基于Nanopore測序技術的非洲豬瘟病毒全基因組測序方法建立

摘 要： 非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種高度傳染性和致死性疫病，近年來給我國生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成了沉重打擊。ASFV龐大的基因組導致人們難以及時掌握流行毒株的全基因組序列。本研究旨在利用Nanopore三代測序技術建立一種簡便可靠的ASFV全基因組測序方法。設計覆蓋ASFV全基因組的31對引物并分為4個引物池對樣本進行擴增，通過Nanopore測序技術對擴增產(chǎn)物進行測序，進一步優(yōu)化相關生物信息學分析方法，最終成功建立了ASFV 全基因組測序方法。應用該方法成功從某環(huán)境拭子樣本中獲取一株全長為189 416 bp的ASFV全基因組測序。經(jīng)一代測序驗證表明，在B646L、EP402R、E183L、MGF_360-12L、MGF_505-3R和I177L等關鍵基因及部分變異位點上，本方法結果與一代測序結果一致性100%；在全基因組水平上，本方法結果與二代測序結果一致性為99.94%。此外，在這項研究中，采用Nanopore測序技術發(fā)現(xiàn)了NP1450L基因與NP419L基因間區(qū)存在56 bp的重復序列插入（通過一代測序技術進行了驗證），但是二代測序未能發(fā)現(xiàn)這一顯著的變異特征。本研究成功建立了基于Nanopore技術的ASFV全基因組測序方法，該方法具有良好的簡便性和可靠性，為當前ASF的防控和分子流行病學研究提供了一個重要手段。

關鍵詞： Nanopore測序；非洲豬瘟病毒；生物信息學分析

中圖分類號： S852.659.1

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2080-10

收稿日期：2023-08-10

作者簡介：周 揚（1998-），男，廣東新興人，碩士，主要從事動物病原檢測技術和三代測序的研究，E-mail： 1418937102@qq.com

*通信作者：盧受昇，主要從事重要動物疫病的防控與研究，E-mail：1179581365@qq.com

A Whole Genome Sequencing Method for African Swine Fever Virus based on Nanopore Sequencing Technology was Established

ZHOU" Yang1，2， WU" Weizi1，2， CAO" Weisheng2， WANG" Fuguang1， XU" Xiuqiong1，

ZHONG" Wenxia1，

WU" Liyang1， YE" Jian1， LU" Shousheng1*

（1.Guangdong Center for Animal Disease Control and Prevention， Guangzhou 510230，" China;

2.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：" African swine fever （ASF） is a highly contagious and deadly disease caused by the African swine fever virus （ASFV）， which has dealt a heavy blow to the healthy development of China’s pig industry in recent years. The large genome of ASFV makes it difficult to obtain whole-genome sequence about epidemic strains in a timely manner. This study aims to establish a simple and reliable ASFV whole-genome sequencing method using Nanopore third-generation sequencing technology. Thirty-one primer pairs covering the entire ASFV genome were designed and divided into 4 primer pools to amplify the sample. The amplified product was sequenced by Nanopore sequencing technology， and the relevant bioinformatics analysis methods were further optimized， and finally the ASFV whole-genome sequencing method was successfully established. Whole-genome sequence of ASFV with a total length of 189 416 bp was successfully obtained from an environmental swab sample by this method. Validation through first-generation sequencing has shown that the result of this method is 100% consistent with first-generation sequencing results in key genes and certain variant positions， including B646L， EP402R， E183L， MGF_360-12L， MGF_505-3R， and I177L gene. At the whole-genome level， the consistency between the result of this method and next-generation sequencing（NGS）result is 99.94%. In addition， the utilization of Nanopore sequencing technology in this study revealed a 56 bp repeat sequence insertion within the intergenic region flanked by the NP1450L and NP419L genes. This insertion was subsequently confirmed via first-generation sequencing techniques. Intriguingly， NGS methods failed to detect this distinct variant feature. This study successfully established an ASFV whole-genome sequencing method based on Nanopore technology. This method demonstrates excellent simplicity and reliability， providing an essential tool for the current prevention and control and molecular epidemiological research of ASF.

