豬肺炎支原體乳酸脫氫酶在誘導(dǎo)豬支氣管上皮細胞凋亡中的作用

摘 要： 豬肺炎支原體感染會引起宿主上皮細胞的損傷及凋亡。上皮屏障的破壞往往導(dǎo)致細菌和病毒的繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，但具體的致病機制及毒力因子尚未完全闡明。前期研究發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）不僅參與豬肺炎支原體的代謝還與豬肺炎支原體的毒力相關(guān)。因此，本研究通過原核表達及親和層析獲得豬肺炎支原體乳酸脫氫酶重組蛋白（recombinant LDH， rLDH），之后分別用不同濃度的rLDH與豬支氣管上皮細胞（porcine bronchial epithelial cell， PBEC）孵育，經(jīng)顯微鏡觀察rLDH對細胞形態(tài)的影響，通過CCK-8法檢測rLDH對細胞活力的影響。選取對細胞形態(tài)及活力影響不顯著的50和 100 μg·mL-1 rLDH分別與PBEC孵育，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率，反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法和免疫印記檢測凋亡相關(guān)基因 caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。結(jié)果顯示：豬肺炎支原體rLDH呈劑量依賴性地誘導(dǎo)PBEC凋亡，其作用與豬肺炎支原體菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后，PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9 的mRNA水平顯著上調(diào)，凋亡抑制因子BCL-2 的mRNA水平顯著下調(diào)，caspase 8的mRNA水平未發(fā)生顯著變化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表達水平顯著上調(diào)，凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表達水平顯著下調(diào)。結(jié)果表明，豬肺炎支原體可能通過LDH誘導(dǎo)PBEC內(nèi)源性細胞凋亡，凋亡相關(guān)因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 豬肺炎支原體（Mhp）；乳酸脫氫酶（LDH）；豬支氣管上皮細胞（PBEC）；凋亡

中圖分類號： S858.285.3

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2195-11

收稿日期：2023-08-10

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2022YFD1800903）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目（22B1055）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2022JJ50321）；國家自然科學(xué)基金項目（32172860；32273011）；江蘇省科協(xié)青年科技人才托舉工程（JSTJ-2023-XH031）

作者簡介：王吉英（1988-），女，湖南邵陽人，博士生，主要從事動物病原致病機制研究，E-mail：wjyhhzy@163.com

*通信作者：于巖飛，主要從事動物呼吸道病原尤其是支原體的致病機制、免疫逃逸機制及防控技術(shù)研究，E-mail：yuyanfeihaha@163.com

Effects of LDH in Mesomycoplasma （Mycoplasma） hyopneumoniae on Apoptosis of Porcine

Bronchial Epithelial Cells

WANG" Jiying1，2，3，4， YIN" Ruiru2，3，5， XIE" Xing2，3，5， WANG" Haiyan3，6， LIU" Hudong7， HU" Hui4， XIONG" Qiyan2，3，5， FENG" Zhixin2，3，5， SHAO" Guoqing2，3，5， YU" Yanfei2，3，5*

（1.College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University， Changsha 410125，" China;

2.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，

China;

3.Guotai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou

225327，" China;

4.Department of Animal Science and Technology，

Huaihua Polytechnic College， Huaihua 418099，" China;

5.College of Veterinary Medicine，

Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，

China;

6.Institute of Veterinary

Immunology and Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，

Nanjing 210014，" China;

