殼寡糖的生物學功能及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中應用的研究進展

［摘要］ 殼寡糖（COS） 作為天然多糖殼聚糖（CS） 的降解產(chǎn)物，既保留了CS 的良好生物相容性、無毒和可生物降解等特點，同時由于糖鏈縮短使相對分子質(zhì)量降低，其水溶性和生物活性均得到提高且更容易被生物體吸收利用，近年來受到越來越多的關(guān)注。目前國內(nèi)外學者對CS 生物學功能的研究及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中應用的報道較多，但對COS 功能及其應用的研究報道較少?，F(xiàn)結(jié)合國內(nèi)外最新研究成果，對COS 的主要生物學功能（抗炎、抗腫瘤、抗菌和促組織再生等） 及其可能的作用機制進行總結(jié)和分析，并闡述其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中應用的研究進展，以期為COS 的深入研究及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中更廣泛的應用提供理論依據(jù)和參考。

［關(guān)鍵詞］ 殼寡糖； 殼聚糖； 生物學功能； 生物醫(yī)學應用； 組織再生

［中圖分類號］ R318. 05 ［文獻標志碼］ A

殼寡糖（chitooligosaccharide， COS） 是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的共聚物組成的線性多糖，其聚合度（degree of polymerization，DP） lt;20，平均相對分子質(zhì)量lt;3 900。COS 由殼聚糖（chitosan，CS） 進一步水解獲得，兩者具有相同的結(jié)構(gòu)式，含有多種活性官能團，包括分別位于C-2、C-3 和C-6 位點的氨基/乙酰氨基、仲羥基和伯羥基及連接N-氨基葡萄糖基的β （1-4） 糖苷鍵， 賦予其具有更多的生物活性及其應用的靈活性［1-2］。研究［3-5］ 顯示： CS 及其衍生物在生物醫(yī)藥各個領(lǐng)域得到廣泛應用，如傷口愈合、止血、組織工程和藥物遞送等。在pHgt;5. 5 時，CS 黏度高且水溶性差，在許多方面的應用也受到一定程度的限制［6］。低相對分子質(zhì)量的COS 可完全溶于水， 且黏度低，具備更高的生物活性，更易被生物體吸收利用， 近年來受到越來越多的關(guān)注［7-9］。研究［10-12］表明： COS 具有廣泛的生物活性， 包括抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗糖尿病、免疫調(diào)控、止血和促成骨等，且因其優(yōu)異的理化特性，可通過化學或酶修飾成各種衍生物和形式，如凝膠、微/納米顆粒、纖維、海綿和薄膜等，逐漸在生物醫(yī)學領(lǐng)域得到廣泛的應用?，F(xiàn)就COS 的生物學功能及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應用進行綜述，旨在為 COS 的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 COS 的生物學功能

COS 是人體細胞膜表面糖鏈中最具活力的功能糖，易溶于水和天然帶正電荷的特性使COS 可直接作用于細胞， 調(diào)控多種生物學功能， 包括抗炎、抗菌、抗腫瘤和促組織再生等。

1. 1 抗 炎

COS 可抑制多種細胞的炎癥反應，包括內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，下調(diào)誘導炎癥反應介質(zhì)的表達，如腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor- α， TNF- α）、白細胞介素（interleukin， IL）-6、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2， COX-2） 等［13］。在肥大細胞中，相對分子質(zhì)量1 000～3 000 的COS 可通過抑制絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signalregulatedkinase/extracellular signal-regulated kinase，MEK/ERK） 和p38 激酶的磷酸化水平，進而下調(diào)TNF-α、IL-1β 和IL-4 mRNA 表達水平，抑制由其介導的過敏性炎癥反應［13］ 。細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 能激發(fā)多種類型細胞中促炎細胞因子的產(chǎn)生， 是最常見的炎癥誘導介質(zhì)［14］。COS 可有效阻斷LPS 誘導的血管內(nèi)皮炎癥反應。LIU 等［15-16］ 證實：COS 可通過阻斷p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 和ERK1/2、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt） 信號通路抑制LPS 誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 中 IL-6 和 IL-8 的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。LI 等［17］進一步研究發(fā)現(xiàn)：COS 通過影響O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc transferase，OGT） 介導的O-乙酰葡糖胺糖基化修飾（O-GlcNAcylation） 激發(fā)核因子κB （nuclear factor kappa-B， NF- κB） 活性，進而抑制LPS 誘導的血管內(nèi)皮炎癥反應。研究［18］顯示： COS 還可通過優(yōu)化腸道菌群的多樣性和組成比例，預防和治療結(jié)腸炎，并可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ （peroxisome proliferatoractivatedreceptor γ， PPARγ） 和沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2 同源物1 （silent mating type informationregulation 2 homolog-1， SIRT1） 抑制NF-κB 信號通路激活進而緩解結(jié)腸炎。COS 對LPS 誘導的腸上皮細胞炎癥反應及伴隨的過氧化損傷也具有一定的保護作用， 主要通過下調(diào)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cysteinyl aspartate specificproteinase-3， caspase-3） 及上調(diào)B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2） 表達， 降低LPS 刺激引起的細胞凋亡［19］。研究者［20］ 將COS 包裝在大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose mesenchymal stemcell，AMSCs） 衍生的細胞外囊泡（extracellularvesicles， EVs） 中， 結(jié)果顯示： 負載COS 的EVs（EVs-COS） 可逆轉(zhuǎn)IL-1β 對軟骨細胞活力和遷移的抑制及促凋亡作用，促進軟骨細胞活力和遷移，抑制細胞凋亡，調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原α1 （collagen type Ⅰalpha 1，COL1A1）、Ⅱ型膠原α1 （collagen type Ⅱalpha 1，COL2A1）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、腫瘤抑制蛋白p53、Bcl-2 和PI3K/Akt 通路， 促進軟骨損傷修復，對骨關(guān)節(jié)炎具有更好的保護作用。