Key words： nanopore sequencing; African swine fever virus; bioinformatics analysis

*Corresponding author：" LU Shousheng， E-mail： 1179581365@qq.com

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的急性、熱性、高度致死性傳染?。?］。2018年8月，我國東北首次報道ASF疫情并成功分離出ASFV［2］。此后，我國多地陸續(xù)出現(xiàn)ASF疫情［3-4］，大量豬因為感染ASFV而死亡，給我國生豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。ASFV基因組為170～193 kb，包括中央約125 kb的穩(wěn)定區(qū)和左右兩側的可變區(qū)［1］，左右兩側可變區(qū)包含大量MGF基因，這些MGF基因在長期的流行中出現(xiàn)不同模式的變異［5-6］。研究表明，許多基因對ASFV的致病性有重要影響，缺失某些毒力基因的ASFV對豬的致病性明顯降低［7-8］。然而，測序技術的局限性和ASFV龐大的基因組導致人們無法及時監(jiān)測當前流行毒株的全基因組序列。

一代測序又稱Sanger測序，其準確性高，被譽為測序技術的“金標準”［9］，但其每次測序的有效長度約為800 bp，具有通量低和耗時長的不足，不適用于ASFV的全基因組測序。二代測序（next-generation sequencing，NGS）主要以illumina測序技術和羅氏454測序技術為代表，目前，已廣泛應用于病原微生物的全基因組測序［10］。NGS具有高通量和高準確性的優(yōu)點，但其存在設備昂貴、操作復雜和測序耗時長等不足，不利于疫情的應急溯源。Nanopore測序由英國牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies， ONT）公司開發(fā)，屬于三代測序（third-generation sequencing，TGS）技術。Nanopore測序的基本原理是將某些生物跨膜蛋白質作為單分子傳感器嵌入在高電阻多聚物膜中，通過施加電泳力使帶負電荷的生物分子如DNA在DNA解旋酶的作用下解旋并通過跨膜蛋白，期間計算機通過電流變化來捕捉并分析序列信息，從而實現(xiàn)基因組測序。與NGS相比，Nanopore測序具有攜帶方便、操作便捷、超長讀長和單分子實時測序等優(yōu)勢［11］。在人類相關的重大疾病中，Nanopore測序使用已日益成熟。在新型冠狀病毒和甲型流感的研究中，基于Nanopore測序平臺建立完整的病毒全基因組測序流程并廣泛使用［12-13］。當前，猴痘病毒的傳播風險日益加深，靶向擴增子結合Nanopore測序的方法已用于猴痘病毒的全基因組測序中，為猴痘病毒的溯源提供了有力的技術支撐［14］。近年來，Nanopore測序在動物病毒的研究中也逐漸興起。Caserta等［15］基于靶向擴增和Nanopore測序平臺首次開發(fā)了一套針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的全基因組測序程序。此外，在禽流感和口蹄疫等重大動物疫病中也可見Nanopore測序平臺應用的報道［16-17］。Nanopore測序的諸多優(yōu)勢使其應用于ASFV全基因組測序的潛力巨大。本研究旨在通過應用Nanopore測序技術，優(yōu)化相關生物信息學分析方法，建立一種迅速、簡便的ASFV全基因組測序方法，為ASF的分子流行病學研究和疫情應急處置溯源提供一種可靠的新手段。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣本采自廣東地區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場豬肉檔口環(huán)境，經(jīng)億森寶非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒檢測，Ct值為22.62。

1.2 主要試劑

Fast Pure Viral DNA/RNA Mini Kit V2、Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit購自南京Vazyme公司，Prime STAR GXL DNA Polymerase（R050Q）、Premix Taq DNA Polymerase（RR003Q）購自日本TaKaRa公司，Native Barcoding Expansion（EXP-NBD104）、Flow Cell Wash Kit（EXP-WSH004）、Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK110）、Spot-ON Flow Cell（FLO-MIN106D）為英國Oxford Nanopore Technologies公司產(chǎn)品，Qubit 1×dsDNA HS Assay Kit（Q33230）為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，AMPure XP beads（A63880）為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

梯度PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，高速臺式冷凍離心機購自湘儀公司，GridION測序儀為英國Oxford Nanopore Technologies產(chǎn)品，磁力架（12321D）、Qubit 4 Fluorometer（Q33226）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 引物設計