7.School of Medical Humanity and Information Management， Hunan University

of Medicine， Huaihua 418000，" China）

Abstract：" Mesomycoplasma （Mycoplasma） hyopneumoniae （Mhp） infection can cause damage and apoptosis of host epithelial cells， and the breakdown of the epithelial barrier often leads to the secondary infection of other bacteria and viruses， causing serious economic losses to the swine industry. However， the pathogenicity and virulence determinants of Mhp are not yet completely elucidated. Previous studies have found that Mhp lactate dehydrogenase （LDH） not only involved in the metabolism of Mhp， but also related to its virulence. Therefore， in this study， recombinant LDH （rLDH） was obtained through prokaryotic expression and affinity chromatography， and different concentrations of rLDH were used to interact with porcine bronchial epithelial cell （PBEC）. The effect of rLDH on cellular morphology was observed by microscope， and the effect of rLDH on cellular viability was detected by CCK-8 method. The rLDH concentrations （50 and 100 μg·mL-1） were selected for further analysis by that there was no significant effect on cellular morphology and viability when it incubated with PBEC， and the apoptosis rate of cells was detected by flow cytometry. The transcriptional and expression levels of apoptosis-related genes caspase3， caspase 8， caspase 9， Bax and BCL-2 were detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） and Western blot. The results showed that rLDH induced apoptosis of PBEC in a dose-dependent manner， the function of that was similar with Mhp. The mRNA levels of caspase 3， caspase 9， and Bax of PBEC after incubation with rLDH and Mhp 168 were significantly up-regulated and the mRNA level of BCL-2 was significantly down-regulated， while the mRNA of caspase 8 was not changed significantly. The protein expression levels of caspase 3 and Bax were significantly up-regulated and the protein expression level of BCL-2 was significantly down-regulated. The results showed that Mhp could induce the endogenous apoptosis of PBEC through LDH， in which the apoptosis-related factors caspase 3， caspase 9， Bax and BCL-2 playing important roles.

Key words： Mesomycoplasma hyopneumoniae; lactate dehydrogenase; PBEC; apoptosis

*Corresponding author：" YU Yanfei， E-mail：yuyanfeihaha@163.com

豬肺炎支原體（Mesomycoplasma hyopneumoniae， Mhp）是造成豬氣喘病的重要病原，在全世界幾乎所有的豬場廣泛流行，發(fā)病率高達 38%～100%［1］，我國超過99%的豬場存在Mhp 感染［2］，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前的防控手段存在生物安全控制成本高，免疫接種不能徹底消除感染，抗生素治療存在耐藥性，一旦感染很難徹底清除等諸多問題。而Mhp的致病機制尚未完全闡明，對于毒力因子的相關(guān)研究尚不深入，極大阻礙有效防控策略的制定。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一種由LDHA和LDHB兩種亞基組成的四聚體酶，是糖代謝途徑中一種關(guān)鍵的氧化還原酶。除了在糖代謝中的作用外，越來越多的研究表明LDH與病原微生物的毒力和致病性相關(guān)。如糞腸球菌LDH維持氧化還原平衡的能力決定了該菌對不同環(huán)境脅迫的抵抗力［3］；敲除LDH基因的化膿性鏈球菌、肺炎球菌、禾谷鐮刀菌生長受阻，毒力下降［4-6］；LDH的抑制劑（棉酚）可用于控制巴貝絲蟲的感染，綜上表明，LDH在病原微生物致病過程中也發(fā)揮重要作用［7］。在Mhp的研究中，LDH被報道是一種早期的特異性免疫原性蛋白，可通過與宿主受體細胞的纖連蛋白、肝素等結(jié)合發(fā)揮作用［8］。前期研究中也發(fā)現(xiàn)LDH蛋白在Mhp強毒株中高表達［9］，但其在Mhp致病過程中的作用尚不清楚。Mhp感染會引起宿主上皮細胞的損傷及凋亡，導(dǎo)致氣管及支氣管纖毛上皮細胞清除異物的能力下降，從而繼發(fā)其他細菌和病毒的混合感染，造成更嚴重的豬呼吸系統(tǒng)綜合征［8］。為了進一步探究LDH在Mhp致病過程中的作用，本文以LDH蛋白和Mhp靶細胞PBEC為研究對象，探究Mhp的LDH對PBEC凋亡的影響，為Mhp致病機制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細胞

