螺旋通道中穩(wěn)定增強(qiáng)的二次流構(gòu)建及其粒子聚焦研究

關(guān)鍵詞 微流控芯片；慣性微流；螺旋通道；二次流；粒子聚焦

微流控技術(shù)是一種利用微通道操控微尺度流體和粒子的技術(shù)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、生理生化分析、癌細(xì)胞富集與研究以及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1-4]。作為微流控領(lǐng)域的重要分支，慣性微流控技術(shù)具有高通量、簡(jiǎn)單流道結(jié)構(gòu)、無(wú)需特定標(biāo)記和外部能量輔助等優(yōu)點(diǎn)，能夠突破傳統(tǒng)對(duì)微尺度低雷諾數(shù)流動(dòng)的觀念，巧妙利用有限雷諾數(shù)下誘導(dǎo)的微流控慣性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)顆粒和流體的操控[5-8]。目前，慣性微流控技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的聚焦、排列、分選和捕獲等領(lǐng)域，為細(xì)胞分析和檢測(cè)提供了重要的預(yù)處理手段[9-12]。

目前，慣性微流在通道幾何形狀創(chuàng)新方面已取得了重大進(jìn)展，包括直通道、彎曲通道和復(fù)合通道等不同構(gòu)型[13]。其中，螺旋通道因其較長(zhǎng)的通道長(zhǎng)度、合理的空間排列和獨(dú)特的Dean 二次流而備受青睞[6]。然而，由于不同圈數(shù)半徑差異導(dǎo)致的Dean 二次流波動(dòng)，使得開發(fā)一種能夠有效操控粒子/細(xì)胞的螺旋通道變得具有挑戰(zhàn)性[14-15]，目前尚缺乏能夠穩(wěn)定和增強(qiáng)Dean 二次流的有效方法，限制了慣性聚焦中粒子尺寸和操作流量的范圍。此外，在較大尺寸通道中Dean 二次流較弱，導(dǎo)致當(dāng)前的螺旋通道設(shè)計(jì)管道較窄，這不利于提高樣品處理通量，并可能導(dǎo)致通道堵塞[16-18]。因此，在慣性微流體領(lǐng)域，開發(fā)一種能夠穩(wěn)定并加速大尺寸通道中的二次流的新型螺旋微通道非常重要。

在本課題組前期設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu)輔助慣性微流控芯片[19-23]基礎(chǔ)上，本研究對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)，開發(fā)了一種微結(jié)構(gòu)輔助的新型超低高寬比（Aspect ratio（AR）=50 μm/1000 μm）螺旋通道。通過模擬驗(yàn)證，證實(shí)在螺旋管道內(nèi)均勻分布微柱可實(shí)現(xiàn)不同圈數(shù)的二次流加速和穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常螺旋管道相比，本研究設(shè)計(jì)的螺旋管道在不同灌注流速下實(shí)現(xiàn)了粒子的高效聚焦。不同粒徑（7.3 μm 和15.5 μm）的熒光粒子能夠在寬1 mm 的大尺寸螺旋通道芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)聚焦，其聚焦效率分別達(dá)到94%和99%以上。本研究還發(fā)現(xiàn)，粒子聚焦位置距離管道內(nèi)壁約100 μm，遠(yuǎn)大于其它慣性聚焦芯片。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為便攜式分析診斷儀器的開發(fā)提供了新的技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

2X2-2 型真空泵、DHG 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；612 式錫紙（安徽青爾包裝制品有限公司）；JA2003 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；102式定性濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）；KW-4 型勻膠機(jī)（中國(guó)科學(xué)院微電子中心研究部）；LSP04-1A 型注射器泵（蘭格恒流泵有限公司）；CKX41 型倒置熒光顯微鏡、DP72電荷耦合器件照相機(jī)和URFLT50 型汞燈（日本Olympus 公司）。1%熒光微球（上海輝質(zhì)生物公司）；聚二甲基硅氧烷（PDMS， RTV615，美國(guó)Momentive 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶公司）；乙醇（75%，河北康濟(jì)藥械有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慣性微流控芯片的設(shè)計(jì)

本研究中的微流控芯片采用AutoCAD 2018版本軟件設(shè)計(jì)和繪制。此通道是一個(gè)具有超低高寬比的大螺旋通道，在通道內(nèi)側(cè)增加了等序列分布的微柱，每圈具有13個(gè)微柱陣列， 2條微柱之間的夾角為π/7，每個(gè)微柱的具體尺寸見圖1A。芯片設(shè)計(jì)完成后，由深圳美精微光電有限公司制備光掩膜。