基于我國發(fā)現(xiàn)并上傳至GenBank的ASFV全基因組序列，使用Oligo 7設計31對引物，引物信息見表1。

1.5 核酸抽提

取200 μL樣本，按照Fast Pure Viral DNA/RNA Mini Kit V2試劑盒說明書進行DNA提取。

1.6 靶向擴增子文庫構建及GridION測序儀測序

從引物1-F/R～31-F/R中分別取10 μL（10 μmol·L-1）引物，等比混合成4個引物池（Pool），分別為引物池1（pool 1，P1）、引物池2（pool 2，P2）、引物池3（pool 3，P3）和引物池4（pool 4，P4）。其中，P1包含引物1-F/R、3-F/R、5-F/R、7-F/R、9-F/R、11-F/R、13-F/R和15-F/R；P2包含引物2-F/R、4-F/R、6-F/R、8-F/R、10-F/R、12-F/R、14-F/R和16-F/R；P3包含引物17-F/R、19-F/R、21-F/R、23-F/R、25-F/R、27-F/R、29-F/R和31-F/R；P4包含引物18-F/R、20-F/R、22-F/R、24-F/R、26-F/R、28-F/R和30-F/R。將P1～P4作為靶向多重擴增引物，使用Prime STAR GXL DNA Polymerase對樣本DNA進行擴增。反應體系為50 μL，包括：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture （各2.5 mmol·L-1） 4 μL，引物 （P1、P2、P3或P4） 4 μL （10 μmol·L-1），PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2 μL，模板DNA 5 μL，無菌無核酶水補至50 μL；反應條件：95℃預變性2 min；98℃ 10 s、55℃ 15 s、68 ℃ 4 min，35個循環(huán)擴增；68 ℃終延伸5 min。使用AMPure XP磁珠以1∶1的體積比純化P1～P4的擴增產(chǎn)物并使用Qubit 4熒光計測定濃度（ng·μL-1）。最后從P1～P4分別取600 ng純化產(chǎn)物，混合成ASFV全基因組擴增子。根據(jù)SQK-LSK109建庫測序方案進行ASFV文庫構建后加入Nanopore Flow cells R9.4測序芯片中，在GridION測序儀上測序。

1.7 生物信息學分析

GridION設備產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)用經(jīng)以下軟件進行處理分析。測序結果經(jīng)Guppy轉換為fastq格式數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。首先使用NanoFilt（2.8.0）過濾長度小于1 000 bp，質量值低于Q10的測序數(shù)據(jù)［18］；進一步使用Nanoplot（1.41.0）對過濾后的Fstaq數(shù)據(jù)進行質控，評估reads數(shù)、測序質量和讀長分布等［18］。以我國代表毒株Pig/HLJ/18（GenBank登錄號：MK333180）作為參考基因組，利用Minimap2（2.17-r941）對質控后的測序結果進行比對，并使用SAMtools（1.17）統(tǒng)計每個位點的測序深度及與參考序列匹配的reads數(shù)［19］，使用Medaka（1.8.1）及Canu完成測序結果拼接，應用GATU進行基因注釋［20］（圖1）。

1.8 測序結果準確性驗證

1.8.1 NGS驗證

為驗證Nanopore測序的準確性，將P1～P4的擴增產(chǎn)物交由廣東美格基因科技有限公司進行NGS。通過MAFFT軟件對NGS結果和Nanopore測序結果進行比對以驗證Nnaopore測序的準確性。

1.8.2 一代測序驗證

使用Oligo 7對ASFV的B646L、EP402R、E183L、I177L、MGF_360-12L和MGF_505-3R等關鍵基因設計引物進行擴增。將Nanopore測序結果與Pig/HLJ/18進行比對，隨機選取部分變異位點，進一步設計引物進行擴增測序，驗證變異位點的準確性。一代測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2 結 果

2.1 PCR擴增

將引物等比混合成P1～P4后進行靶向多重PCR擴增，取5 μL PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，結果表明各引物池均擴增出預期條帶（圖2）。