選取Mhp強毒株168（F110+）和168經(jīng)多次體外傳代致弱的弱毒株168L（F300+，即168弱毒疫苗株）、豬支氣管上皮細胞PBEC和支原體KM2培養(yǎng)基（一種改良的Friis培養(yǎng)基，含15%豬血清）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

Mhp 168和Mhp 168L采用KM2培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待培養(yǎng)基由紅變黃時進行傳代或后續(xù)試驗。PBEC采用DF12培養(yǎng)基（含4%胎牛血清、0.5% G418、1%生長因子）培養(yǎng)，置于含5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)，待生長密度達到80%時，進行后續(xù)試驗。

1.2 試劑

DF12培養(yǎng)基、抗生素G418、胰酶、血清購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氣管上皮細胞生長因子購自LONZA公司；總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡試劑盒購自BD Pharmingen公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；細胞裂解緩沖液II、蛋白Marker、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PMSF溶液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、增強型CCK-8試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素檢測試劑盒（L00350）購自金斯瑞生物科技股份有限公司；Bax抗體、BCL-2抗體、GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Caspase 3抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標記羊抗兔抗體、HRP標記羊抗小鼠抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL電化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自上海天能生命科學(xué)有限公司。

1.3 主要儀器

超聲波細胞破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；半干法轉(zhuǎn)印儀購自通用電氣公司；ELx800酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；C6 Plus流式細胞儀購自BD Biosciences公司；ABI7500熒光定量PCR儀、CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；顯微鏡購自卡爾蔡司光學(xué)（中國）有限公司。

1.4 LDH原核表達及純化

LDH編碼序列在強毒株Mhp 168和弱毒株Mhp 168L中高度同源，而前期比較蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)LDH在強毒株Mhp 168中高表達［9］，推斷其與Mhp毒力相關(guān)。根據(jù)Mhp 168菌株LDH的基因序列（登錄號：MHP168_RS00895）進行密碼子優(yōu)化，采用原核表達載體pET-32a （+），通過BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點構(gòu)建重組質(zhì)粒，并命名為pET-32a-LDH，由金斯瑞生物科技股份有限公司進行密碼子優(yōu)化及合成；將重組質(zhì)粒10 μL加入到100 μL冰上融化的BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，42℃熱擊60s，然后迅速置于冰上2 min，加入900 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)1 h；取100 μL均勻涂布于含0.1%氨芐西林的LB平板上。37 ℃倒置培養(yǎng)過夜（約16 h）。挑取3～5個單菌落，37 ℃ 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)12～16 h后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。獲得的序列信息經(jīng)核酸序列比對分析后，選取正確的單克隆按1∶100的比例接種于含0.1%氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中。37 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)3 h，呈云霧狀（OD600 nm值為0.6～0.8）時加入終濃度0.5 mmol·L-1的IPTG。在16 ℃ 180 r·min-1誘導(dǎo)表達23h后收菌，同時設(shè)立未誘導(dǎo)前對照。

將1L誘導(dǎo)表達的菌體洗滌后，經(jīng)70 mL含30 mmol·L-1咪唑的PBS重懸后，進行冰上超聲波破碎（超聲功率450 W，工作時間3 s，停止時間6 s，超聲時間60 min）。11 000 r·min-1，4 ℃離心60 min，分離上清和沉淀；收集上清，用0.45 μm濾器過濾，轉(zhuǎn)入經(jīng)30 mmol·L-1咪唑平衡后的鎳柱，以1 mL·min-1的流速流過鎳柱。重復(fù)2次，收集穿流液備用；依次采用10倍柱體積的含30、100、250、500 mmol·L-1咪唑的PBS洗脫鎳柱，分別收集洗脫液。

將未誘導(dǎo)全菌蛋白、誘導(dǎo)后的全菌蛋白、過柱后的穿流液和各濃度咪唑的洗脫液分別進行SDS-PAGE檢測。將純度較好的蛋白洗脫液合并轉(zhuǎn)移到10 ku超濾管內(nèi)濃縮，并采用PBS進行換液。完成后的蛋白溶液再次進行SDS-PAGE檢測樣品純度和分子量，同時采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度測定，采用內(nèi)毒素檢測試劑盒進行內(nèi)毒素含量檢測。

