雄激素受體抑制劑恩雜魯胺對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響

摘 要： 旨在通過(guò)使用恩雜魯胺探究雄激素受體（AR）對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響。本研究首先對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，然后利用顯微鏡觀察和CCK8探究顆粒細(xì)胞的恩雜魯胺適合培養(yǎng)濃度；之后將試驗(yàn)分為3個(gè)組，即空白對(duì)照組（不做處理）、陰性對(duì)照組（DMSO處理）和試驗(yàn)組（恩雜魯胺處理），每個(gè)組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)；然后利用EDU檢測(cè)顆粒細(xì)胞的增殖情況，使用Caspase3活性與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顆粒細(xì)胞的凋亡情況，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)顆粒細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，AR抑制劑恩雜魯胺能夠顯著地抑制顆粒細(xì)胞的增殖和降低顆粒細(xì)胞中CCND1、PCNA和MKI67基因的mRNA水平，并且還能夠顯著抑制CCND1、PCNA和β-catenin蛋白的表達(dá)；此外，恩雜魯胺還能夠促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，顯著提高山羊卵泡顆粒細(xì)胞中BAX和BCL2的mRNA水平，但不影響B(tài)AX和BCL2的蛋白表達(dá)，另外恩雜魯胺雖然沒(méi)有影響CASP3基因的mRNA水平但能夠提高Caspase 3的活性。這些結(jié)果表明，恩雜魯胺抑制AR活性后能夠影響顆粒細(xì)胞中β-catenin、PCNA、CCND1、Caspase 3等的表達(dá)，參與調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖凋亡。

關(guān)鍵詞： 山羊；顆粒細(xì)胞；AR；恩雜魯胺；增殖凋亡

中圖分類號(hào)： S827.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2022-10

收稿日期：2023-09-18

基金項(xiàng)目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2023KJCX004）；廣東省南方現(xiàn)代草牧業(yè)（羊）創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2023KJ127）；廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳項(xiàng)目（2022-XPY-00-009）；韶關(guān)市仁化縣牛羊產(chǎn)業(yè)園項(xiàng)目（GDSCYY2021-018）

作者簡(jiǎn)介：董書(shū)餐（1999-），男，云南梁河人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： dsc15184989294@163.com

*通信作者：柳廣斌，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： gbliu@scau.edu.cn

The Effect of the Androgen Receptor Inhibitor Enzalutamide on Proliferation and Apoptosis of Goat Ovarian Granulosa Cells

DONG" Shucan， MAO" Shuaixiang， WU" Cuiying， LI" Yaokun， SUN" Baoli， GUO" Yongqing， DENG" Ming， LIU" Dewu， LIU" Guangbin*

（College of Animal Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the effects of androgen receptor （AR） on goat granulosa cell proliferation and apoptosis using enzalutamide. Firstly， granulosa cells from goats were isolated and subjected to in vitro culture. The suitable concentration of enzalutamide for cell culture was determined by microscopic observation and CCK8 assay. The experiment was then divided into 3 groups： blank control group （no treatment）， negative control group （treated with DMSO）， and experimental group （treated with enzalutamide）. Each group was set up with 3 replicates. Cell proliferation was detected using the EDU assay， while cell apoptosis was assessed using Caspase3 activity and apoptosis detection kits. The expression of genes and proteins related to cell proliferation and apoptosis was evaluated using quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blot analysis. The results showed that the AR inhibitor， enzalutamide， significantly inhibited cell proliferation and reduced the mRNA levels of CCND1， PCNA， and MKI67 in granulosa cells. It also suppressed the protein expression of CCND1， PCNA， and β-catenin. Additionally， enzalutamide promoted apoptosis in goat granulosa cells， as evidenced by increased mRNA levels of BAX and BCL2， without affecting their protein expression. Furthermore， enzalutamide， while not affecting the mRNA level of CASP3， enhanced Caspase3 activity. These findings suggest that enzalutamide， by inhibiting AR activity， can modulate the expression of β-catenin， PCNA， CCND1， Caspase 3， and other genes involved in the regulation of granulosa cell proliferation and apoptosis.

