毒E蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，從而實(shí)現(xiàn)病毒和內(nèi)體膜之間的融合。當(dāng)病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中后，生成RNA復(fù)制和病毒粒子組裝所必需的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白?；蚪MRNA在結(jié)構(gòu)重排的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）衍生膜囊泡內(nèi)的復(fù)制復(fù)合體中進(jìn)行復(fù)制，病毒RNA復(fù)制由NS3和NS5催化，這兩種最大且最保守的非結(jié)構(gòu)蛋白在負(fù)鏈和正鏈RNA合成、RNA加帽和帽甲基化方面協(xié)調(diào)其多種酶活性。在RNA復(fù)制期間或復(fù)制后不久，新合成的基因組RNA和C蛋白的復(fù)合物被ER膜上的兩種病毒糖蛋白（prM和E）包裹，產(chǎn)生未成熟的病毒粒子。隨后，病毒RNA與3種結(jié)構(gòu)蛋白相互作用促進(jìn)未成熟顆粒出芽進(jìn)入ER腔并被轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)，其中prM被切割成含有M和E同二聚體的成熟病毒粒子。最后，部分和完全成熟的病毒粒子通過(guò)胞吐作用被釋放到細(xì)胞外^[15-16]。

JEV感染宿主后，首先在皮膚的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）中復(fù)制，通過(guò)細(xì)胞歸巢進(jìn)入局部淋巴結(jié)，并隨血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)傳播至多個(gè)身體器官（如心、肝、脾和肌肉），在此過(guò)程中由受感染的遷移性免疫細(xì)胞（如朗格漢斯細(xì)胞）承擔(dān)轉(zhuǎn)運(yùn)作用，引起繼發(fā)性病毒血癥。隨后，JEV穿過(guò)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）。JEV侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會(huì)事先破壞其感染神經(jīng)元的血腦屏障通透性，而是誘導(dǎo)受感染的神經(jīng)元產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子（包括CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4和CCL5），這些趨化因子可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而產(chǎn)生大量的炎癥趨化因子和細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IFN-γ）。一方面，這些炎癥介質(zhì)可以通過(guò)減少緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)破壞血腦屏障（BBB），從而破壞微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接的完整性；另一方面，炎癥介質(zhì)可以通過(guò)誘導(dǎo)BBB內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的表達(dá)增加，進(jìn)一步損害BBB屏障，從而增加炎癥細(xì)胞從外周到CNS的浸潤(rùn)，加劇神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷^[17-19]，營(yíng)造有利于自身復(fù)制的環(huán)境。此外，JEV也能感染神經(jīng)干細(xì)胞，導(dǎo)致室管膜下區(qū)的功能損傷，但JEV感染神經(jīng)干細(xì)胞能夠明顯降低細(xì)胞的增殖能力，影響損傷神經(jīng)元的修復(fù)再生，這可能是JE幸存者伴隨有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的原因^[20]。

2 JEV免疫逃逸機(jī)制

2.1 JEV調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡，也稱為程序性細(xì)胞死亡（PCD），是多細(xì)胞生物用來(lái)消除衰老、受損或感染細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，其途徑包括：死亡受體介導(dǎo)凋亡、細(xì)胞線粒體介導(dǎo)凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)凋亡。許多研究表明，細(xì)胞凋亡在病毒感染的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞凋亡作為一種關(guān)鍵的先天防御機(jī)制，在抑制病毒復(fù)制并清除病毒感染的細(xì)胞和維持機(jī)體正常的免疫功能中具有重要意義。然而，許多病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來(lái)防止或延遲復(fù)制過(guò)程中細(xì)胞過(guò)早地發(fā)生凋亡，以促進(jìn)子代病毒的產(chǎn)生和傳播。在感染后期，病毒則主動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制炎癥信號(hào)的產(chǎn)生，進(jìn)而阻止免疫反應(yīng)對(duì)子代病毒的清除。