1.5 兔抗rLDH多克隆抗體（Anti-rLDH）的制備和鑒定

將純化后的rLDH經(jīng)超濾濃縮后使?jié)舛冗_到2 mg·mL-1以上，選取2 kg新西蘭大白兔，每只兔使用免疫原1 mg，體積1 mL，免疫3次。首次免疫時，使用弗氏完全佐劑與純化后的rLDH以1∶1的比例進行乳化。二免及三免時，采用弗氏不完全佐劑和純化后的rLDH按1∶1比例混合制備免疫原。每次免疫間隔時間為14 d，三免后7 d采血，無菌分離血清，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Mhp 168菌株在KM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集20 mL 培養(yǎng)物，11 000 r·min-1離心20 min，使用5 mL PBS緩沖液重懸，450 w超聲破碎5 min后14 000 r·min-1，4℃離心15 min，收集上清，采用BCA蛋白檢測試劑盒進行濃度檢測，制備全菌蛋白。在全菌蛋白中按比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）混合均勻，沸水浴10 min制備樣品，每孔上樣20 μg進行SDS-PAGE電泳，通過半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用含5%脫脂乳的TBST緩沖液在37 ℃封閉2 h，TBST洗3次，10 min·次-1。然后加入一抗rLDH兔血清（1∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次后加入HRP標記的羊抗兔抗體作為二抗（稀釋比例1∶10 000）37℃孵育1 h。TBST清洗3次后將ECL電化學(xué)發(fā)光底物試劑均勻滴加于PVDF膜上，采用Bio-Rad Image LabTM software進行顯影成像，通過Western blot鑒定該多克隆抗體的特異性。

1.6 rLDH對細胞形態(tài)影響的顯微鏡觀察

為評估rLDH對PBEC形態(tài)的影響，待PBEC接種到6孔板中，待培養(yǎng)到密度為80%左右時，棄去培養(yǎng)基，清洗細胞，分別加入含不同濃度的rLDH（0、10、50、100和200 μg·mL-1）和 Mhp 168（MOI=100∶1和MOI=1 000∶1）的維持培養(yǎng)基（含2%胎牛血清的DF12培養(yǎng)基）作用24 h，采用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.7 CCK-8試劑盒法檢測細胞活力

進一步評估不同rLDH濃度和處理時間對PBEC活力的影響。將PBEC接種到96孔板中，待細胞密度為80%左右時，棄去培養(yǎng)基，清洗細胞，分別加入含不同濃度的rLDH（0、10、50、100和200 μg·mL-1）和 Mhp 168（MOI=100∶1和MOI=1 000∶1）的維持培養(yǎng)基作用24 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液。同時設(shè)立含rLDH或Mhp 168、維持培養(yǎng)基和CCK-8溶液但無細胞的孔作為對照，在含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，然后使用酶標儀測OD450 nm值。為避免高濃度的rLDH對細胞產(chǎn)生毒性作用，篩選細胞活力與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異的rLDH和Mhp 168濃度為后續(xù)試驗的最高處理濃度。

1.8 流式分析檢測細胞凋亡

將PBEC接種到6孔板中，待細胞密度為80%左右時，棄去培養(yǎng)基，清洗細胞。根據(jù)不同濃度rLDH對細胞形態(tài)及活力的影響結(jié)果分別設(shè)置高低濃度rLDH試驗組（rLDH的終濃度分別為50和100 μg·mL-1）、陰性對照組（維持培養(yǎng)基）和Mhp對照組（Mhp 168和Mhp 168L菌株，MOI=100∶1）與細胞進行孵育。各試驗組和對照組均設(shè)置3個復(fù)孔，在5% CO2的培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。細胞清洗消化后，用400 μL 1×Binding buffer重懸成密度為1×106·mL-1的單細胞懸液。每管細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光孵育5 min，補加100 μL 1×Binding buffer后立即進行流式分析。