Key words： goat; granulosa cell; androgen receptor; enzalutamide; proliferation apoptosis

*Corresponding author：LIU Guangbin， E-mail： gbliu@scau.edu.cn

繁殖性能是衡量家畜生產(chǎn)水平的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，直接影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，提高家畜的繁殖性能對(duì)于促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。卵泡發(fā)育是影響雌性哺乳動(dòng)物繁殖性能的重要因素之一［1］。在雌性哺乳動(dòng)物剛出生時(shí)，卵巢擁有大量的卵泡儲(chǔ)備，然而隨著動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，體內(nèi)的卵泡逐漸凋亡閉鎖，僅有少量的優(yōu)勢(shì)卵泡能夠破裂排出可用于受精的卵母細(xì)胞，因此動(dòng)物的卵泡發(fā)育并不是一個(gè)高效的過(guò)程［2-4］。了解卵泡發(fā)育的機(jī)制對(duì)于提高動(dòng)物的繁殖性能具有重要意義。卵泡主要由顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及膜細(xì)胞組成［5］。顆粒細(xì)胞在卵泡的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其通過(guò)間隙連接與卵母細(xì)胞和膜細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)傳遞和物質(zhì)交換，還可以通過(guò)旁分泌調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)［6］。此外，顆粒細(xì)胞還能夠表達(dá)促卵泡激素、黃體生成素/絨毛膜促性腺激素等多種激素的受體從而使初級(jí)卵泡對(duì)性腺軸激素具有應(yīng)答功能［7］。許多研究表明，顆粒細(xì)胞的凋亡是造成卵泡閉鎖的重要因素之一［8-9］。因此探究顆粒細(xì)胞的增殖凋亡機(jī)制對(duì)于全面了解卵泡發(fā)育具有重要意義。

雄激素受體（androgen receptor， AR）屬于核受體超家族中的類固醇受體，能夠與雄激素結(jié)合作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達(dá)［10］。通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段的卵泡進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)AR基因表達(dá)貫穿卵泡發(fā)育的全過(guò)程，并在卵泡發(fā)育不同階段呈現(xiàn)出不同表達(dá)趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為在大卵泡中低表達(dá)，而在小卵泡中高表達(dá)，表明AR可能參與調(diào)控卵泡的發(fā)育［11-12］。卵泡顆粒細(xì)胞AR特異性敲除小鼠表現(xiàn)出卵泡閉鎖率高、繁殖力低等情況［13］。此外，在豬卵泡顆粒細(xì)胞中AR能夠與miR-126互作參與調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞中促卵泡生成素受體的表達(dá)［14］。這些結(jié)果表明AR在卵泡顆粒細(xì)胞中發(fā)揮著重要功能。恩雜魯胺（enzalutamide）是一種AR拮抗劑，能夠與雄激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AR使其失去轉(zhuǎn)錄活性，因此能夠被用于AR功能的探索［15］。

探究AR在卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡中的作用對(duì)于全面了解卵泡發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。本研究通過(guò)利用恩雜魯胺探索AR在卵泡發(fā)育過(guò)程中對(duì)顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響，以期為全面了解卵巢卵泡發(fā)育機(jī)制和卵泡相關(guān)疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 山羊卵泡顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

山羊屠宰后找到卵巢組織并取下卵巢，然后分別在75%的酒精和含2%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的生理鹽水中滅菌，之后放入37℃含2%雙抗溶液的生理鹽水中保存運(yùn)輸?；氐綄?shí)驗(yàn)室后在已提前30 min紫外滅菌的生物安全柜中分離卵泡顆粒細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，首先，對(duì)運(yùn)輸回來(lái)的卵巢進(jìn)行消毒，結(jié)束后將卵巢放入37℃含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，然后使用注射器刺破卵泡使卵泡中的顆粒細(xì)胞釋放出來(lái)，之后收集DMEM培養(yǎng)液并過(guò)70 μm的細(xì)胞篩，過(guò)篩結(jié)束后室溫靜置15 min；然后1 000 r·min-1條件下離心10 min，離心結(jié)束后棄去上清，使用3 mL含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次離心并棄上清；接著使用10 mL完全培養(yǎng)基（配方：90% DMEM/F12+10% FBS+1% 雙抗+1% 100×ITS-A）重懸細(xì)胞，并將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中；最后將細(xì)胞放在5% CO2，飽和濕度和37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去未貼壁的細(xì)胞并更換新的完全培養(yǎng)基，之后每48 h更換一次培養(yǎng)基直至細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右后進(jìn)行細(xì)胞傳代與凍存。