巨噬細胞是調(diào)節(jié)炎癥反應的重要免疫細胞之一，具有高度可塑性，可隨局部環(huán)境產(chǎn)生不同功能表型，在各種疾病的研究領(lǐng)域越來越受到關(guān)注。在干擾素γ （interferon- γ， IFN- γ） 和LPS 的誘導下巨噬細胞極化為促炎型M1 表型巨噬細胞，通過分泌大量炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β 和趨化因子參與炎癥反應［21］。而在抗炎細胞因子IL-4 的誘導下，轉(zhuǎn)化為抗炎型M2 表型巨噬細胞，通過分泌抗炎因子、生長因子和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor， PDGF） 等發(fā)揮抗炎作用，并通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)沉積和血管生成等參與組織修復過程［22］。研究［10］ 顯示：COS 誘導的炎癥反應類似于IL-4 激發(fā)的細胞生物學行為。4 mg·L-1 COS 即可促進RAW264. 7 巨噬細胞抗炎因子IL-10 的分泌， 降低促炎因子TNF-α 的分泌，同時上調(diào)巨噬細胞表面標志物CD206 的表達， 下調(diào)CD80 表達。COS 可選擇性地促使巨噬細胞向抗炎型M2 表型極化。當組織損傷后，在早期的炎癥反應階段，巨噬細胞通過分泌一系列趨化因子和細胞因子等募集多種細胞，刺激創(chuàng)面的愈合，但持續(xù)的炎癥反應不利于組織修復。研究［10］ 顯示： 在LPS 刺激下， 經(jīng) COS 預處理后的巨噬細胞中 IL-6和 TNF-α 基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平并未上調(diào)。 p38MAPK、ERK1/2、JNK、PI3K 和Akt 的磷酸化水平也得到一定程度的恢復。COS 通過下調(diào)MAPK和PI3K/Akt 信號通路中主要相關(guān)因子的磷酸化水平， 阻斷NF-κB 的核內(nèi)移位， 進而抑制LPS 誘導的巨噬細胞的促炎行為。

1. 2 抗 菌

COS 是一種水溶性低分子量CS，含有豐富的氨基基團， 也具有良好的廣譜抗菌活性。其作用機制與CS 的抑菌機制相似，自身帶正電荷的氨基官能團，可以與細菌細胞壁上帶負電荷的成分（如革蘭陰性菌表面的LPS 分子富含帶負電荷的脂質(zhì)A，革蘭陽性菌表面的肽聚糖） 結(jié)合，促進細菌細胞膜的滲透性，破壞細胞膜的完整性，細菌內(nèi)物質(zhì)流失， 從而導致其死亡。其次， COS還可以離子鍵的形式影響營養(yǎng)物質(zhì)向革蘭陰性菌胞內(nèi)的運輸［23］。另外，COS 作為短鏈線性氨基多糖，可通過其滲透到細胞內(nèi)，吸附到細菌DNA 中，阻止基因轉(zhuǎn)錄，從而達到抗菌作用［24］。

1. 3 抗腫瘤

癌癥發(fā)展快和致死率高等特點是全球面臨的有待快速解決的難題。目前，除手術(shù)切除外，常用的抗癌藥物包括化療藥物、分子靶向藥物和免疫制劑［25］。COS 是一種具備多種官能團和生物活性的天然產(chǎn)物，許多研究者通過體內(nèi)外的抗腫瘤研究探討其抗腫瘤活性，并探討其抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等細胞行為的機制。

帶正電荷的COS 與正常細胞內(nèi)的正電荷相似，而腫瘤細胞表面較正常細胞具有更多的負電荷，故COS 易選擇性地靶向腫瘤細胞而不是正常細胞。通過改變細胞膜的離子通道，使細胞通透性增加，發(fā)揮抑制腫瘤細胞活性的功能［26］。體外研究［27］ 表明： 在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段， COS 通過調(diào)節(jié)NF-κB 活性和COX-2 表達進而增強腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）活性和抗氧化酶表達，發(fā)揮抗癌作用。在結(jié)直腸癌小鼠模型中，口服 COS （500 mg·kg-1·d-1） 可抑制腫瘤的生長和形成。COS 可通過激活AMPK 抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin， mTOR） 信號通路和NF- κB 介導的炎癥信號通路，影響腫瘤細胞的增殖?；|(zhì)金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 參與結(jié)直腸癌的晚期發(fā)展，COS 通過抑制MMP-9 的表達延緩癌癥的進展， 抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移行為。體內(nèi)外研究［11］ 證實：COS 可明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移， 通過p53/mTOR 信號通路誘導腫瘤細胞的自噬及凋亡，可有效抑制體內(nèi)骨肉瘤模型的生長和轉(zhuǎn)移。COS 還具有提高腫瘤細胞對化療藥物順鉑敏感性的作用，故COS 有望成為治療骨肉瘤新的潛在藥物制劑或載藥體系。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫系統(tǒng)之間的相互作用受復雜的生物學網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。繼手術(shù)、放療、化療和靶向治療之后，免疫治療逐漸成為抗腫瘤最具希望的治療策略之一。免疫檢查點療法是一類通過調(diào)節(jié)T 細胞活性提高抗腫瘤免疫反應的治療方法，近年來成為腫瘤免疫治療研究的熱點。程序性死亡受體1（programmed death receptor-1， PD-1） 是繼細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白4 （cytotoxic T-lymphocyteassociatedprotein 4，CTLA-4） 之后發(fā)現(xiàn)的新的免疫檢查點分子，在惡性腫瘤的治療中取得很好的效果。但常規(guī)化療后，幾乎所有類型的腫瘤中程序性死亡配體1 （programmed death ligand 1， PD-L1）表達均明顯增加，導致T 淋巴細胞介導的免疫殺傷效果降低。研究［28］ 顯示：COS 可通過激活AMPK抑制IFN-γ 誘導的PD-L1 表達上調(diào)，也可通過抑制NF- κB 和信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子1 （signaltransducers and activators of transcription， STAT1）信號通路，下調(diào)腫瘤細胞表面PD-L1 的表達水平，從而使腫瘤中浸潤的T 淋巴細胞發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫反應。