C/EBP同源蛋白（CHOP）屬于轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）家族，對(duì)細(xì)胞增殖、分化和表達(dá)相關(guān)過(guò)程的調(diào)節(jié)具有重要作用。正常情況下，CHOP在細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，但當(dāng)應(yīng)對(duì)ERS時(shí)，CHOP會(huì)大量表達(dá)，CHOP的過(guò)度表達(dá)不僅會(huì)引發(fā)細(xì)胞周期停滯，還會(huì)導(dǎo)致多種細(xì)胞凋亡^[21]。Su等^[22]研究發(fā)現(xiàn)，JEV感染的BHK-21細(xì)胞中CHOP表達(dá)水平顯著上調(diào)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2或半胱氨酸蛋白酶（caspase）抑制劑z-VAD-fmk抑制CHOP表達(dá)，則減少了細(xì)胞凋亡，而在缺乏CHOP誘導(dǎo)的情況下，K562細(xì)胞在JEV感染后未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，表明JEV可通過(guò)調(diào)控CHOP的表達(dá)水平來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)自身擴(kuò)散。同時(shí)，對(duì)感染JEV的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，ER駐留伴侶GRP78、線粒體蛋白Prohibitin（PHB）和異質(zhì)核核糖核蛋白（hnRNPC）三種蛋白與JEV RNA相互作用，進(jìn)而引起ERS反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)失調(diào)，表明持續(xù)的ERS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡^[23]。

此外，JEV編碼的蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。研究表明，JEV可通過(guò)其編碼的NS4B蛋白與蛋白激酶樣ER激酶（PERK）相互作用，通過(guò)觸發(fā)PERK/eIF2-α/ATF4/CHOP凋亡途徑，在體外和體內(nèi)激活誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。進(jìn)一步分析顯示，NS4B蛋白的LIG-FHA和LIG-WD40結(jié)構(gòu)域均能誘導(dǎo)PERK二聚化，而JEV NS4B突變體的過(guò)度表達(dá)則不會(huì)引起細(xì)胞凋亡和腦炎，表明JEV NS4B蛋白通過(guò)不同基序與兩個(gè)PERK分子相互作用將其聚集進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和腦炎^[24]，提示了NS4B在JEV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和腦炎中起著重要作用，這為今后以NS4B作為抗JEV分子靶點(diǎn)提供了思路，為研發(fā)NS4B相關(guān)拮抗劑治療JEV引起的腦炎提供了一種新的方法。Guo等^[25]對(duì)受病毒感染的神經(jīng)元和小鼠腦組織的轉(zhuǎn)錄組綜合分析表明，叉頭框蛋白（Foxo）可以上調(diào)凋亡蛋白Bim、抗凋亡蛋白Bcl-6和p21等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞存活，而在JEV感染的情況下，JEV下調(diào)STAT3表達(dá)來(lái)降低Foxo表達(dá)，從而抑制Foxo-p21/Bcl-6信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，這為JEV誘發(fā)腦炎提供了新的見(jiàn)解。另外，低劑量的JEV（MOI=0.5）感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（THBMEC）會(huì)上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bid、Fas和FasL表達(dá)，激活caspase通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程，與促凋亡蛋白相同，另一項(xiàng)研究表明，在JEV感染的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，信號(hào)分子p53可能發(fā)生上調(diào)，從而直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程，但在高劑量JEV（MOI=10）感染的THBMEC中，p53顯著下調(diào)，這說(shuō)明高劑量JEV在感染細(xì)胞后未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡^[26-27]。上述結(jié)果表明，在低劑量JEV的情況下，促凋亡蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有助于阻止病毒復(fù)制并防止其產(chǎn)生感染性子代病毒。當(dāng)JEV劑量較高時(shí)，大多數(shù)促凋亡蛋白都會(huì)減少，這意味著病毒有能力抑制宿主細(xì)胞凋亡機(jī)制，從而完成病毒生命周期以建立持續(xù)感染。除上述研究之外，在JEV蛋白中，與人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)E、NS1、NS2B或NS3蛋白酶相比，JEV NS3蛋白酶與NS2B輔因子共表達(dá)不僅能顯著誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中的釋放，引發(fā)更高的caspase3/7活性，導(dǎo)致更高程度的神經(jīng)元凋亡，而且還刺激ASK1/ERK1/p38-MAPK通路和細(xì)胞中活性氧（ROS）的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡^[28-30]，這在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)一步闡釋了JEV通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)逃逸宿主的免疫機(jī)制。由于JEV引起的神經(jīng)元凋亡是該病毒的重要發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)主要機(jī)制，所以減少JEV感染引起的神經(jīng)元凋亡，開(kāi)發(fā)相關(guān)神經(jīng)保護(hù)劑并與抗病毒復(fù)制劑聯(lián)用以減輕JEV引起的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥或?qū)⒊蔀榻窈蟮难芯恐攸c(diǎn)。