1.2 CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的山羊卵泡顆粒細(xì)胞接種于96孔板中，其中96孔板外圍一圈孔只加入完全培養(yǎng)基不加入細(xì)胞，防止中央液體的揮發(fā)影響試驗(yàn)結(jié)果，細(xì)胞鋪板完成后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，試驗(yàn)組分為4個(gè)不同濃度梯度處理的恩雜魯胺培養(yǎng)液培養(yǎng)，恩雜魯胺濃度分別為20、40、60、80 μmol·L-1，對(duì)照組則采用恩雜魯胺的溶劑DMSO處理，每組對(duì)照組的DMSO加入量與恩雜魯胺溶液加入量相同，每個(gè)處理至少有4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。然后在24、48、72 h時(shí)向每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中分別加入10 μL的CCK8試劑，1 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)液450 nm處的吸光度值，吸光度值越大代表細(xì)胞的增殖活力越強(qiáng)。

1.3 EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)

按照Cell-LightTM EDU Apollo In Vitor Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，將配置好的EDU溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育2 h，取出培養(yǎng)液，然后使用細(xì)胞固定液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定30 min，通透液通透10 min，PBS洗滌。然后進(jìn)行Apollo染色，PBS洗滌之后，使用Hoechst染料進(jìn)行細(xì)胞核DNA染色。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.4 活細(xì)胞Caspase3活性與細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將細(xì)胞接種于24孔板中，使用恩雜魯胺處理后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS洗滌細(xì)胞。然后加入192 μL的Annexin V-mCherry Binding Buffer，5 μL的Annexin V-mCherry，2 μL的Hoechst 33342和1 μL的GreenNucTMcaspase3 Substrate，輕輕混勻，室溫避光孵育30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光發(fā)光情況。

1.5 RNA的提取與cDNA的合成

使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。首先，使用0.25%的胰酶消化、離心收集細(xì)胞，棄去上清并加入800 μL的Trizol，室溫裂解5 min，之后加入160 μL氯仿，離心收集上層水相，然后加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，離心棄去異丙醇，75%乙醇洗滌沉淀，干燥，無(wú)菌無(wú)酶水溶解，-80℃保存。細(xì)胞總RNA按照艾科瑞生物公司的EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取1μg總RNA使用gDNA Clean Reaction Mix、EVO M-MLV RT Reaction Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，5 s。

1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成

登錄NCBI搜索山羊PCNA、CCND1、MKI67、BAX、BCL2、CASP3和β-ACTIN基因的CDS區(qū)序列，使用NCBI中的pick primers在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)置引物至少跨一個(gè)外顯子，以防止基因組干擾。所有引物均由生工生物工程有限公司合成，合成引物及序列見(jiàn)表1。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）

以cDNA為模板，按照諾維贊ChamQ SYBR qPCR Master Mix （Low ROX Premixed）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix （Low ROX Premixed）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。以β-Actin作為內(nèi)參，結(jié)果使用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。

1.8 蛋白提取與Western blot檢測(cè)

按照RIPA裂解緩沖液Ⅲ的說(shuō)明提取細(xì)胞總蛋白，然后用改良型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)總蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度使用 RIPA裂解緩沖液Ⅲ調(diào)整每個(gè)樣品的蛋白以使各樣品濃度大概一致，然后向每個(gè)蛋白樣品中加入 4×Protein SDS PAGE loading buffer，在100℃下變性10 min。變性蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至 0.45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用 Quick blockTM blocking buffer for western blot封閉10 min后，使用1×TBST洗膜5次，每次5 min。洗膜結(jié)束后，向PVDF膜中加入一抗，4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，洗膜，之后用相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h，洗膜，最后使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在對(duì)應(yīng)儀器中觀察蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （SD）” 表示，至少有 3 個(gè)獨(dú)立重復(fù)。兩組或多組之間的差異分析分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，所有分析均在GraphPad Prism9中完成?！?”代表P＜0.05，“**”代表P＜0.01，“***”代表P＜0.001，“****”代表P＜0.0001。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度AR抑制劑恩雜魯胺對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響