COS 具有良好的抗腫瘤作用， 同時也可協(xié)同腫瘤的化療或免疫治療，達到更好的抗腫瘤效果，作為天然抗腫瘤藥物或者合成載藥體系，可應用于抗腫瘤治療中。

1. 4 促組織再生

COS含有多種反應官能團，使其具有促組織再生修復的活性，尤其是在促傷口愈合和促成骨方面。COS 對骨組織缺損的修復作用主要與其促成骨前體細胞增殖、分化和促進細胞活性因子分泌等有關(guān)。通過溶液澆鑄法制備COS、CS 和膠原膜， 結(jié)果證實： COS 薄膜較CS 薄膜更親水， 更易于大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞（adiposederivedstem cells， ADSCs） 和骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs） 的增殖和鋪展，且具有更好的骨傳導性能。另外，COS 中的酯基、羰基和氨基可作為羥基磷灰石晶體的成核位點，有利于鈣沉積［29］。在傷口愈合方面，因COS 的完全水溶性和抗菌作用，使其具有保護損傷組織不受感染、增強通透性、利于細胞黏附和促進細胞增殖等生物活性，在組織損傷和傷口愈合方面顯示出潛在的治療作用［30］。COS 能夠通過激活TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路， 提高TGF-β 的表達水平， 促進膠原蛋白的合成及成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移，進而加快傷口的愈合速度［9］。研究［30］ 證實：相對分子質(zhì)量為1 000～3 000 的COS 在皮膚組織工程中具有很好的應用前景。

COS 作為CS 的重要降解產(chǎn)物，對多種疾病具有潛在的治療作用，尤其在炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面。經(jīng)典活化的M1 表型巨噬細胞滲透到創(chuàng)面部位可促進炎癥反應，刺激創(chuàng)面愈合過程，而選擇性活化的M2 表型巨噬細胞可促進免疫調(diào)控進而影響組織修復和重塑。研究［31］ 顯示：巨噬細胞通過分泌細胞因子對骨修復部位的微環(huán)境產(chǎn)生影響，細胞因子既可控制炎癥， 又可控制細胞分化， M1 和M2 表型巨噬細胞通過細胞因子的分泌影響骨修復區(qū)微環(huán)境。在感染初期誘導巨噬細胞向促炎M1 型轉(zhuǎn)化可抑制細菌生長和避免感染［32-33］，但長期M1 巨噬細胞的主導作用可能會引起慢性炎癥反應，破壞宿主組織［34］。在正常的組織修復過程中，巨噬細胞經(jīng)過早期短暫的炎癥期后向M2 表型極化， 分泌IL-4、IL-10、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor， VEGF）、骨形成蛋白2 （bonemorphogenetic protein-2， BMP-2） 和轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor-β，TGF-β），促進血管生成和骨再生。COS 可為骨再生提供一個免疫調(diào)節(jié)微環(huán)境， 通過促進BMSCs 的成骨分化和HUVECs 的成血管作用， 促進骨組織的再生和重塑［10］。HUANG 等［35］ 將鍶、鋅和鈣3 種離子和COS 加載到介孔二氧化硅納米顆粒（mesoporoussilica nanoparticles， MSN） 中， 通過微量元素和COS 的協(xié)同作用實現(xiàn)逐級調(diào)控的成骨免疫微環(huán)境，促進骨再生修復。成骨早期，MSN-COS 納米顆粒通過離子釋放激活炎癥細胞，表現(xiàn)出促炎作用；成骨晚期， COS 可促進巨噬細胞抗炎細胞因子的分泌，由促炎向抗炎轉(zhuǎn)變，進一步激活BMSCs 的成骨分化。

COS 的鏈短分子間和分子內(nèi)的氫鍵作用力較弱，因此更多羥基的存在和游離的氨基使其較CS具有更高的抗氧化活性［9］。COS 的抗氧化作用可以保護細胞DNA 免受氧化損傷；有效清除創(chuàng)口炎癥環(huán)境下產(chǎn)生的過量活性氧， 利于傷口愈合［36］。COS 的氨基基團可與帶負電荷的紅細胞表面結(jié)合，促使紅細胞在傷口周圍密集，也可激活血小板在傷口部位黏附和聚集， 發(fā)揮止血功能［37-38］。綜上所述，天然產(chǎn)物COS 在皮膚愈合、骨再生和重塑等組織修復方面具有潛在作用。

2 COS 在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用

COS 的水溶性、先天的生物相容性和多樣的理化性能使其在生物醫(yī)藥功能性材料領(lǐng)域得到廣泛應用，包括藥物載體（微/納米顆粒）、水凝膠、納米纖維膜和海綿等多種形式。