2.2 JEV調(diào)節(jié)壞死性凋亡和細(xì)胞焦亡

壞死性凋亡和焦亡是相對(duì)較新的程序性細(xì)胞死亡形式。壞死性凋亡是由死亡受體、細(xì)胞內(nèi)外核酸檢測(cè)傳感器或一些其他刺激通過(guò)結(jié)合蛋白激酶1（RIPK1）、RIPK3和混合譜系激酶域樣蛋白（MLKL）的壞死體觸發(fā)的。RIPK3對(duì)MLKL的激活/磷酸化導(dǎo)致鈉離子和鈣離子的異常流動(dòng)以及隨后質(zhì)膜上孔的形成，提示了MLKL是壞死性凋亡的執(zhí)行者^[31-32]。細(xì)胞焦亡是由炎性半胱天冬酶誘導(dǎo)的，它們通過(guò)蛋白水解加工Gasdermin D蛋白來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞焦亡，產(chǎn)生一個(gè)穿透質(zhì)膜的N末端片段，導(dǎo)致細(xì)胞破裂^[33]，細(xì)胞破裂后導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子釋放，從而加劇壞死性凋亡和細(xì)胞焦亡。這兩個(gè)過(guò)程作為宿主防御機(jī)制可被宿主細(xì)胞用來(lái)抵抗病原體感染。

JEV感染期間，在神經(jīng)元和小鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)了MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡，抑制MLKL可減弱炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，緩解腦炎的進(jìn)程，但目前尚不清楚JEV感染期間MLKL誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡的確切機(jī)制^[34]。TNF-α是多種腦部疾病中通過(guò)TNF-α/TNFR1/RIPK1/RIPK3/MLKL通路導(dǎo)致壞死性凋亡的重要刺激因子。由于TNF-α也是JE的主要介質(zhì)之一，因此推測(cè)MLKL可能通過(guò)TNF-α介導(dǎo)的機(jī)制誘導(dǎo)壞死性凋亡^[35-36]。所以，未來(lái)針對(duì)靶向壞死性凋亡可能為開(kāi)發(fā)治療JEV引起的腦炎提供新的途徑。AXL（一種受體酪氨酸激酶）是一種跨膜蛋白，可以促進(jìn)多種黃病毒的復(fù)制，然而，AXL在JEV感染宿主過(guò)程中的作用尚未確定，Xie等^[37]研究發(fā)現(xiàn)，JEV NS2B-3蛋白能與AXL特異性相互作用，并通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)AXL降解使其在JEV感染后期下調(diào)，AXL降解后通過(guò)破壞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)增加細(xì)胞壞死性凋亡并促進(jìn)JEV釋放到上清液中，從而減少細(xì)胞裂解物中的病毒量。此外，在缺失AXL的小鼠模型中，AXL缺陷通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)JEV感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡，焦亡的巨噬細(xì)胞在血清中釋放大量IL-1α，進(jìn)而通過(guò)破壞BBB介導(dǎo)JEV神經(jīng)侵襲，并在小鼠中誘發(fā)JE^[38]。目前，人們對(duì)于JEV感染期間壞死性凋亡和細(xì)胞焦亡的作用知之甚少。因此，進(jìn)一步研究壞死性凋亡和細(xì)胞焦亡的機(jī)制及不同途徑之間的相互作用可為開(kāi)發(fā)相關(guān)拮抗劑防治JE提供新方法。