為了探索恩雜魯胺最適細(xì)胞培養(yǎng)濃度，分別使用含20、40、60、80 μmol·L-1濃度的恩雜魯胺對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。藥物處理48 h后，在顯微鏡下對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察，由圖1可知，隨著恩雜魯胺濃度的升高，山羊卵泡顆粒細(xì)胞的密度逐漸降低，說(shuō)明在該試驗(yàn)中恩雜魯胺對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。

此外，為了探索不同時(shí)間點(diǎn)條件下恩雜魯胺對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響，還使用CCK8對(duì)上述4個(gè)恩雜魯胺培養(yǎng)濃度條件下的山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了檢測(cè)。由圖2可知，與對(duì)照組相比，不同濃度的恩雜魯胺均能在不同程度上抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。且隨著濃度的提升，細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，特別在80 μmol·L-1濃度條件下，顆粒細(xì)胞的增殖活性最差，這可能是由于DMSO濃度過(guò)高影響了細(xì)胞的增殖。結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察及CCK8檢測(cè)結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)選用40 μmol·L-1的恩雜魯胺細(xì)胞培養(yǎng)濃度對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并在48 h時(shí)收樣。

2.2 EDU檢測(cè)結(jié)果分析

EDU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)替代胸腺嘧啶插入正在復(fù)制的DNA鏈中，通過(guò)使用Apollo熒光染料與結(jié)合到DNA雙鏈上的EDU特異性反應(yīng)，利用免疫熒光技術(shù)能夠檢測(cè)出細(xì)胞的增殖狀況，其相較于CCK8技術(shù)，能夠更直觀的反映出細(xì)胞的增殖活力。由圖3可知，在48 h時(shí)，與空白對(duì)照和DMSO對(duì)照組相比，40 μmol·L-1恩雜魯胺處理?xiàng)l件下山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力被顯著抑制（P＜0.01），表明AR活性能夠影響山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖能力。

2.3 山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)分析

細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的基因表達(dá)調(diào)控，研究測(cè)定了40 μmol·L-1恩雜魯胺培養(yǎng)液對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞部分增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響。如圖4A所示，與空白對(duì)照和DMSO對(duì)照組相比，恩雜魯胺處理顯著降低了山羊卵泡顆粒細(xì)胞中MKI67 （P＜0.01）、CCND1 （P＜0.01）和PCNA （P＜0.01）基因mRNA水平。蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4B），恩雜魯胺能夠顯著抑制PCNA （P＜0.01）和CCND1 （P＜0.05）蛋白的表達(dá)。WNT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要功能，β-catenin作為WNT經(jīng)典信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，能夠通過(guò)影響下游TCF/LEF家族基因的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖［16-18］。因此，研究對(duì)β-catenin的蛋白水平變化進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，與空白對(duì)照和DMSO對(duì)照組相比，40 μmol·L-1恩雜魯胺處理組的β-catenin蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，AR活性被抑制后，細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯會(huì)被抑制，從而使顆粒細(xì)胞的增殖受到影響。

2.4 恩雜魯胺促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

了解卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控對(duì)于理解卵泡發(fā)育具有重要意義［19］。本研究使用了活細(xì)胞Caspase3活性與Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒來(lái)探究AR抑制劑對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響。由圖5可知，與空白對(duì)照和DMSO處理組相比，恩雜魯胺處理組的山羊卵泡顆粒細(xì)胞擁有較多的綠色熒光與紅色熒光，Caspase3活化比率顯著上升（P＜0.05），表明AR抑制劑恩雜魯胺能夠誘導(dǎo)山羊卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)分析