2.2 生物信息學分析

經(jīng)測序成功獲得1.51 G的Fastq原始數(shù)據(jù)，使用Nanofilt軟件過濾長度低于1 000 bp及測序質量低于Q10的測序數(shù)據(jù)后，余1.47 G Fsatq原始數(shù)據(jù)。經(jīng)Nanoplot軟件質控表明過濾后reads數(shù)為124 126條，平均每條reads長度為6 174.2 bp，reads長度N50為7 096 bp（圖3A）。過濾后堿基的準確性gt;90%（Q10），平均reads質量為Q13。SAMtools軟件分析表明有98.04%的reads與參考序列匹配（表2）。測序深度統(tǒng)計表明本次測序的最大測序深度為18 684×，平均測序深度為3 906×（圖3B），其中測序深度大于50×的堿基位點占比為99.53%，但存在覆蓋度不均勻的現(xiàn)象。使用Medaka和canu軟件完成序列拼接，得到長度為189 416 bp的樣本全基因組序列（CN/GD/2022，GenBank登錄號：OR290104），GATU注釋表明該毒株包含183個ORF。通過ASFV B646L 基因3′端部分序列遺傳進化分析表明CN/GD/2022屬于基因Ⅱ型ASFV（圖4）。

2.3 Nanopore測序結果準確性驗證

2.3.1 NGS驗證

廣東美格基因科技有限公司最終返回全長為188 491 bp的ASFV NGS結果，經(jīng)MAFFT全基因組比對表明NGS結果與本方法測序結果一致性為99.94%。在B646L、EP402R、E183L、MGF_505-3R、MGF_360-12L和I177L等關鍵基因上，Nanopore測序和NGS結果完全一致；隨機選取6處變異位點驗證，在其中5處變異位點中NGS結果和Nanopore測序結果相同（表3）。同時，基于參考毒株Pig/HLJ/18，本次驗證發(fā)現(xiàn)NGS結在MGF_505-9R與MGF_505-10R基因間非編碼區(qū)測出2次“TCAATAGTTTAGTTAAG”的重復序列，而Nanopore測序測出3次重復序列（圖5A）；進一步比對發(fā)現(xiàn)在NP1450L和NP419L基因間區(qū)，NGS結果與Nanopore測序結果差異較大，NGS結果表明該處存在56 bp序列插入，而NGS結果與參考序列一致（圖5 B）。

2.3.2 一代測序驗證

通過MEGA 7比對表明，在關鍵基因如B646L、EP402R、E183L、MGF_505-3R、MGF_360-12L和I177L基因上，Nanopore測序結果與一代測序結果一致性為100%；在6處變異位點上，Nanopore測序在其中5處變異位點上的測序結果與一代測序結果相符（表3）。本次試驗發(fā)現(xiàn)在重復序列上Nanopore測序結果與一代測序結果一致，實現(xiàn)MGF_505-9R與MGF_505-10R基因間非編碼區(qū)中3次“TCAATAGTTTAGTTAAG”的重復序列的測序（圖5 A）。進一步驗證發(fā)現(xiàn)NP1450L和NP419L基因間區(qū)存在56 bp的小片段插入（GenBank登錄號：OR290103），與NP419L基因中部分序列形成連續(xù)重復序列（圖5 B），Nanopore測序成功發(fā)現(xiàn)該變異特征。

3 討 論

自2018年ASFV入侵我國以來，非洲豬瘟在我國廣泛傳播并趨于穩(wěn)定。然而，ASFV的基因組極為復雜，其中許多基因功能至今尚不明確，且迄今尚未開發(fā)出有效的疫苗來防控ASFV的傳播。隨著非洲豬瘟在我國的傳播時間延長，從早期報道的缺失株到近期報道的重組毒株，ASFV流行情況變得更加復雜和多樣化［21］。