2.3 JEV調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬

自噬是一個(gè)進(jìn)化上相對(duì)保守的過(guò)程，其過(guò)程主要包括三個(gè)步驟，從囊泡的成核和延伸開(kāi)始形成吞噬泡，然后吞噬泡的邊緣融合以組裝自噬體。最后，自噬體通過(guò)與內(nèi)體（后稱為兩性體）或溶酶體膜融合而成熟為自溶酶體^[39]。在正常條件下，自噬維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并且在感知到營(yíng)養(yǎng)饑餓和病原體入侵等應(yīng)激條件時(shí)可以被快速誘導(dǎo)^[40]。除了維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)外，已知自噬在包括JEV在內(nèi)的多種病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其最廣泛使用的激活指標(biāo)是微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）在細(xì)胞質(zhì)中的聚集，該聚集通過(guò)與磷脂酰乙醇胺的綴合進(jìn)行修飾，并靶向標(biāo)記自噬液泡的自噬膜。研究表明，JEV感染宿主細(xì)胞后，能上調(diào)LC3蛋白的表達(dá)以及增加自噬體/自溶酶體，而自噬體和溶酶體之間的融合對(duì)于JEV復(fù)制至關(guān)重要，并且敲低自噬相關(guān)基因（如Rab7、LAMP2、ATG5和Beclin-1）可減少JEV RNA和蛋白質(zhì)水平，同時(shí)，上調(diào)I型IFN和細(xì)胞因子表達(dá)、促進(jìn)干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）磷酸化以抑制JEV復(fù)制^[41]，表明JEV可利用自噬作為免疫逃避機(jī)制。聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）是PARP家族的成員，在維持基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮著重要作用，能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子FoxO調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和自噬，研究表明，JEV感染神經(jīng)元后上調(diào)PARP1，PARP1通過(guò)增加FoxO活性負(fù)向調(diào)節(jié)Akt促進(jìn)細(xì)胞自噬和JEV發(fā)病機(jī)制^[42]，表明PARP1是JEV感染的潛在治療靶點(diǎn)。此外，在JEV感染神經(jīng)元期間，自噬與ERS途徑之間存在直接聯(lián)系，siRNA介導(dǎo)的對(duì)肌醇需求酶1（IRE1）和ATF6介導(dǎo)的ERS途徑（而非PERK/eIF2-α介導(dǎo)的途徑）的抑制，在JEV感染小鼠神經(jīng)元細(xì)胞期間抑制了自噬并加劇了細(xì)胞凋亡^[43]。

與上述發(fā)現(xiàn)相反，一些報(bào)告表明，自噬與JEV復(fù)制之間存在負(fù)反饋，表明自噬是針對(duì)JEV的宿主防御機(jī)制。在缺乏ATG7蛋白的小鼠神經(jīng)細(xì)胞中，觀察到感染性JEV顯著增加，并且這些細(xì)胞對(duì)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡高度敏感。進(jìn)一步分析顯示，JEV復(fù)制復(fù)合物（NS1蛋白和復(fù)制中間體dsRNA）與LC3-I和ER相關(guān)降解途徑標(biāo)記EDEM1（ER降解增強(qiáng)劑）共定位，這表明JEV復(fù)制發(fā)生在由LC3-I組成的EDEMosomes上^[44]。JEV感染小鼠神經(jīng)元和成纖維細(xì)胞后誘導(dǎo)的ATF3與ATG5、IRF9、STAT1和ISG15基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，從而抑制自噬和抗病毒反應(yīng)^[45]。此外，JEV在人神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)Nedd4（E3泛素連接酶）表達(dá)，但在非神經(jīng)元細(xì)胞中則通過(guò)抑制自噬來(lái)促進(jìn)JEV復(fù)制，表明Nedd4在JEV感染神經(jīng)元細(xì)胞中具有重要作用，這為開(kāi)發(fā)新的抗病毒拮抗劑來(lái)防治JE提供了潛在的靶標(biāo)^[46]。