使用qRT-PCR探究恩雜魯胺對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因BAX、BCL2和CASP3基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖6A所示，與空白對(duì)照相比，恩雜魯胺處能夠顯著提高BAX（P＜0.01）基因的mRNA水平，并降低BCL2（P＜0.01）基因的mRNA表達(dá)；而與DMSO對(duì)照相比，恩雜魯胺能夠同時(shí)提高BAX （P＜0.01）和BCL2（P＜0.01）基因的mRNA表達(dá)水平；此外，結(jié)果顯示，CASP3基因的mRNA水平在3組間無(wú)顯著差異。研究還對(duì)BAX和BCL2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)（圖6B），發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，DMSO和恩雜魯胺處理?xiàng)l件下BCL2蛋白表達(dá)均顯著下降，但與DMSO處理組相比，恩雜魯胺處理對(duì)BCL2蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響，表明，DMSO的存在可能能夠影響B(tài)CL2蛋白的表達(dá)。BAX蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，BAX蛋白的表達(dá)在3組間差異不顯著。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，40μmol·L-1的恩雜魯胺培養(yǎng)液并不顯著影響山羊卵泡顆粒細(xì)胞中BAX和BCL2蛋白表達(dá)。

3 討 論

卵泡的發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，顆粒細(xì)胞在不斷的增殖分化與凋亡，從而響應(yīng)卵泡的發(fā)育，顆粒細(xì)胞的增殖凋亡受到眾多基因的調(diào)控［20-22］。研究發(fā)現(xiàn)，AR的表達(dá)貫穿卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，但在小卵泡中表達(dá)量高，在大卵泡中表達(dá)量較低。此外，異常的AR活性可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙和多囊卵巢的形成［23］。因此，這些研究表明，AR可能參與卵泡發(fā)育的調(diào)控，且在其中發(fā)揮重要作用。

AR在動(dòng)物的生理活動(dòng)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在雄性動(dòng)物中，AR能夠調(diào)節(jié)精子的生成、睪丸功能的維持以及調(diào)控骨骼肌肉的發(fā)育等［24-26］；在雌性動(dòng)物中，AR參與調(diào)控卵泡發(fā)育和排卵過(guò)程，還在子宮內(nèi)膜和子宮平滑肌中發(fā)揮作用，并參與調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、子宮收縮和妊娠等重要生理過(guò)程［27-29］。AR的功能發(fā)揮依賴于雄激素的存在，作為類固醇受體，其通過(guò)與雄激素結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與受體形成復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物進(jìn)一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而影響細(xì)胞的功能和表型［30-31］。恩雜魯胺是一種AR抑制劑，其能夠阻斷雄激素與AR的結(jié)合，抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性并促進(jìn)AR的降解。在這項(xiàng)研究中，利用恩雜魯胺抑制卵泡顆粒細(xì)胞中的AR的活性后，CCK8和EDU結(jié)果顯示卵泡顆粒細(xì)胞的增殖活性被抑制，表明AR能夠參與調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞的增殖活性。MKI67是一種標(biāo)志細(xì)胞增殖的核蛋白，高M(jìn)KI67表達(dá)通常表示細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，而低MKI67表達(dá)則可能表示細(xì)胞停止或減緩增殖［32］。抑制AR活性后，細(xì)胞增殖相關(guān)基因MKI67的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，表明細(xì)胞的增殖狀態(tài)受到抑制，這與EDU和CCK8的檢測(cè)結(jié)果是一致的。說(shuō)明顆粒細(xì)胞中AR的活性能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖活性。

細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期的調(diào)控。研究表明，細(xì)胞周期進(jìn)程由一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中PCNA在細(xì)胞周期中起到了重要的調(diào)控作用［33］。PCNA是DNA聚合酶δ和ε的輔助因子，在S期DNA復(fù)制過(guò)程中，PCNA結(jié)合到DNA鏈上形成一個(gè)滑動(dòng)夾持結(jié)構(gòu)，促進(jìn)DNA聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合并提高其活性［34-35］。此外，PCNA還能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶、細(xì)胞周期抑制蛋白等蛋白相相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程［36-37］。本研究發(fā)現(xiàn)抑制AR活性能夠降低PCNA和CCND1基因的表達(dá)，說(shuō)明AR能夠調(diào)節(jié)PCNA和CCND1基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而參與調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖。細(xì)胞的增殖還受到多條信號(hào)通路的調(diào)控，其中WNT信號(hào)通路在卵泡發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色，抑制WNT信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良，早期閉鎖卵泡增多，同時(shí)還會(huì)造成卵母細(xì)胞分化異常，影響卵泡質(zhì)量［38-40］。β-catenin是經(jīng)典WNT信號(hào)通路的中心蛋白，當(dāng)WNT信號(hào)被激活時(shí)，β-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，促進(jìn)CCND1、c-MYC等基因的表達(dá)從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，調(diào)控卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育［41］。使用恩雜魯胺抑制AR活性后，山羊卵泡顆粒細(xì)胞中的β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，表明AR可能參與經(jīng)典WNT信號(hào)通路的調(diào)控，但具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