近年來，Nanopore測序長讀長及高產(chǎn)量的優(yōu)勢，使其逐漸應用于具有較大基因組的病原體的測序中，包括猴痘病毒、埃博拉病毒、多種細菌和真菌等［22-24］。通過預訓練算法，Nanopore測序技術可以通過未修飾堿基和修飾堿基的納米孔讀數(shù)產(chǎn)生的電流強度來檢測DNA修飾，用于表觀遺傳學的研究［25］。與NGS相比，Nanopore測序設備具有簡化的操作流程、輕便的設備、以及較低的能耗。以Goordial等［26］的研究為例，他們成功將Nanopore測序設備運往北極地區(qū)，對土壤樣本進行了宏基因組測序，從而揭示了凍土中微生物群落的關鍵信息。另外，Castro-Wallace等［27］的研究表明，將Nanopore測序平臺運送至國際空間站后，通過對預先設置的樣本進行測序和分析，證實了Nanopore測序平臺在國際空間站上復雜的環(huán)境中能夠實現(xiàn)與地面相當?shù)男阅芩健１敬卧囼灢捎肗anopore連接法進行ASFV文庫構建，從樣本核酸提取到完成測序時長約為13 h；試驗過程中主要使用的設備有PCR儀、GridION測序儀和分析服務器。Nanopore測序不僅大大減少了試驗工作量，而且在資源有限的情況下使用更加方便。以上優(yōu)勢使Nanopore測序在疫情暴發(fā)初期及時監(jiān)測毒株的全基因組序列方面具有良好的潛力。

測序深度、錯誤率和reads長度等指標對測序結果的準確性有直接的影響。本次試驗的平均測序深度達到了3 905×，而reads的長度N50值為7 096 bp。長reads不僅可以減少組裝和分析測序結果的復雜性，而且更好檢測到某些重復序列和結構變異。然而，通過測序深度分析發(fā)現(xiàn)本次試驗在不同基因區(qū)域的測序深度存在差異，這可能會導致一些覆蓋率低的基因位點的準確性降低。這種現(xiàn)象與靶向多重PCR反應中各引物的擴增效率不一致密切相關。在后續(xù)的試驗中，可以優(yōu)化引物池中各引物的比例，以促進擴增片段在ASFV的基因組中均勻分布。Jia等［3］使用Nanopore測序技術對ASFV進行全基因組測序的研究結果顯示，下機數(shù)據(jù)中僅包含0.15%的ASFV reads，平均測序深度為330.08×。相比之下，本次試驗的結果更為可靠。通過采用靶向擴增技術，本試驗中ASFV reads占據(jù)了樣本下機數(shù)據(jù)的98.04%，平均測序深度達到了3 906×。因此，這種方法能夠富集樣本中的病毒核酸，減少宿主基因比例，從而通過提高測序深度來提高測序結果的準確性。此外，Nanopore測序的準確性受到納米孔蛋白活性、化學建庫試劑和數(shù)據(jù)分析方法等多個因素的影響。NGS可保證99%以上的準確性，相對而言，Nanopore測序的準確性較低，通常在85%～99%。在本次試驗中，Nanopore測序的結果與NGS的一致性達到了99%以上，而且經(jīng)過一代測序驗證了部分變異位點的準確性。隨著芯片的更迭以及堿基調用算法的不斷改進，Nanopore測序的準確性將會不斷提高。Nanopore測序依賴于通過納米孔的DNA分子產(chǎn)生的電流信號來識別和記錄堿基序列。不同的堿基會產(chǎn)生不同的電流信號，因此可以根據(jù)電流信號來識別相應的堿基。當一連串的相同堿基通過納米孔時，電流信號可能變得相似，難以準確區(qū)分，這是導致本研究中Nanopore測序在連續(xù)的A、T、C或G區(qū)域表現(xiàn)出較低的準確性的主要原因。但在最新的研究中，通過優(yōu)化納米孔蛋白材料、堿基調用算法和測序結果質控糾錯程序，Nanopore測序的準確性在不斷提高［28］。DNA中的重復序列在各種不同的生物種類中都廣泛存在，如近一半的人類基因組被重復序列覆蓋。同樣，ASFV龐大的基因組中存在一定量的串聯(lián)重復序列［29］。經(jīng)一代測序、NGS及Nanopore測序結果比對，本研究發(fā)現(xiàn)NGS未能正確實現(xiàn)ASFV MGF_505-9R和MGF_505-10R基因間區(qū)及NP1450L和NP419L基因間區(qū)的重復序列的測序。一方面，NGS讀長短（～250 bp），容易在測序結果的比對和組裝過程中產(chǎn)生歧義，無法準確識別出重復序列［30］；另一方面，Nanopore測序為單分子長讀長測序，理論上通過納米孔的單條DNA序列有多長即可測多長，該優(yōu)勢使其在實現(xiàn)重復序列和結構變異等復雜基因組的測序上更具優(yōu)勢。因此，在ASFV的全基因組測序中，可以將Nanopore測序與NGS相結合，以獲取高質量的流行毒株全基因組。