綜上，在不同宿主或相同宿主的不同細(xì)胞中，細(xì)胞自噬對(duì)病毒的作用不盡相同。一方面，病毒侵入宿主后通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以逃逸宿主的免疫機(jī)制進(jìn)而促進(jìn)病毒自身的復(fù)制，建立持續(xù)的感染。另一方面，細(xì)胞自噬作為宿主免疫反應(yīng)的一個(gè)組成部分，宿主可以利用細(xì)胞自噬來(lái)恢復(fù)受損的細(xì)胞器并靶向和降解一些病毒蛋白從而起到抗病毒的作用。但JEV感染宿主后如何調(diào)控細(xì)胞自噬以逃避宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)、宿主又是怎樣利用細(xì)胞自噬防御病毒感染的確切機(jī)制仍不清楚，有待未來(lái)進(jìn)一步研究。

2.4 JEV調(diào)節(jié)宿主microRNA

MicroRNA（miRNA）是一種小型非編碼RNA，miRNA的表達(dá)和靶向結(jié)合病毒基因組能夠參與細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)。很多時(shí)候，宿主miRNA在病毒的生命周期中通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控途徑來(lái)促進(jìn)或抑制其對(duì)宿主的感染。miRNA也可以由病毒基因組編碼并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，病毒miRNA可以與宿主miRNA擁有共同的序列，或者具有完全不同的序列。因此，JEV調(diào)控宿主miRNA的表達(dá)和功能對(duì)JE的發(fā)生具有極其重要的作用^[47]。

研究表明，JEV感染小膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞期間上調(diào)miR-29b、miR-19b-3p、miR-15b和miR-301a表達(dá)，并通過(guò)靶向腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3）、RNF11、RNF125和NKRF的表達(dá)增強(qiáng)NF-κB活性，促進(jìn)TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的生成并引起腦炎^[48-50]。另外，JEV誘導(dǎo)的miR-155通過(guò)靶向小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的肌醇5′-磷酸酶SHIP1正向調(diào)節(jié)NF-κB活性，而在JEV感染人小膠質(zhì)細(xì)胞期間，相同的miRNA通過(guò)減弱IRF8和NF-κB通路介質(zhì)來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，這表明JEV在不同物種中利用不同機(jī)制調(diào)節(jié)宿主miRNA，具有物種特異性^[51-52]。同時(shí)，JEV JaOArS982株感染小膠質(zhì)細(xì)胞后誘導(dǎo)miR-146a靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK）1/2和STAT1以負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB和JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)以逃避宿主免疫反應(yīng)，而在相同細(xì)胞模型系統(tǒng)中，JEV P20778毒株具有相反的作用^[53]，表明不同JEV毒株在相同細(xì)胞中能誘導(dǎo)不同機(jī)制為自身復(fù)制創(chuàng)造有利環(huán)境。此外，除了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞外，JEV感染還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞中的miRNA的表達(dá)，如上調(diào)miR-301a抑制IRF1和SOCS5的表達(dá)量，阻斷I型IFN反應(yīng)并促進(jìn)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞中JEV的發(fā)病機(jī)制^[54]。