卵泡發(fā)育的過(guò)程中常常伴隨著顆粒細(xì)胞的凋亡，適度的顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)于優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)以及生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)具有積極作用，但凋亡過(guò)多或凋亡缺失都可能會(huì)對(duì)卵泡發(fā)育產(chǎn)生不利影響［42-43］。因此，維持適度的顆粒細(xì)胞凋亡水平是卵泡發(fā)育正常進(jìn)行的關(guān)鍵之一。研究表明，AR在細(xì)胞的生存和死亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Huang等［44］發(fā)現(xiàn)沉默AR的表達(dá)能夠促進(jìn)腎缺血再灌注模型小鼠的腎臟Caspase 3的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而Lin等［45］研究表明AR能夠通過(guò)PIRH2-p53-p21促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。因此，AR對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)受到細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞外刺激影響。在我們的研究中，恩雜魯胺抑制AR活性后，山羊卵泡顆粒細(xì)胞中Caspase 3蛋白活性增加，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻變多，細(xì)胞凋亡比率升高，表明恩雜魯胺抑制AR活性后能夠促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。但AR對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控似乎并不依賴于BCL2家族成員介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑，這是因?yàn)橐种艫R活性后雖然上調(diào)了BAX和BCL2的mRNA水平，但并沒(méi)有改變BAX和BCL2蛋白的表達(dá)。因此，AR可能通過(guò)死亡受體凋亡途徑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑調(diào)控山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞中AR的活性能夠影響β-catenin、PCNA、CCND1和Caspase 3等基因的表達(dá)從而抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ ZHANG T J，BASANG W D，CHANG W H，et al.Dynamics of apoptosis-related gene expression during follicular development in yak［J］.J Anim Physiol Anim Nutr （Berl），2021，105（6）：1002-1013.

［2］ KUMARIYA S，UBBA V，JHA R K，et al.Autophagy in ovary and polycystic ovary syndrome：role，dispute and future perspective［J］.Autophagy，2021，17（10）：2706-2733.

［3］ 劉 杰，許香萍，鄧 銘，等.miR-144-5p靶向WNT5a對(duì)山羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（6）： 2421-2435.

LIU J，XU X P，DENG M，et al.Effect of miR-144-5p targeting WNT5a on the proliferation and apoptosis of goat ovarian granulosa cells［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（6）：2421-2435.（in Chinese）

［4］ TELFER E E，GROSBOIS J，ODEY Y L，et al.Making a good egg：human oocyte health，aging，and in vitro development［J］.Physiol Rev，2023，103（4）：2623-2677.

［5］ LI H，HUANG X，CHANG X W，et al.S100-A9 protein in exosomes derived from follicular fluid promotes inflammation via activation of NF-κB pathway in polycystic ovary syndrome［J］.J Cell Mol Med，2020，24（1）：114-125.

［6］ CLARKE H.Control of mammalian oocyte development by interactions with the maternal follicular environment［M］//KLOC M.Oocytes：Maternal Information and Functions.Cham：Springer，2017：17-41.

［7］ DUFFY D M，KO C，JO M，et al.Ovulation：parallels with inflammatory processes［J］.Endocr Rev，2019，40（2）：369-416.

［8］ DU X，LI Q Q，YANG L，et al.SMAD4 activates Wnt signaling pathway to inhibit granulosa cell apoptosis［J］.Cell Death Dis，2020，11（5）：373.