1.2.2 慣性微流控芯片的制備

將通過AutoCAD軟件設(shè)計(jì)得到的微流控芯片結(jié)構(gòu)打印到透明的掩膜上，通過光刻膠（SU-8 2025）等制備含有微通道結(jié)構(gòu)的PDMS 芯片模板，再進(jìn)行芯片實(shí)物制備，芯片實(shí)物圖和尺寸如圖1 所示。在所有的粒子聚焦實(shí)驗(yàn)中，將樣品裝入一次性注射器（10 mL）中，使用LSP04-1A 型注射器泵調(diào)節(jié)注射量，以產(chǎn)生連續(xù)的微流。采用Tygon 軟油管（長(zhǎng)25 cm、內(nèi)徑0.42 mm）連接微流體裝置孔口和注射器。每次實(shí)驗(yàn)前，將所有軟管和微流控芯片用紫外光照射1 h， 然后用70%乙醇、超純水和PBS 緩沖溶液依次沖洗。

1.2.3 圖像獲取與分析

圖像獲取均在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行。熒光和相位比較圖像通過配有電荷耦合器件照相機(jī)和汞燈的顯微鏡在恒定參數(shù)下獲得。圖片和數(shù)據(jù)通過Image-Pro?Plus6.0、Origin9 和SPSS12.0 軟件處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 理論與設(shè)計(jì)原理

大尺寸通道的設(shè)計(jì)使得微通道脫模更加容易，避免了復(fù)雜的芯片制作過程和操作繁瑣密集、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)[24]。另外，為減少灌注樣品堵塞并提高灌注通量，本研究設(shè)計(jì)了一種新型超低高寬比螺旋微流控芯片，具備較小的通道高度和較大的通道寬度。螺旋通道內(nèi)壁設(shè)置有均勻排列的微結(jié)構(gòu)，以提升Dean二

次流，進(jìn)而增加迪恩阻力，實(shí)現(xiàn)粒子在大尺寸通道中的穩(wěn)定聚焦效果。如圖2 所示，在慣性微流控的螺旋通道系統(tǒng)中，粒子聚焦來自4 種作用力：剪切誘導(dǎo)升力（F_LS）、壁誘導(dǎo)升力（F_LW）、薩夫曼升力（F_LΩ）和迪恩阻力（F_DD）[25]，其中， F_LS 和F_LW 組成FL。F_LΩ是指當(dāng)顆粒與其周圍的流體之間存在速度差，并且流體的速度梯度垂直于顆粒的運(yùn)動(dòng)方向時(shí)，由于顆粒兩側(cè)的流速不同，會(huì)產(chǎn)生一種由低速指向高速方向的升力[26]。隨著螺旋微通道環(huán)數(shù)增加， F_L 和F_DD促使粒子隨著Dean流動(dòng)，直至接近通道內(nèi)壁附近的平衡線位置[27]。

2.2 二次流CFD模擬

為研究微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)Dean二次流加速和穩(wěn)定化的影響，選取螺旋通道中8個(gè)截面（標(biāo)記為1、2、3、4、5、6、7 和8）（圖2）進(jìn)行二次流強(qiáng)度和圖案的分析。此外，本研究設(shè)計(jì)了一種沒有微結(jié)構(gòu)輔助的常規(guī)螺旋管道作為對(duì)照（與微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道具有相同的通道高度和寬度）。如圖3和4所示，在相同流速2 mL/min 灌注下，傳統(tǒng)螺旋管道和微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道在不同圈數(shù)的總流速（U_x）是一致的，但是傳統(tǒng)螺旋管道產(chǎn)生的Dean 二次流（U_y）由于圈數(shù)半徑（R）不同而表現(xiàn)出不同的強(qiáng)度。由于截面1 所在的管道圈數(shù)R 最小，其U_y 強(qiáng)度最大; 隨著圈數(shù)R 增大，截面（2～8）的U_y 強(qiáng)度逐漸減小。這說明當(dāng)粒子通過傳統(tǒng)螺旋管道的不同圈數(shù)時(shí)， Dean 二次流不斷變化，穩(wěn)定性不高。這種現(xiàn)象不利于芯片內(nèi)粒子的穩(wěn)定聚焦。

盡管微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道中每個(gè)圈數(shù)的R 不同，但是，本研究發(fā)現(xiàn)微結(jié)構(gòu)引起的超大曲率變化在管道內(nèi)起主導(dǎo)作用[18-20]。不論圈數(shù)如何設(shè)置，由微結(jié)構(gòu)引起的曲率變化相同。因此，在微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道中，管道截面（1～8）內(nèi)的Dean 二次流不會(huì)隨著螺旋的圈數(shù)變化而改變。相對(duì)于傳統(tǒng)螺旋管道，微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道中Uy 明顯增強(qiáng)。這種增強(qiáng)有助于粒子更快地進(jìn)行橫向遷移，并迅速達(dá)到平衡位置。如圖5 所示，與傳統(tǒng)螺旋管道中的Dean 二次流相比，微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道中Dean 二次流渦旋中心更加集中并向內(nèi)壁靠攏。這表明在微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋管道中，流速的變化范圍更大。由于流速的差異，粒子更容易被渦旋流捕獲，最終穩(wěn)定地聚焦在靠近管道內(nèi)壁的位置上。綜上，通過在常規(guī)螺旋通道內(nèi)壁引入等序列的微結(jié)構(gòu)，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定增強(qiáng)的Dean 二次流。這種二次流對(duì)Dean 阻力的大小具有顯著影響，對(duì)于粒子的聚焦具有重要意義。