1.9 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將PBEC接種到24孔板中，待細胞密度為80%左右時，棄去培養(yǎng)基，清洗細胞。設(shè)置陰性對照組（維持培養(yǎng)基）和高低濃度rLDH試驗組（rLDH的終濃度分別為50和100 μg·mL-1）和Mhp 168株對照組（MOI=100∶1）分別孵育細胞，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。棄去上清，清洗細胞，按照試劑盒（R1200-100T）說明書進行總RNA提取，并通過NanoDrop 2000檢測在260、280 nm處的吸光值，要求OD260 nm/OD280 nm的值為1.8～2.0。將得到的RNA按照HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R233-01）說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.10 引物合成和RT-qPCR檢測

RT-qPCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因名稱和參考序列見表1［10-12］。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，GAPDH作為內(nèi)參進行RT-qPCR擴增。RT-qPCR的反應(yīng)體系為20 μL，其中2×One Step SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火與延伸30 s，循環(huán)40次。按照公式2-ΔΔCt進行目的基因Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、BCL-2、Bax的相對定量分析，明確試驗組目的基因相對對照組轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8.3.0進行統(tǒng)計學(xué)分析及圖形繪制，使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多重比較。*代表兩組數(shù)據(jù)間存在統(tǒng)計學(xué)差異性的程度，其中，*.P＜0.05；**.P＜0.01；***.P＜0.001；****.P＜0.000 1。

1.12 Western blot檢測

采用6孔板按“1.10”的分組和方法孵育細胞24 h后，用預(yù)冷的PBS清洗細胞2次，然后每孔加入含1%PMSF的細胞裂解液60 μL，冰上裂解5 min。收集細胞裂解液于1.5 mL EP管，置于四維旋轉(zhuǎn)混合儀4℃旋轉(zhuǎn)裂解30 min。14 000 r·min-1，4℃離心15 min，收集上清，制備蛋白。以每孔20 μg的蛋白按照“1.5”中的方法進行SDS-PAGE電泳和Western blot分析。其中一抗的稀釋比例分別如下：BCL-2 （1∶1 000）；Bax （1∶5 000）；Caspase 3 （1∶1 000）；GAPDH （1∶5 000）。HRP標記的羊抗兔抗體或HRP標記的羊抗小鼠抗體二抗稀釋比例為 1∶10 000。采用Image J進行灰度值統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 rLDH的原核表達、蛋白純化及多克隆抗體制備

將重組質(zhì)粒pET-32a-LDH轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 （DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)測序驗證克隆正確后，采用0.5 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)LDH表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖1A），52 ku左右出現(xiàn)明顯的目的條帶，與LDH重組蛋白理論大小一致，證明LDH蛋白被成功誘導(dǎo)表達。將菌體超聲后的上清和不同濃度的咪唑洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，rLDH可以以可溶性的形式表達，且10和250 mmol·L-1咪唑洗脫液中均含有明顯的目的條帶（圖1A）。因此，收集100和250 mmol·L-1咪唑洗脫液，通過超濾管進行蛋白濃縮與換液。SDS-PAGE分析超濾結(jié)果，在52 ku左右出現(xiàn)目的條帶（圖1B）。通過BCA法檢測蛋白濃度為5.4 mg·mL-1，通過內(nèi)毒素檢測試劑盒測定內(nèi)毒素含量為0.621 EU·mL-1。-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。將獲得的純化蛋白免疫新西蘭大白兔后收集血清，采用Mhp 168株全菌蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印之后與rLDH高免血清進行Western blot分析。結(jié)果如圖1C所示，在34 ku的位置出現(xiàn)條帶，大小與LDH蛋白大小一致，未見明顯雜帶，表明制備的LDH多克隆抗體與Mhp 168全菌蛋白中的LDH蛋白發(fā)生了特異性結(jié)合，制備的LDH抗體具有較好的特異性。