［9］ 李碧筠，黃思藝，王鈺錕，等.SMAD7對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，53（8）： 2548-2557.

LI B J，HUANG S Y，WANG Y K，et al.Effects of SMAD7 on proliferation and apoptosis of goat follicular granulosa cells［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2022，53（8）：2548-2557.（in Chinese）

［10］ WASMUTH E V，BROECK A V，LACLAIR J R，et al.Allosteric interactions prime androgen receptor dimerization and activation［J］.Mol Cell，2022，82（11）：2021-2031.e5.

［11］ ASTAPOVA O，MINOR B M N，HAMMES S R.Physiological and pathological androgen actions in the ovary［J］. Endocrinology，2019，160（5）：1166-1174.

［12］ BURGER H G.Androgen production in women［J］.Fertil Steril，2002，77 Suppl 4：S3-S5.

［13］ PRIZANT H，GLEICHER N，SEN A.Androgen actions in the ovary：balance is key［J］.J Endocrinol，2014，222（3）： R141-R151.

［14］ DU X，LI Q Q，PAN Z X，et al.Androgen receptor and miRNA-126* axis controls follicle-stimulating hormone receptor expression in porcine ovarian granulosa cells［J］.Reproduction，2016，152（2）：161-169.

［15］ STERNBERG C N.Enzalutamide，an oral androgen receptor inhibitor for treatment of castration-resistant prostate cancer［J］.Future Oncol，2019，15（13）：1437-1457.

［16］ KATOH M，KATOH M.WNT signaling and cancer stemness［J］.Essays Biochem，2022，66（4）：319-331.

［17］ COLOZZA G，KOO B K.Wnt/β-catenin signaling：structure，assembly and endocytosis of the signalosome［J］.Dev Growth Differ，2021，63（3）：199-218.

［18］ MUKHERJEE S，LUEDEKE D M，MCCOY L，et al.SOX transcription factors direct TCF-independent WNT/β-catenin responsive transcription to govern cell fate in human pluripotent stem cells［J］.Cell Rep，2022，40（8）： 111247.

［19］ GAO Y，CHEN J，JI R，et al.USP25 regulates the proliferation and apoptosis of ovarian granulosa cells in polycystic ovary syndrome by modulating the PI3K/AKT pathway via deubiquitinating PTEN［J］.Front Cell Dev Biol，2021，9： 779718.

［20］ LI H Y，WANG X F，MU H B，et al.Mir-484 contributes to diminished ovarian reserve by regulating granulosa cell function via YAP1-mediated mitochondrial function and apoptosis［J］.Int J Biol Sci，2022，18（3）：1008-1021.

［21］ XING J S，QIAO G，LUO X，et al.Ferredoxin 1 regulates granulosa cell apoptosis and autophagy in polycystic ovary syndrome［J］.Clin Sci （Lond），2023，137（6）：453-468.

［22］ WEI X L，ZHENG L P，TIAN Y P，et al.Tyrosine phosphatase SHP2 in ovarian granulosa cells balances follicular development by inhibiting PI3K/AKT signaling［J］.J Mol Cell Biol，2022，14（7）：mjac048.

［23］ RODRIGUEZ PARIS V，BERTOLDO M J.The mechanism of androgen actions in PCOS etiology［J］.Med Sci （Basel），2019，7（9）：89.

［24］ CHRISTIN-MAITRE S，YOUNG J.Androgens and spermatogenesis［J］.Ann Endocrinol （Paris），2022，83（3）： 155-158.

［25］ WALKER W H.Androgen actions in the testis and the regulation of spermatogenesis［M］//CHENG C Y，SUN F.Molecular Mechanisms in Spermatogenesis.Cham：Springer，2021：175-203.

［26］ MARCHIORETTI C，ZANETTI G，PIRAZZINI M，et al.Defective excitation-contraction coupling and mitochondrial respiration precede mitochondrial Ca2+ accumulation in spinobulbar muscular atrophy skeletal muscle［J］. Nat Commun，2023，14（1）：602.

［27］ YU K，HUANG Z Y，XU X L，et al.Estrogen receptor function：impact on the human endometrium［J］.Front Endocrinol （Lausanne），2022，13：827724.