當前我國除了基因Ⅱ型ASF流行之外，還陸續(xù)報告了基因Ⅰ型、基因缺失型和重組型ASFV。在這種情況下，可以根據(jù)基因Ⅰ型和基因Ⅱ型流行毒株的共同保守位點設計引物，并單獨設計跨越常見MGF基因缺失區(qū)域的引物，將它們合并為一個引物池。這樣的策略可以實現(xiàn)臨床樣本的靶向擴增并應用于Nanopore測序，以應對我國當前復雜多變的ASFV流行情況。經(jīng)B646L基因C端部分序列可將ASFV分為24個基因型［31］，經(jīng)遺傳進化分析表明CN/GD/2022為基因Ⅱ型ASFV，屬于目前我國主要流行的基因型。因此，本次建立的Nanopore測序平臺適用于我國流行ASFV的全基因組測序。

4 結 論

本研究基于Nanopore測序平臺成功建立了ASFV 全基因組測序方法，通過該方法成功實現(xiàn)了臨床ASFV陽性樣本的全基因組測序。經(jīng)分析表明，該方法具有快速、準確、操作簡便等優(yōu)點，為ASF診斷、監(jiān)測和預警提供了一個重要的手段。

參考文獻（References）：

［1］ ALONSO C， BORCA M， DIXON L， et al. ICTV virus taxonomy profile：Asfarviridae［J］. J Gen Virol， 2018， 99（5）：613-614.

［2］ ZHAO D M， LIU R Q， ZHANG X F， et al. Replication and virulence in pigs of the first African swine fever virus isolated in China［J］. Emerg Microbes Infect， 2019， 8（1）：438-447.

［3］ JIA L J， JIANG M W， WU K， et al. Nanopore sequencing of African swine fever virus［J］. Sci China Life Sci， 2020， 63（1）：160-164.

［4］ 張艷艷， 張靜遠， 楊金金， 等. 1株非洲豬瘟病毒自然變異毒株的鑒定［J］. 中國獸醫(yī)學報， 2021， 41（2）：199-207.

ZHANG Y Y， ZHANG J Y， YANG J J， et al. Identification of a natural variant of African swine fever virus in China［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2021， 41（2）：199-207.

［5］ SHI K C， LIU H X， YIN Y W， et al. Molecular characterization of African swine fever virus from 2019-2020 outbreaks in Guangxi Province， Southern China［J］. Front Vet Sci， 2022， 9：912224.

［6］ SUN Y K， XU Z Y， GAO H， et al. Detection of a novel African swine fever virus with three large-fragment deletions in genome， China［J］. Microbiol Spectr， 2022， 10（5）：e0215522.

［7］ TEKLUE T， WANG T， LUO Y Z， et al. Generation and evaluation of an African swine fever virus mutant with deletion of the CD2v and UK genes［J］. Vaccines （Basel）， 2020， 8（4）：763.

［8］ CHEN W Y， ZHAO D M， HE X J， et al. A seven-gene-deleted African swine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine in pigs［J］. Sci China Life Sci， 2020， 63（5）：623-634.

［9］ SANGER F， NICKLEN S， COULSON A R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1977， 74（12）：5463-5467.

［10］ MARDIS E R. Next-generation DNA sequencing methods［J］. Annu Rev Genom Hum Genet， 2008， 9（1）：387-402.

［11］ LIN B， HUI J A， MAO H J. Nanopore technology and its applications in gene sequencing［J］. Biosensors （Basel）， 2021， 11（7）：214.

［12］ KING J， HARDER T， BEER M， et al. Rapid multiplex MinION nanopore sequencing workflow for influenza A viruses［J］. BMC Infect Dis， 2020， 20（1）：648.