2.2 rLDH對上皮細胞形態(tài)的影響

采用不同濃度的rLDH（0、10、50、100和200 μg·mL-1）和Mhp 168（MOI=100∶1和MOI=1 000∶1）分別與PBEC孵育24 h，使用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果如圖2所示，PBEC形態(tài)的異常變化與rLDH的濃度呈正相關(guān)。隨著rLDH濃度的增加，PBEC細胞形態(tài)逐漸出現(xiàn)不規(guī)則現(xiàn)象，細胞脫落數(shù)量增多，細胞出現(xiàn)異常的程度隨之加重。" 當rLDH濃度為200 μg·mL-1時，細胞出現(xiàn)微弱的形態(tài)變化。當rLDH的濃度≤100 μg·mL-1時，對細胞形態(tài)無明顯影響。采用Mhp 168感染PBEC后，當感染的MOI=100∶1時，細胞形態(tài)無明顯變化，但當感染的MOI=1 000∶1時，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞碎片增加。

2.3 rLDH對上皮細胞活力的影響

采用不同濃度的rLDH（0、10、50、100和200 μg·mL-1）和Mhp 168（MOI=100∶1和MOI=1 000∶1）與PBEC孵育24 h，通過CCK-8法測定細胞活力。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，隨著rLDH和Mhp濃度的增高，細胞活力逐漸下降。當rLDH的濃度為10、50、100 μg·mL-1時，細胞活力差異不顯著（Pgt;0.05）; rLDH濃度達到200 μg·mL-1時，細胞活力下降顯著（Plt;0.05）；當Mhp 168的MOI值達到1 000∶1時，細胞活力下降極顯著 （Plt;0.000 1）。綜上，為了減少因細胞形態(tài)和活力的變化帶來的影響，選用LDH（100 μg·mL-1）和Mhp 168 （MOI=100∶1） 為開展后續(xù)試驗的最高濃度。

2.4 rLDH對上皮細胞凋亡的影響

分別選用對細胞的形態(tài)和活力沒有顯著影響的50和100 μg·mL-1的rLDH與PBEC孵育，進行細胞凋亡研究。Annexin V/PI檢測是檢測細胞凋亡的重要手段之一，正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只位于細胞膜脂質(zhì)層的內(nèi)側(cè)，當細胞出現(xiàn)早期凋亡時，會使脂酰絲氨酸外翻，與FITC標記的Annexin V結(jié)合，細胞被熒光染料著色。PI是一種核酸染料，當細胞出現(xiàn)晚期凋亡時，核膜破壞，可使細胞核染色。采用流式細胞儀檢測rLDH引起的PBEC凋亡率（早期凋亡Annexin-V+PI-），結(jié)果如圖4所示，正常PBEC培養(yǎng)24 h后細胞的早期凋亡率為1.46%±0.19%；低濃度的rLDH（50 μg·mL-1）和高濃度的rLDH（100 μg·mL-1）誘導(dǎo)PBEC的早期凋亡率分別為4.93%±0.04%和10.3%±1.79%；Mhp 168和Mhp 168L誘導(dǎo)PBEC的早期凋亡率分別為10.07% ±0.4%和6.29%±2.71%；結(jié)果表明，Mhp 168和Mhp 168L及rLDH均能顯著引起PBEC產(chǎn)生細胞凋亡現(xiàn)象，且rLDH的濃度越高，誘導(dǎo)PBEC的細胞凋亡率越高， Mhp 168引起更高的早期凋亡率。