2.5 JEV抑制IFN反應(yīng)

IFN系統(tǒng)是宿主最重要的抗病毒防御機(jī)制之一。它分為兩個(gè)主要途徑：IFN激活和IFN信號(hào)傳導(dǎo)。IFN激活途徑涉及模式識(shí)別受體（PRRs）對(duì)病毒RNA的識(shí)別，識(shí)別病毒RNA的PRRs主要可分為兩大類。第一類包括膜結(jié)合Toll樣受體（TLRs）（如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9），它們主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，可以感知胞外病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或體內(nèi)的病毒核酸；第二類由不同的細(xì)胞內(nèi)PRRs家族組成，它們?cè)诖蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中表達(dá)，如視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）、黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）等，它們特異性感知細(xì)胞質(zhì)中非自身病毒RNA^[55-56]。研究表明，宿主針對(duì)JEV的先天免疫反應(yīng)主要是由細(xì)胞質(zhì)RLRs和MDA5對(duì)病毒RNA的識(shí)別觸發(fā)，在病毒RNA傳感后，RLRs會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，并通過(guò)與MAVS相互作用，導(dǎo)致IKKε和TANK結(jié)合激酶1（TBK-1）的激活，從而磷酸化NF-κB和IRF3。隨后，NF-κB和IRF3易位到細(xì)胞核中，驅(qū)動(dòng)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄。之后，IFN-β與I型IFN受體（IFNAR）結(jié)合并刺激JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致其他抗病毒基因（如干擾素刺激基因ISG）的表達(dá)，并最終表達(dá)IFN-α進(jìn)而誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)^[57-58]。由于真核細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來(lái)區(qū)分自身和非自身核酸，JEV與許多其他病毒一樣，已經(jīng)發(fā)展出不同的策略來(lái)逃避或延遲先天免疫識(shí)別。

NS5是JEV最大且最保守的NSP，其N端和C端結(jié)構(gòu)域分別編碼甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）。由于JEV NS5拮抗IFN是新發(fā)現(xiàn)的一種功能，因此鑒定其結(jié)構(gòu)域的功能具有重要意義，研究表明，刪除C端殘基763至905（包括部分RdRP結(jié)構(gòu)域）并不會(huì)損害NS5對(duì)IFN的拮抗活性，而N端殘基1至83或1至166的敲除則阻斷了NS5抑制IFN誘導(dǎo)的JAK/STAT途徑的能力，表明NS5可能需要完整的N末端來(lái)介導(dǎo)其拮抗IFN的活性。同時(shí)，與JEV GIII菌株相比，GI NS5-372處的Val替換為Ala或NS5-386處的His替換為T(mén)yr能增強(qiáng)GI菌株拮抗IFN-α和IFN-β介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)并產(chǎn)生高病毒滴度，從而提高其在鳥(niǎo)類中的復(fù)制效率，這部分研究一定程度解釋了在鳥(niǎo)類中GI毒株比GIII毒株的復(fù)制效率更高的原因^[59]。另外，NS5能與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KPNA2/3/4相互作用，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷KPNA3/4與IRF3和p65（NF-κB的亞基）的相互作用，從而抑制IRF3和NF-κB的核轉(zhuǎn)位^[60]，表明JEV NS5可通過(guò)靶向KPNA3和KPNA4抑制I型IFN的產(chǎn)生。HSP90是JAK活性和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)劑，抑制HSP90的表達(dá)會(huì)使JAK1和JAK2降解，從而減弱STAT1/2對(duì)IFN-β和IFN-γ的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在JEV感染期間，NS5與HSP90和HSP70相互作用，在增強(qiáng)病毒dsRNA和自身穩(wěn)定性的同時(shí)，導(dǎo)致JAK1、JAK3和Tyk2降解，抑制STAT1/3/5/6酪氨酸磷酸化，進(jìn)而抑制IFN的產(chǎn)生^[61-62]。JEV感染宿主后，要在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)合成大量的病毒蛋白，可能需要細(xì)胞伴侶來(lái)促進(jìn)其自身蛋白的折疊過(guò)程，而HSP70作為細(xì)胞伴侶網(wǎng)絡(luò)的核心組成部分，經(jīng)常被病毒用于蛋白質(zhì)折疊。因此，抑制HSP70表達(dá)可能會(huì)降低JEV的穩(wěn)定性，導(dǎo)致JEV蛋白酶體降解。