［13］ LAMBISIA A W， MOHAMMED K S， MAKORI T O， et al. Optimization of the SARS-CoV-2 ARTIC network V4 primers and whole genome sequencing protocol［J］. Front Med （Lausanne）， 2022， 9：836728.

［14］ LAITON-DONATO K， LVAREZ-DAZ D A， FRANCO-MUOZ C， et al. Monkeypox virus genome sequence from an imported human case in Colombia［J］. Biomedica， 2022， 42（3）：541-545.

［15］ CASERTA L C， ZHANG J Q， PIEYRO P， et al. Rapid genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） using MinION nanopore sequencing［J］. PLoS One， 2023， 18（5）：e0282767.

［16］ DE VRIES E M， COGAN N O I， GUBALA A J， et al. Rapid， in-field deployable， avian influenza virus haemagglutinin characterisation tool using MinION technology［J］. Sci Rep， 2022， 12（1）：11886.

［17］ BROWN E， FREIMANIS G， SHAW A E， et al. Characterising foot-and-mouth disease virus in clinical samples using nanopore sequencing［J］. Front Vet Sci， 2021， 8：656256.

［18］ DE COSTER W， D’HERT S， SCHULTZ D T， et al. NanoPack： visualizing and processing long-read sequencing data［J］. Bioinformatics， 2018， 34（15）：2666-2669.

［19］ DANECEK P， BONFIELD J K， LIDDLE J， et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools［J］. Gigascience， 2021， 10（2）：giab008.

［20］ TCHEREPANOV V， EHLERS A， UPTON C. Genome Annotation Transfer Utility （GATU）： rapid annotation of viral genomes using a closely related reference genome［J］. BMC Genomics， 2006， 7：150.

［21］ ZHAO D M， SUN E C， HUANG L Y， et al. Highly lethal genotype I and II recombinant African swine fever viruses detected in pigs［J］. Nat Commun， 2023， 14（1）：3096.

［22］ QUICK J， LOMAN N J， DURAFFOUR S， et al. Real-time， portable genome sequencing for Ebola surveillance［J］. Nature， 2016， 530（7589）：228-232.

［23］ PETERSEN L M， MARTIN I W， MOSCHETTI W E， et al. Third-generation sequencing in the clinical laboratory： exploring the advantages and challenges of nanopore sequencing［J］. J Clin Microbiol， 2019， 58（1）：e01315-19.

［24］ ASHIKAWA S， TARUMOTO N， IMAI K， et al. Rapid identification of pathogens from positive blood culture bottles with the MinION nanopore sequencer［J］. J Med Microbiol， 2018， 67（11）：1589-1595.

［25］ LIU Y， ROSIKIEWICZ W， PAN Z W， et al. DNA methylation-calling tools for Oxford Nanopore sequencing： a survey and human epigenome-wide evaluation［J］. Genome Biol， 2021， 22（1）：295.

［26］ GOORDIAL J， ALTSHULER I， HINDSON K， et al. In situ field sequencing and life detection in remote （79°26′N） Canadian high arctic permafrost ice wedge microbial communities［J］. Front Microbiol， 2017， 8：2594.

［27］ CASTRO-WALLACE S L， CHIU C Y， JOHN K K， et al. Nanopore DNA sequencing and genome assembly on the international space station［J］. Sci Rep， 2017， 7（1）：18022.

［28］ WANG Y H， ZHAO Y， BOLLAS A， et al. Nanopore sequencing technology， bioinformatics and applications［J］. Nat Biotechnol， 2021， 39（11）：1348-1365.

［29］ KIM S H， LEE S I， JEONG H G， et al. Rapid emergence of African swine fever virus variants with different numbers of a tandem repeat sequence in South Korea［J］. Transbound Emerg Dis， 2021， 68（4）：1726-1730.

［30］ TREANGEN T J， SALZBERG S L. Repetitive DNA and next-generation sequencing： computational challenges and solutions［J］. Nat Rev Genet， 2011， 13（1）：36-46.

［31］ ACHENBACH J E， GALLARDO C， NIETO-PELEGRN E， et al. Identification of a new genotype of African swine fever virus in domestic pigs from ethiopia［J］. Transbound Emerg Dis， 2017， 64（5）：1393-1404.

（編輯 白永平）