2.5 RT-qPCR分析rLDH對凋亡相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了進一步確定Mhp及其重要蛋白rLDH對PBEC凋亡的誘導(dǎo)作用，采用RT-qPCR法檢測凋亡通路上各標志基因mRNA水平的變化。從圖5可以看出，PBEC經(jīng)Mhp 168孵育后，促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平呈不同程度的升高，而抗凋亡因子BCL-2的mRNA水平下降。采用不同濃度的rLDH孵育細胞后，隨著rLDH濃度的增加，caspase 3的mRNA水平逐漸升高。其中，低濃度rLDH處理組（50 μg·mL-1）的PBEC caspase 3 mRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05），高濃度rLDH處理組（100 μg·mL-1）的caspase 3 mRNA水平極顯著上調(diào)（P＜0.000 1），且極顯著地高于Mhp 168處理組（P＜0.000 1）；低濃度rLDH處理組（50 μg·mL-1）的PBEC caspase 9 mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05），而高濃度rLDH處理組（100 μg·mL-1）的caspase 9 mRNA水平極顯著上調(diào)（P＜0.001）；高濃度rLDH處理組促凋亡因子Bax的mRNA水平極顯著上調(diào)（P＜0.001），且極顯著地高于Mhp 168處理組（P＜0.01）；抗凋亡因子BCL-2的mRNA水平極顯著下調(diào)（P＜0.01），而無論高濃度rLDH處理還是低濃度rLDH處理的PBEC的caspase 8 mRNA水平均沒有顯著變化（Pgt;0.05）。由于caspase 3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的執(zhí)行者，是所有凋亡途徑的共同通路，因此Mhp及rLDH誘導(dǎo)caspase 3的顯著轉(zhuǎn)錄再次證明Mhp及rLDH能誘導(dǎo)PBEC產(chǎn)生細胞凋亡的現(xiàn)象；而外源性凋亡途徑主要導(dǎo)致caspase 8的激活，內(nèi)源性凋亡途徑主要導(dǎo)致caspase 9激活，受BCL-2和Bax控制，因此RT-qPCR分析從mRNA水平證明Mhp感染PBEC的過程中，可能通過LDH誘導(dǎo)促凋亡因子Bax、Caspase 9和抗凋亡因子BCL-2的作用，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)源性凋亡過程。

2.6 Western blot檢測rLDH對凋亡相關(guān)因子表達水平的影響

采用Western blot方法進一步確認rLDH誘導(dǎo)PBEC凋亡標志蛋白表達水平的變化。結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，孵育Mhp 168菌株后，PBEC的caspase 3和促凋亡因子Bax表達水平顯著升高，而抗凋亡因子BCL-2的蛋白表達水平極顯著下調(diào)。不同濃度的rLDH孵育PBEC后，caspase 3和Bax的蛋白表達水平均顯著升高，證明rLDH對凋亡相關(guān)因子caspase 3和Bax表達起促進作用。不同濃度的rLDH孵育PBEC后，BCL-2的蛋白表達水平均極顯著下降，證明rLDH對凋亡相關(guān)因子BCL-2表達起抑制作用。rLDH及Mhp 168菌株均能引起PBEC三種凋亡相關(guān)蛋白表達水平的顯著變化，進一步從蛋白水平證實Mhp 168感染PBEC的過程中，可能通過LDH上調(diào)促凋亡因子Bax的表達和下調(diào)抗凋亡因子BCL-2的作用，引 起細胞內(nèi)源性凋亡的作用。

3 討 論

細胞凋亡是機體內(nèi)外因素刺激后誘發(fā)的細胞程序性死亡，機體可通過誘導(dǎo)自身細胞凋亡來抵御病原體的入侵，同時，病原體也可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡引發(fā)機體損傷［13-14］。多種動物支原體被報道可誘導(dǎo)細胞凋亡，如牛支原體、雞毒支原體、豬鼻支原體和Mhp等［15-18］。Mhp是豬地方性肺炎的病原，會引起豬群免疫力下降及生長速度減緩。其造成的感染病程長且難以凈化，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。Mhp感染后可誘導(dǎo)呼吸道氣管上皮及支氣管上皮細胞的損傷及凋亡，導(dǎo)致纖毛倒伏、破壞，清除異物能力下降，從而造成更嚴重的繼發(fā)及混合感染［8］。但Mhp導(dǎo)致細胞凋亡的機制尚不明確。作者前期從比較蛋白組學(xué)的角度篩選Mhp毒力相關(guān)因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDH在Mhp強毒株中高表達，可能參與其致病過程［9］。