NS1′是一種較大的衍生蛋白，Li等^[63]研究發(fā)現(xiàn)NS1′可與宿主細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）相互作用，中斷CDC25C磷酸酶介導(dǎo)的CDK1去磷酸化，增強(qiáng)CDK1磷酸化，從而通過(guò)增加轉(zhuǎn)錄因子CREB和c-Rel與miR-22（MAVS表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合來(lái)抑制MAVS介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)^[63-64]，但JEV prM不能通過(guò)上述途徑抑制IFN-I的產(chǎn)生。另外，在JEV感染期間，NS1與鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白（GBP）相互作用，在存在IFN-γ的情況下，GBP1抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和STAT1的表達(dá)及磷酸化而發(fā)揮促病毒作用^[66]。NS4B是一種多功能疏水性蛋白，廣泛參與病毒復(fù)制、發(fā)病機(jī)制和宿主免疫逃逸，研究表明，TRIF（一種誘導(dǎo)IFN-β的包含TIR結(jié)構(gòu)域的接頭）蛋白通過(guò)與TRAF3結(jié)合激活TBK1和IKKε激酶相互作用，從而促進(jìn)IRF3磷酸化，但在NS4B存在的情況下，TLR3和TRIF誘導(dǎo)的IRF3磷酸化受到抑制，而TRAF3、TBK1和IKKε則正常表達(dá)^[67]，表明NS4B可通過(guò)靶向TLR3和TRIF抑制IRF3磷酸化和IFN-β的產(chǎn)生，這為深入了解JEV逃避宿主免疫機(jī)制、針對(duì)干預(yù)JEV非結(jié)構(gòu)蛋白和疫苗開(kāi)發(fā)提供了新思路。

3 JEV逃逸適應(yīng)性免疫應(yīng)答

DC是抗原呈遞細(xì)胞（APC），在啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及調(diào)節(jié)先天免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有多種免疫功能。DC與CD4⁺T淋巴細(xì)胞之間的的串?dāng)_對(duì)于建立有效的免疫反應(yīng)至關(guān)重要。研究表明，JEV在感染后誘導(dǎo)DC成熟標(biāo)記物和程序性細(xì)胞死亡1配體1（PD-L1，也稱為CD274）及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的表達(dá)增加，使用拮抗劑阻斷PD-L1后，Treg細(xì)胞擴(kuò)增顯著降低并減少了Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞表型的極化，表明JEV可以誘導(dǎo)DC的表型和功能成熟并通過(guò)PD-L1軸調(diào)節(jié)DC和T淋巴細(xì)胞之間的串?dāng)_來(lái)逃避宿主的免疫反應(yīng)^[68]。交叉呈遞是外源抗原被主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類分子呈遞并導(dǎo)致抗病毒CD8⁺T細(xì)胞反應(yīng)激活的途徑，然而在JEV感染小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，JEV感染后可以抑制可溶性抗原和細(xì)胞相關(guān)抗原的體內(nèi)交叉呈遞，從而產(chǎn)生對(duì)外源抗原的弱CD8⁺T細(xì)胞反應(yīng)，如降低體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）殺傷活性。此外，CD8α⁺CD11c⁺DC已知在交叉呈遞可溶性抗原方面效率更高，能干擾JEV介導(dǎo)的外源抗原交叉呈遞抑制，而JEV則可通過(guò)TLR2/MyD88信號(hào)通路依賴性方式損害CD8α⁺CD11c⁺DC的交叉呈遞而逃逸宿主適應(yīng)性免疫^[69-70]。此外，記憶T細(xì)胞反應(yīng)在預(yù)防人類JE方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。無(wú)癥狀個(gè)體對(duì)JEV的IFN-γ應(yīng)答大多為CD8⁺，而JE康復(fù)者的IFN-γ應(yīng)答大多為CD4⁺，表明CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞應(yīng)答與JEV的不同臨床結(jié)果相關(guān)^[71]。在病毒感染期間，CD4⁺效應(yīng)T細(xì)胞被認(rèn)為在病毒感染期間對(duì)于激活B細(xì)胞并最終產(chǎn)生體液反應(yīng)至關(guān)重要。JEV感染期間，運(yùn)用IgM抗體反應(yīng)在患者的血清和腦脊液中檢測(cè)到IgM，并且IgM水平在感染后7d內(nèi)達(dá)到最高水平。然而，最近的一項(xiàng)研究報(bào)告稱，感染JEV的小鼠其骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）數(shù)量會(huì)增加，從而抑制CD4⁺T細(xì)胞免疫反應(yīng)，并降低CD19⁺、CD138⁺、總IgM和JEV特異性中和抗體水平，表明JEV可通過(guò)誘導(dǎo)MDSC途徑抑制CD4⁺T細(xì)胞反應(yīng)，破壞宿主體液免疫，從而逃逸適應(yīng)性免疫應(yīng)答促進(jìn)感染^[72]。