2. 1 COS在載藥微/納米顆粒制備中的應用

含有豐富氨基、羧基和羥基的COS 可被疏水性小分子化合物修飾，形成兩親性聚合物，在水中通過自組裝的形式合成聚合物納米顆粒。通過超聲自組裝合成的兩親性油酸接枝的COS 納米顆粒無細胞毒性，易被細胞攝?。浑S后，通過自組裝合成兩親性全反式維甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）-COS 納米顆粒，改善ATRA 臨床應用中面臨的水溶性差、理化不穩(wěn)定、血藥濃度低和潛在副作用的局限性， 并通過透析法將紫杉醇（paclitaxel，PTX） 包封在ATRA-COS 納米顆粒中，成功解決ATRA 與疏水性藥物合用時易發(fā)生聚集和沉淀的問題， 避免對各自的藥物活性和安全性的影響。COS 納米顆?？赏ㄟ^內(nèi)吞作用被HepG2 細胞快速連續(xù)吸收，并轉(zhuǎn)運到細胞核中。ATRA-COS 納米顆粒作為藥物載體用于ATRA 和PTX 或其他疏水性治療劑的共同遞送具有一定的潛力，為多藥物的聯(lián)合化療提供新的策略［38］。

聚乳酸- 羥基乙酸共聚物［poly （lactic-coglycolicacid）， PLGA］ 納米顆?？捎糜诎b小分子藥物和生物大分子，以提高其效果和防止降解。但未經(jīng)修飾的PLGA 納米顆粒通常帶負電荷，與機體細胞缺乏特異性結(jié)合［39］。為克服上述限制， 有研究者［40］ 采用COS 修飾PLGA 納米顆粒負載奧希替尼（osimertinib， AZD9291） 用于肺癌的治療，通過COS 的氨基使納米顆粒帶正電荷。因此，表面帶正電荷的納米顆?？赏ㄟ^靜電相互作用與帶負電荷的腫瘤細胞膜具有較高的親和性，促進細胞攝取。低相對分子質(zhì)量COS 作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，可激活免疫細胞，減少免疫逃逸，提高免疫細胞對腫瘤細胞的識別能力， 抑制免疫檢查點PD-L1 的表達。因此， COS 特有的理化特性及自身抗腫瘤和免疫調(diào)控等多種生物學功能優(yōu)勢，也使得多功能化載藥納米粒的構(gòu)建成為可能。

基于小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA） 的療法為腫瘤的治療提供了新的策略，但siRNA 的大小、電荷和親水性導致組織穿透、細胞攝取、內(nèi)體逃逸及體循環(huán)面臨重大挑戰(zhàn)，其在藥物應用中仍然存在局限性［41］。為使siRNA 更精準地靶向腫瘤細胞，保留其生物活性。有研究者［42］ 用COS 修飾的PLGA 納米顆粒封裝siRNA，證實其能被4 種宮頸癌細胞（SiHa、CaSki、HeLa 和c33a 細胞） 體外攝取，有效發(fā)揮基因沉默活性。LIU 等［43］首次合成了苯硼酸（phenylboronic acid，PBA） 修飾的COS 納米顆粒， 負載靶向存活素（survivin）基因的siRNA 用于小鼠抗黑色素瘤的治療。PBA修飾的COS 通過陽離子COS 與陰離子siRNA 之間的靜電絡(luò)合以及PBA 基團與siRNA 3'端的游離核糖之間發(fā)生化學偶聯(lián)，實現(xiàn)應用更小的顆粒尺寸和更穩(wěn)定的納米顆粒高效遞送siRNA。此外，所形成的化學鍵是可逆的，其在中性或堿性環(huán)境下穩(wěn)定，但對酸性敏感，共價鍵在酸性條件下會發(fā)生斷裂。因此，siRNA 的快速釋放可以響應酸性核內(nèi)體、溶酶體和腫瘤細胞。

COS 的親水性、無毒性、帶正電荷和易吸收等特性，可自身或聯(lián)合其他聚合物構(gòu)建穩(wěn)定的載藥納米體系，負載多種類型的藥物、生物分子或基因等，維持其活性，實現(xiàn)藥物的靶向治療，為藥物的高效安全利用提供新的策略。