［28］ WALTERS K A，SIMANAINEN U，HANDELSMAN D J.Molecular insights into androgen actions in male and female reproductive function from androgen receptor knockout models［J］.Hum Reprod Update，2010，16（5）：543-558.

［29］ ZHANG Y H，HU M，YANG F，et al.Increased uterine androgen receptor protein abundance results in implantation and mitochondrial defects in pregnant rats with hyperandrogenism and insulin resistance［J］.J Mol Med （Berl），2021， 99（10）：1427-1446.

［30］ JAMROZE A，CHATTA G，TANG D G.Androgen receptor （AR） heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance［J］.Cancer Lett，2021，518：1-9.

［31］ AHMAD I，NEWELL-FUGATE A E.Role of androgens and androgen receptor in control of mitochondrial function［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2022，323（3）：C835-C846.

［32］ ZHANG A L，WANG X J，F(xiàn)AN C F，et al.The role of Ki67 in evaluating neoadjuvant endocrine therapy of hormone receptor-positive breast cancer［J］.Front Endocrinol （Lausanne），2021，12：687244.

［33］ ARBEL M，CHOUDHARY K，TFILIN O，et al.PCNA loaders and unloaders-one ring that rules them all［J］.Genes （Basel），2021，12（11）：1812.

［34］ GONZLEZ-MAGAA A，BLANCO F J.Human PCNA structure，function and interactions［J］.Biomolecules， 2020，10（4）：570.

［35］ ACHARYA N，PATEL S K，SAHU S R，et al.‘PIPs’ in DNA polymerase：PCNA interaction affairs［J］.Biochem Soc Trans， 2020，48（6）：2811-2822.

［36］ MANSILLA S F，DE LA VEGA M B，CALZETTA N L，et al.CDK-independent and PCNA-dependent functions of p21 in DNA replication［J］.Genes （Basel），2020，11（6）：593.

［37］ SHENG C B，MENDLER I H，RIEKE S，et al.PCNA-mediated degradation of p21 coordinates the DNA damage response and cell cycle regulation in individual cells［J］.Cell Rep，2019，27（1）：48-58.e7.

［38］ LI L Y，SHI X J，SHI Y，et al.The signaling pathways involved in ovarian follicle development［J］.Front Physiol，2021， 12：730196.

［39］ ABEDINI A，ZAMBERLAM G，LAPOINTE E，et al.WNT5a is required for normal ovarian follicle development and antagonizes gonadotropin responsiveness in granulosa cells by suppressing canonical WNT signaling［J］.FASEB J，2016，30（4）：1534-1547.

［40］ 王 鵬，韓海銀，李文韜，等.可變剪接體WNT4-β對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖和激素分泌的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，53（10）：3480-3489.

WANG P，HAN H Y，LI W T，et al.Effect of alternative splicing WNT4-β on follicular granulosa cell proliferation and hormone secretion in goats［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2022，53（10）：3480-3489.（in Chinese）.

［41］ WANG W W，TENG J，HAN X，et al.miR-458b-5p regulates ovarian granulosa cells proliferation through Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting catenin beta-1［J］.Anim Biosci，2021，34（6）：957-966.

［42］ MANABE N，GOTO Y，MATSUDA-MINEHATA F，et al.Regulation mechanism of selective atresia in porcine follicles：regulation of granulosa cell apoptosis during atresia［J］.J Reprod Dev，2004，50（5）：493-514.

［43］ ZHONG L L，LUO Y，ZHOU F，et al.The effects of natural products and bioactive ingredients of traditional Chinese medicine on apoptosis of ovarian granulosa cells［J］.J Appl Toxicol，2023，43（6）：772-788.

［44］ HUANG G M，YAO Q，YE Z F，et al.Gender differential expression of AR/miR-21 signaling axis and its protective effect on renal ischemia-reperfusion injury［J］.Front Cell Dev Biol，2022，10：861327.

［45］ LIN Y T，LU Z Y，KOKONTIS J，et al.Androgen receptor primes prostate cancer cells to apoptosis through down-regulation of basal p21 expression［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，430（1）：289-293.

（編輯 郭云雁）