4 小結(jié)與展望

JEV侵入宿主細(xì)胞后迅速脫去衣殼并將含有遺傳物質(zhì)的病毒核心釋放至胞質(zhì)，這一過(guò)程中，PAMPs激活各類PRRs引起IFN反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬和miRNA等天然免疫信號(hào)通路激活，分泌細(xì)胞因子形成免疫應(yīng)答，然而JEV可通過(guò)眾多編碼蛋白調(diào)控宿主細(xì)胞的天然免疫信號(hào)通路，抑制抗病毒反應(yīng)以促進(jìn)自身的復(fù)制（表1）。此外，JEV還通過(guò)抑制抗原加工和遞呈、調(diào)控趨化因子表達(dá)等方式對(duì)宿主免疫系統(tǒng)造成損傷，進(jìn)一步影響宿主的淋巴細(xì)胞分化成熟，導(dǎo)致了宿主難以誘導(dǎo)有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

由于目前尚無(wú)治療JE的有效辦法，接種疫苗仍是控制JE的主要方式，而理想的疫苗應(yīng)該是在施用后迅速激活B細(xì)胞，從而產(chǎn)生足夠水平的保護(hù)或中和抗體，如T細(xì)胞的激活，當(dāng)前JE-CV、IXIARO、SA14-14-2減毒活疫苗、Vero細(xì)胞源性滅活疫苗和MB-JEV被認(rèn)為對(duì)JE的防控有效，但這些疫苗存在一定副作用，接種后會(huì)在局部引起紅斑、腫脹和疼痛，導(dǎo)致輕度發(fā)燒、咳嗽和腹瀉等全身不良反應(yīng)^[73]。同時(shí)，國(guó)際上JE的防控以接種GIII株疫苗為主，但已有研究顯示GIII株疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對(duì)GI株的中和能力偏低，并不能完全保護(hù)人類以及動(dòng)物免受GI株JEVG2株的感染，并且已報(bào)道在免疫GIII株疫苗的人體內(nèi)分離到了GI株JEVG2株^[74]，JEV優(yōu)勢(shì)病毒株的轉(zhuǎn)型增加了JE的防控難度并對(duì)新型JE疫苗提出了更高需求。因此，深入研究JEV編碼的蛋白及其功能在病毒免疫逃逸中的作用，全面了解細(xì)胞受體和宿主蛋白與病毒蛋白相互作用關(guān)系必將有助于闡釋JEV的致病機(jī)理，并對(duì)開(kāi)發(fā)更加安全、有效的疫苗和JE防控提供指導(dǎo)作用。除此之外，敲除毒力JEV相關(guān)毒力基因或免疫逃逸等相關(guān)基因，構(gòu)建相關(guān)基因缺失疫苗也是未來(lái)的熱點(diǎn)研究方向。

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（編輯 范子娟）