2. 2 COS在傷口敷料制備中的應用

COS具有抗菌、抗氧化和促進傷口愈合等生物學功能， 負載COS 或由COS 合成的傷口敷料具有保護損傷組織不受感染、支持細胞黏附和促進細胞增殖等生物活性，在組織損傷和傷口愈合方面顯示出潛在的治療作用。除生物活性外， COS 的親水性和天然帶正電荷等含豐富官能團的理化特性，使傷口敷料具有良好的吸水率、柔韌性和機械強度，利于促進傷口愈合［44-45］。目前，已有研究［44］ 報道：由COS 參與合成的多種形式的敷料，如纖維、海綿、水凝膠和薄膜等已在傷口愈合中應用。COS 相對分子質(zhì)量低， 不具有成膜性， 難以直接制備成生物材料，但其理化性能可使其與其他聚合物結(jié)合，制備成所需的生物材料形式，同時發(fā)揮其生物學功能，賦予材料更多的功能性。有研究者［46］ 通過多巴胺的自聚合，將COS 有效地固定在聚氨酯（polyurethane，PU） 膜表面，改善聚氨酯的親水性、抗菌活性和細胞相容性。COS 改性后PU 膜的抗菌活性明顯提高， 聚多巴胺（polydopamine，PDA） 和COS 形成的較粗糙的表面使PU 膜具有更高的表面能和更好的親水性，更有利于NIH-3T3 細胞的附著和增殖， 加速傷口愈合。ZHOU 等［45］ 通過將COS 加入到甲酸/乙酸溶劑溶解的聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL） 電紡液中， 利用電紡技術(shù)制備成納米纖維膜。COS 中氨基的存在提高了樣品溶液的電導率，易得到表面光滑、無串珠的納米纖維。COS 的親水性能夠明顯增加電紡膜的表面潤濕性，有利于傷口愈合。LI等［47］用COS 修飾銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNP），與聚乙烯醇［poly （vinyl alcohol），PVA］混合制備PVA/COS-AgNP 復合電紡納米纖維膜，體內(nèi)研究證實：其在加速傷口閉合與重建中表現(xiàn)出強力誘導作用，能夠明顯促進膠原合成，其作用機制是COS 激活TGFβ1/Smad 通路相關(guān)基因mRNA表達水平及上調(diào)TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白（collagentype Ⅰ， COL-Ⅰ）、 Ⅲ 型膠原蛋白（collagentype Ⅲ，COL-Ⅲ）、p-Smad2 和p-Smad3 等關(guān)鍵蛋白表達水平， 明顯提高創(chuàng)面的前期愈合效果。因COS 具有游離氨基， 表現(xiàn)出聚陽離子行為， 因此具有與聚陰離子絡(luò)合劑（如DNA、海藻酸鈣及透明質(zhì)酸）、帶負電荷的細胞和組織膜結(jié)合的能力。YIN 等［48］ 證明：將帶正電荷的COS 滲入到帶負電荷的細菌纖維素（bacterial cellulose， BC） 基質(zhì)中可通過依靠靜電相互作用附著在BC 支架內(nèi)部，以提高膜的吸水能力并賦予其良好的抗氧化活性，尤其是清除2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸［2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS］ 自由基的活性，表明BC-COS 復合膜是一種很有前途的傷口敷料。PCL 為疏水性聚合物且無官能團，而COS 為親水性多糖，兩者不能混溶。為實現(xiàn)兩者的結(jié)合，HO 等［38］ 通過對PCL 電紡膜進行等離子體處理，使其表面攜帶羥基，從而能夠與COS 的官能團之間形成氫鍵。PCL/COS 復合電紡膜在保持PCL 機械強度的條件下，通過COS 增強膜的抑菌性和止血性能，促進傷口愈合。也有學者［44］ 研究表明：通過使用1-乙基-3- （3-二甲基氨基丙基） 碳酰二亞胺鹽酸鹽/N-羥基丁二酰亞胺［1-ethyl-3- （ 3-dimethylaminopropyl ） carbodiimidehydrochloride/N-hydroxysuccinimid， EDC/NHS］共價交聯(lián)可將COS 添加在魚膠原蛋白（fishcollagen， FC） /PCL 電紡多孔雙層納米纖維膜上用于全層傷口愈合，進一步改善其潤濕性等理化性能和細胞黏附及增殖等生物學活性。

水凝膠的高度互聯(lián)多孔框架結(jié)構(gòu)使其具有良好的吸收液體和較強的保水能力，對濕性傷口具有良好的愈合性能［49］。與 CS 比較， COS 可在生理pH 值范圍內(nèi)溶解，故更適合作為水凝膠的前體［8］。細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM） 由多糖與多種纖維蛋白（包括膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白） 結(jié)合在一起的復雜網(wǎng)絡(luò)，其中糖胺聚糖是主要成分，其可在水性介質(zhì)中溶脹，從而充當各種生物分子（主要是生長因子、激素和其他蛋白質(zhì)） 的儲存庫，調(diào)節(jié)其在ECM 中的轉(zhuǎn)運并根據(jù)需要激發(fā)其釋放。COS 類似于糖胺聚糖［50］，可模擬ECM 的環(huán)境，允許細胞附著和保留生長因子，使得其在組織工程應用中獲得成功。用過氧化氫介導的方法將不同相對分子質(zhì)量的COS 與沒食子酸（gallic acid，GA） 綴合，利用凍融法與PVA合成復合水凝膠。體外實驗［51］ 證實：含有相對分子質(zhì)量5 000～10 000 COS 的GA-COS/PVA 水凝膠具有良好的抗氧化和抗菌作用，是治療痤瘡的理想材料。將醛化的陰離子線性多糖海藻酸鈉（sodium alginate， SA） 與COS 的氨基通過自發(fā)交聯(lián)形成水凝膠， 通過添加氧化鋅納米顆粒（ZnO2nanoparticles，ZnO NPs），可提高復合水凝膠的抑菌效果及機械強度，該水凝膠在大鼠燙傷模型中顯示出促進傷口愈合的作用。

COS 的氨基和羥基中孤對電子的氧原子和氮原子，可通過配位鍵的形式與金屬離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的螯合物。ZHAO 等［52］ 研究顯示：COS 與金屬離子結(jié)合形成絡(luò)合物，COS 的-NH3+基與SA 的-COO- 基靜電作用形成COS/SA 網(wǎng)， 絡(luò)合金屬離子又與SA 螯合形成SA/絡(luò)合金屬離子網(wǎng)絡(luò)等作用形式，最終原位形成二價金屬離子（nIon2+）-COS/SA物理交聯(lián)的雙網(wǎng)絡(luò)凝膠膜，其中添加Zn2+和Sr2+的凝膠膜創(chuàng)面愈合效果最佳。CHANDIKA 等［30］ 將不同相對分子質(zhì)量（1 000～3 000、3 000～ 5 000 和5 000～10 000） COS 通過EDC 與FC 和SA 交聯(lián)，形成能夠更好地模擬皮膚組織物理特性、機械強度、生物特性的FCA/COS 海綿支架， 相對分子質(zhì)量為1 000～3 000 的COS 支架（FCA/COS1）細胞相容性最好。