LDH是糖代謝的關(guān)鍵酶之一，與機體細胞的物質(zhì)和能量代謝息息相關(guān)。此外，除了作為機體能量代謝的關(guān)鍵酶外，也有大量研究表明LDH作為一種兼職蛋白，還參與到病原微生物的致病過程。敲除LDH基因的肺炎球菌及禾谷鐮刀菌的菌株被報道生長受阻，毒力下降［5-6］。在抗寄生蟲藥物的研究中也發(fā)現(xiàn)，常見抗寄生蟲藥物吡喹酮、青蒿素、甲苯咪唑等均對LDH有抑制作用［19］，這些研究表明LDH除了作為代謝途徑中的關(guān)鍵酶之外，還可能作為毒力相關(guān)因子參與病原菌的致病過程。這種兼職功能對于Mhp這類基因組極端儉省的病原微生物發(fā)揮致病力作用顯得尤為重要。

為了探究LDH在Mhp致病過程中發(fā)揮的作用，本研究通過原核重組表達和親和層析獲得高純度LDH蛋白，將其與Mhp重要的靶細胞PBEC相互作用，發(fā)現(xiàn)rLDH能呈劑量依賴性地誘導(dǎo)PBEC發(fā)生細胞凋亡，其作用與Mhp菌株的作用一致。細胞凋亡分為外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡［13］，外源性凋亡途徑由TNF或FAS受體的激活誘導(dǎo)，進而導(dǎo)致caspase 8的激活。內(nèi)源性凋亡途徑主要受促凋亡因子Bax和抗凋亡因子BCL-2的控制。當Bax在細胞中過表達時，死亡信號增強，導(dǎo)致線粒體釋放細胞色素C，激活caspase 9［20］。BCL-2表達的下調(diào)和Bax表達的上調(diào)可作為細胞凋亡的重要指標， 活化的caspase 8和caspase 9都可誘導(dǎo)細胞caspase 3的激活。因此， caspase 3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的執(zhí)行者，是所有凋亡途徑的共同通路，可通過剪切細胞結(jié)構(gòu)蛋白，直接使細胞發(fā)生凋亡［21-22］。本研究中rLDH蛋白和Mhp菌株均可誘導(dǎo)caspase 3和促凋亡因子Bax的mRNA水平和蛋白表達水平的顯著上調(diào)，而抗凋亡因子BCL-2的mRNA水平和蛋白表達水平發(fā)生顯著下調(diào)，caspase 9的mRNA水平顯著上調(diào)；caspase 8的mRNA水平卻沒有顯著變化，初步表明Mhp可導(dǎo)致PBEC發(fā)生細胞凋亡。重組LDH蛋白對PBEC凋亡的作用及凋亡相關(guān)因子的影響趨勢與菌株一致，證明在Mhp感染PBEC的過程中，可能通過LDH誘導(dǎo)促凋亡因子Bax和caspase 9及抗凋亡因子BCL-2的作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)源性凋亡。

遺憾的是，Mhp難以接受外源基因，其基因編輯是世界性難題，加上LDH是支原體代謝中的關(guān)鍵酶，因此短期內(nèi)難以實現(xiàn)LDH的敲除，無法通過相應(yīng)基因缺失株進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)。但該研究為進一步探究Mhp破壞呼吸道屏障，引起呼吸系統(tǒng)疾病的機制提供了重要理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

在感染靶細胞PBEC的過程中，豬肺炎支原體可能通過LDH蛋白誘導(dǎo)PBEC內(nèi)源性細胞凋亡，凋亡相關(guān)因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中發(fā)揮重要作用。

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（編輯 白永平）