2. 3 COS 在骨組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域的應用

COS 的促骨再生及血管新生功能使其逐漸被應用到骨組織工程支架中。有研究者［53］ 利用凍干技術(shù)制備單純CS、 明膠（gelatin ， G）、 COS 及G/CS 和G/COS 復合海綿支架，體外實驗顯示：與純明膠和COS 支架比較，G/COS 支架可更有效地促進和加速大鼠MSCs 的附著、增殖和成骨分化，而細胞在單純CS 支架上形態(tài)為圓形，不利于細胞的黏附和增殖。進一步研究［29］ 證明：G/COS 支架在70/30 的混合比例下更有利于促進BMSCs 的成骨分化。THITISET 等［54］ 構(gòu)建了含有G、COS 和脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM） 的復合支架，其具有更強的骨誘導能力，并實現(xiàn)了體內(nèi)大鼠模型的異位新骨的形成。

因COS 富含氨基及自身帶正電荷的特點， 可與多價陰離子和羧基等結(jié)合，在水中通過自組裝的形式合成聚合物納米顆粒，反應條件溫和，將其與肝素在水中自組裝成COS/肝素納米顆粒，通過肝素與基質(zhì)細胞衍生因子1α （stromal cell-derivedfactor-1α，SDF-1α） 和VEGF 中保守的氨基酸序列結(jié)合， 成功負載生物活性因子［55］。該制備方法簡單，具有低成本、可生物降解、可吸收、非細胞毒性和非免疫原性等特點，且其加工過程溫和，在具有生理pH 值的環(huán)境中能夠保持穩(wěn)定，使細胞因子在較長時間內(nèi)保持生物活性，是一種很有前途的組織再生細胞因子傳遞系統(tǒng)。但納米顆粒在體內(nèi)應用時易被體液沖散，局部利用率低。WANG 等［56］ 研究表明：利用靜電作用將帶正電荷的COS/肝素納米顆粒與帶負電荷的G 交聯(lián)來修飾殼聚糖-瓊脂糖-G（chitosan-agarose-G，CAG） 支架，CAG 支架作為COS/肝素納米顆粒的載體，可保護納米顆粒不被體液沖散，實現(xiàn)COS/肝素納米顆粒負載的SDF-1和BMP-2 局部持續(xù)釋放， 通過釋放SDF-1 募集MSCs， BMP-2 促進其成骨， 實現(xiàn)良好的成骨效果。隨著3D 打印個體化支架，生物、化學和物理等響應性支架體系的開展， COS 在骨組織工程領(lǐng)域的應用還有待進一步開發(fā)利用。

3 總結(jié)與展望

COS 因其良好的理化性能及多種生物學功能的特性， 使其逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的新熱點。COS 具有抗炎、組織再生和抗菌等作用， 作為一種完全水溶性的帶正電荷的天然堿性氨基多糖，在多種疾病的治療和組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

王少如參與文獻查閱、論文撰寫和論文修改，羅云綱參與論文審校和論文修改。

[參考文獻]

［1］ XIA W S， LIU P， ZHANG J L， et al. Biologicalactivities of chitosan and chitooligosaccharides［J］. FoodHydrocoll， 2011， 25（2）： 170-179.

［2］ LI Z H， YANG F， YANG R D. Synthesis andcharacterization of chitosan derivatives with dualantibacterialfunctional groups［J］. Int J Biol Macromol，2015， 75： 378-387.

［3］ 章中華， 王 毅， 李永貴， 等. 殼聚糖在生物醫(yī)學應用中的研究進展［J］. 生物醫(yī)學工程研究， 2022， 41（3）：347-352.

［4］ BANO I， ARSHAD M， YASIN T， et al. Chitosan： apotential biopolymer for wound management［J］. Int JBiol Macromol， 2017， 102： 380-383.

［5］ 丁鑫鑫， 周延民， 相星辰， 等. 殼聚糖復合材料在骨組織工程中的研究進展［J］. 華西口腔醫(yī)學雜志， 2018，36（4）： 441-446.

［6］ AUGUSTINE R， REHMAN S R U， AHMED R，et al. Electrospun chitosan membranes containingbioactive and therapeutic agents for enhanced woundhealing［J］. Int J Biol Macromol， 2020， 156： 153-170.

［7］ LEE J Y， TERMSARASAB U， LEE M Y， et al.Chemosensitizing indomethacin-conjugated chitosanoligosaccharide nanoparticles for tumor-targeted drugdelivery［J］. Acta Biomater， 2017， 57： 262-273.

［8］ TABASSUM N， AHMED S， ALI M A.Chitooligosaccharides and their structural-functionaleffect on hydrogels： a review［J］. Carbohydr Polym，2021， 261： 117882.

［9］ JAFARI H， BERNAERTS K V， DODI G， et al.Chitooligosaccharides for wound healing biomaterialsengineering［J］. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2020， 117： 111266.

［10］HUANG X H， CHEN M， WU H M， et al.Macrophage polarization mediated bychitooligosaccharide （COS） and associated osteogenicand angiogenic activities［J］. ACS Biomater Sci Eng，2020， 6（3）： 1614-1629.

［11］PAN Z， CHENG D D， WEI X J， et al.Chitooligosaccharides inhibit tumor progression andinduce autophagy through the activation of the p53/mTOR pathway in osteosarcoma［J］. Carbohydr Polym，2021， 258： 117596.

［12］NIU X L， WEI Y， LIU Q H， et al. Silver-loadedmicrospheres reinforced chitosan scaffolds for skin tissueengineering［J］. Eur Polym J， 2020， 134： 109861.

［13］VO T S， KONG C S， KIM S K. Inhibitory effects ofchitooligosaccharides on degranulation and cytokinegeneration in rat basophilic leukemia RBL-2H3 cells［J］.Carbohydr Polym， 2011， 84（1）： 649-655.

［14］TRAN A X， WHITFIELD C. Lipopolysaccharides（endotoxins）［A］. Encyclopedia of Microbiology［M］.Amsterdam： Elsevier， 2009： 513-528.

［15］LIU H T， LI W M， LI X Y， et al. Chitosanoligosaccharides inhibit the expression of interleukin-6 inlipopolysaccharide-induced human umbilical veinendothelial cells through p38 and ERK1/2 proteinkinases［J］. Basic Clin Pharmacol Toxicol， 2010， 106（5）：362-371.

［16］LIU H T， HUANG P， MA P， et al. Chitosanoligosaccharides suppress LPS-induced IL-8 expressionin human umbilical vein endothelial cells throughblockade of p38 and Akt protein kinases ［J］. ActaPharmacol Sin， 2011， 32（4）： 478-486.

［17］LI Y， LIU H T， XU Q S， et al. Chitosanoligosaccharides block LPS-induced O-GlcNAcylation ofNF- κB and endothelial inflammatory response ［J］.Carbohydr Polym， 2014， 99： 568-578.

［18］GUO C C， ZHANG Y， LING T， et al. Chitosanoligosaccharides alleviate colitis by regulating intestinalmicrobiota and PPARγ/SIRT1-mediated NF- κBpathway［J］. Mar Drugs， 2022， 20（2）： 96.

［19］楊院平. 抗炎天然產(chǎn)物殼寡糖對炎性腸病保護作用的實驗研究［D］. 武漢： 武漢大學， 2015.

［20］LI S L， LIU J， LIU S Y， et al. Chitosanoligosaccharides packaged into rat adipose mesenchymalstem cells-derived extracellular vesicles facilitatingcartilage injury repair and alleviating osteoarthritis［J］.J Nanobiotechnol， 2021， 19（1）： 343.

［21］MARTINEZ F O， GORDON S. The M1 and M2paradigm of macrophage activation： time forreassessment［J］. F1000Prime Rep， 2014， 6： 13.

［22］STEIN M， KESHAV S， HARRIS N， et al. Interleukin 4potently enhances murine macrophage mannose receptoractivity： a marker of alternative immunologicmacrophage activation［J］. J Exp Med， 1992， 176（1）：287-292.

［23］SAHARIAH P， MáSSON M. Antimicrobial chitosanand chitosan derivatives： a review of the structureactivityrelationship［J］. Biomacromolecules， 2017，18（11）： 3846-3868.

［24］YU D W， FENG J Y， YOU H M， et al. Themicrostructure， antibacterial and antitumor activities ofchitosan oligosaccharides and derivatives ［J］. MarDrugs， 2022， 20（1）： 69.

［25］HARVEY A L， EDRADA-EBEL R， QUINN R J.The re-emergence of natural products for drug discoveryin the genomics era［J］. Nat Rev Drug Discov， 2015，14（2）： 111-129.

［26］SALAH R， MICHAUD P， MATI F， et al. Anticanceractivity of chemically prepared shrimp low molecularweight chitin evaluation with the human monocyteleukaemia cell line， THP-1［J］. Int J Biol Macromol，2013， 52： 333-339.

［27］MATTAVEEWONG T， WONGKRASANT P，CHANCHAI S， et al. Chitosan oligosaccharidesuppresses tumor progression in a mouse model of colitisassociatedcolorectal cancer through AMPK activationand suppression of NF- κB and mTOR signaling［J］.Carbohydr Polym， 2016， 145： 30-36.

［28］CHEN J S， ZHOU Z G， ZHENG C J， et al. Chitosanoligosaccharide regulates AMPK and STAT1 pathwayssynergistically to mediate PD-L1 expression for cancerchemoimmunotherapy ［J］. Carbohydr Polym， 2022，277： 118869.

［29］RATANAVARAPORN J， DAMRONGSAKKUL S，KANOKPANONT S， et al. Osteogenic differentiationof bone-marrow-derived stem cells cultured with mixedgelatin and chitooligosaccharide scaffolds ［J］. J BiomaterSci Polym Ed， 2011， 22（8）： 1083-1098.

［30］CHANDIKA P， KO S C， OH G W， et al. Fishcollagen/alginate/chitooligosaccharides integratedscaffold for skin tissue regeneration application［J］. Int JBiol Macromol， 2015， 81： 504-513.

［31］WU J， XIAO Z C， CHEN A Q， et al. Sulfatedzwitterionic poly（sulfobetaine methacrylate） hydrogelspromote complete skin regeneration［J］. Acta Biomater，2018， 71： 293-305.

［32］HUANG Q L， OUYANG Z X， TAN Y N， et al.Activating macrophages for enhanced osteogenic andbactericidal performance by Cu ion release from micro/nano-topographical coating on a titanium substrate［J］.Acta Biomater， 2019， 100： 415-426.

［33］LIU W， LI J H， CHENG M Q， et al. A surfaceengineeredpolyetheretherketone biomaterial implantwith direct and immunoregulatory antibacterial activityagainst methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Biomaterials， 2019， 208： 8-20.

［34］SPILLER K L， NASSIRI S， WITHEREL C E， et al.Sequential delivery of immunomodulatory cytokines tofacilitate the M1-to-M2 transition of macrophages andenhance vascularization of bone scaffolds ［J］.Biomaterials， 2015， 37： 194-207.

［35］HUANG X H， GUO X， QU L T， et al. Gradientregulation of osteo-immune microenvironment bychitooligosaccharide-containing ion-doped mesoporoussilica nanoparticles to accelerate osteogenesis［J］. ApplMater Today， 2021， 23： 101067.

［36］GARCíA M A， DE LA PAZ N， CASTRO C， et al.Effect of molecular weight reduction by gammairradiation on the antioxidant capacity of chitosan fromlobster shells［J］. J Radiat Res Appl Sci， 2015， 8（2）：190-200.

［37］ZHOU X， ZHANG X S， ZHOU J J， et al. Aninvestigation of chitosan and its derivatives on red bloodcell agglutination［J］. RSC Adv， 2017， 7（20）： 12247-12254.

［38］HO T T， DOAN V K， TRAN N M， et al. Fabricationof chitosan oligomer-coated electrospun polycaprolactonemembrane for wound dressing application［J］. Mater SciEng C Mater Biol Appl， 2021， 120： 111724.

［39］EL-HAMMADI M M， DELGADO á V，MELGUIZO C， et al. Folic acid-decorated andPEGylated PLGA nanoparticles for improving the antitumour activity of 5-fluorouracil［J］. Int J Pharm，2017， 516（1/2）： 61-70.

［40］HU X C， CHEN S M， YIN H， et al.Chitooligosaccharides-modified PLGA nanoparticlesenhance the antitumor efficacy of AZD9291（Osimertinib） by promoting apoptosis［J］. Int J BiolMacromol， 2020， 162： 262-272.

［41］SETTEN R L， ROSSI J J， HAN S P. The currentstate and future directions of RNAi-basedtherapeutics［J］. Nat Rev Drug Discov， 2019， 18（6）：421-446.

［42］ZHENG X L， ZHU Y， FEI W D， et al. Redoxresponsiveand electrically neutral PLGA nanoparticlesfor siRNA delivery in human cervical carcinoma cells［J］.J Pharm Innov， 2022， 17（4）： 1392-1404.

［43］LIU X， CHEN L Q， ZHANG Y Y， et al. Enhancinganti-melanoma outcomes in mice using novelchitooligosaccharide nanoparticles loaded withtherapeutic survivin-targeted siRNA［J］. Eur J PharmSci， 2021， 158： 105641.

［44］CHANDIKA P， OH G W， HEO S Y， et al.Electrospun porous bilayer nano-fibrous fish collagen/PCL bio-composite scaffolds with covalently cross-linkedchitooligosaccharides for full-thickness wound-healingapplications［J］. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2021， 121： 111871.

［45］ZHOU L Z， CAI L， RUAN H J， et al. Electrospunchitosan oligosaccharide/polycaprolactone nanofibersloaded with wound-healing compounds of Rutin andQuercetin as antibacterial dressings ［J］. Int J BiolMacromol， 2021， 183： 1145-1154.

［46］LUO C， LIU W J， LUO B H， et al. Antibacterialactivity and cytocompatibility of chitooligosaccharidemodifiedpolyurethane membrane via polydopamineadhesive layer ［J］. Carbohydr Polym， 2017， 156：235-243.

［47］LI C W， WANG Q， LI J， et al. Silver nanoparticles/chitosan oligosaccharide/poly（vinyl alcohol） nanofiberpromotes wound healing by activating TGFβ1/Smadsignaling pathway［J］. Int J Nanomedicine， 2016， 11：373-386.

［48］YIN N， DU R P， ZHAO F K， et al. Characterization ofantibacterial bacterial cellulose composite membranesmodified with chitosan or chitooligosaccharide ［J］.Carbohydr Polym， 2020， 229： 115520.

［49］CHANDIKA P， KIM M S， KHAN F， et al. Woundhealing properties of triple cross-linked poly （vinylalcohol）/methacrylate kappa-carrageenan/chitooligosaccharide hydrogel ［J］. Carbohydr Polym，2021， 269： 118272.

［50］ALIDADI S， ORYAN A， BIGHAM-SADEGH A，et al. Comparative study on the healing potential ofchitosan， polymethylmethacrylate， and demineralizedbone matrix in radial bone defects of rat［J］. CarbohydrPolym， 2017， 166： 236-248.

［51］PARK H H， KO S C， OH G W， et al. Characterizationand biological activity of PVA hydrogel containingchitooligosaccharides conjugated with Gallic acid［J］.Carbohydr Polym， 2018， 198： 197-205.

［52］ZHAO D， SHI C， GUO T T， et al. Multifunctional gelfilms of marine polysaccharides cross-linked with polymetalions for wound healing ［J］. Pharmaceuticals，2022， 15（6）： 750.

［53］RATANAVARAPORN J， KANOKPANONT S，TABATA Y， et al. Modulation of in vitro attachment，proliferation and osteogenic differentiation of rat bonemarrow-derived stem cells using different molecularmass chitosans and their blends with gelatin［J］.J Biomater Sci Polym Ed， 2010， 21（8/9）： 979-996.

［54］THITISET T， DAMRONGSAKKUL S，YODMUANG S， et al. A novel gelatin/chitooligosaccharide/demineralized bone matrixcomposite scaffold and periosteum-derived mesenchymalstem cells for bone tissue engineering［J］. Biomater Res，2021， 25（1）： 19.

［55］WANG B， TAN L， DENG D P， et al. Novel stablecytokine delivery system in physiological pH solution：chitosan oligosaccharide/heparin nanoparticles［J］. Int JNanomed， 2015， 10： 3417-3427.

［56］WANG B， GUO Y W， CHEN X F， et al. Nanoparticlemodifiedchitosan-agarose-gelatin scaffold for sustainedrelease of SDF-1 and BMP-2［J］. Int J Nanomed， 2018，13： 7395-7408.

[基金項目] 吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目（20220204124YY）；中國工程院戰(zhàn)略研究與咨詢項目（JL2023-18）