2.3 粒子的聚焦特征

為獲得不同灌注流速下粒子運(yùn)動(dòng)的軌跡，驗(yàn)證具有微柱的螺旋通道是否能夠穩(wěn)定聚焦粒子，將不同尺寸（15.5 和7.3μm）的粒子分別在流速0.25～3.00 mL/min 范圍內(nèi)進(jìn)行灌注。如圖6A 所示，在流速為0.25～0.50 mL/min （De=1.42～2.84）時(shí)，傳統(tǒng)螺旋通道下15.5 μm 粒子無(wú)明顯聚焦，不能達(dá)到預(yù)期的聚焦效果。當(dāng)流速提高到1.00～3.00 mL/min （De=5.69～17.08）時(shí)，粒子有一定聚焦，但聚焦效果較差且不穩(wěn)定。這是因?yàn)镈ean 流太小，無(wú)法提供足夠大的Dean 力將粒子移動(dòng)到聚焦位置。如圖6B 所示，利用本研究設(shè)計(jì)的具有微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋通道， 15.5 μm 粒子在0.50～2.00 mL/min （De=2.84～11.38）的流速范圍內(nèi)展現(xiàn)出良好的單線聚焦軌跡。進(jìn)一步觀察了區(qū)域8 和區(qū)域9 中粒子的聚焦軌跡（圖6C），發(fā)現(xiàn)在流速1.00 mL/min、De=7.45 條件下，無(wú)論是15.5 μm 粒子還是7.3 μm 粒子，均能在靠近管道內(nèi)壁區(qū)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)單線聚焦。為了進(jìn)一步觀察粒子聚焦是否穩(wěn)定，將粒子在0.50～2.00 mL/min 流速范圍內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行視頻拍攝（見電子版文后支持信息S1），結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu)輔助的螺旋通道具有較高的粒子聚焦穩(wěn)定性，同時(shí)體現(xiàn)出此通道不會(huì)產(chǎn)生堵塞的優(yōu)勢(shì)。

進(jìn)一步對(duì)不同流速下兩種尺寸粒子的單線聚焦效率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。如圖6D 所示， 7.3 和15.5 μm的粒子在較大流速范圍（0.50～3.00 mL/min）內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)聚焦，聚焦效率分別可達(dá)94%和99%以上。15.5 μm 粒子的聚焦效果優(yōu)于7.3 μm 粒子，這是因?yàn)殡S著粒子尺寸增大，受到的流體動(dòng)力學(xué)力增加，平衡位置不容易被改變，進(jìn)而提高了聚焦效率。

在不同的流速條件下，采用高速顯微鏡觀察了粒子的聚焦情況（圖7A 和電子版文后支持信息S2），同時(shí)還對(duì)聚焦位置和管道壁之間的間距進(jìn)行了分析（圖7B）。如圖7C 所示，在0.50～3.00 mL/min 的流速范圍內(nèi)，粒子的聚焦位置與管道內(nèi)壁的距離均能達(dá)到約100 μm， 遠(yuǎn)超過其它慣性聚焦芯片的效果，這為便攜式分析診斷儀器的開發(fā)提供了新的技術(shù)手段。距離管壁越遠(yuǎn)的聚焦位置對(duì)于進(jìn)行后續(xù)的深入觀察和分析具有更多優(yōu)勢(shì)。這種較大距離的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：（1） 減少壁面干擾粒子聚焦位置距離管壁越遠(yuǎn)，受到來自壁面的干擾越小，使得后續(xù)的觀察和分析更加精確和可靠；（2） 提供更大的視野聚焦位置距離管壁越遠(yuǎn)，可觀察到的區(qū)域范圍越大，可獲得更多的信息和數(shù)據(jù)，更全面地了解粒子的行為和性質(zhì); （3） 便于采集樣本在聚焦位置較遠(yuǎn)的區(qū)域，取得樣本或進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作更加方便，可以提高實(shí)驗(yàn)效率，并減少由于接觸壁面而可能引起的污染或損失。因此，在進(jìn)行觀察和分析時(shí)，選擇距離管壁較遠(yuǎn)的粒子聚焦位置可為研究者提供更多的優(yōu)勢(shì)和便利，有助于深入研究粒子的特性和行為。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)超低高寬比的螺旋微通道進(jìn)行了設(shè)計(jì)，通過在通道芯片內(nèi)部設(shè)置等序列的微結(jié)構(gòu)，成功誘導(dǎo)出穩(wěn)定且增強(qiáng)的二次流，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)流量和粒徑不敏感的慣性聚焦。相比于傳統(tǒng)的鞘流方式，此設(shè)計(jì)具有高通量和易于制造的優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞分析與檢測(cè)、流式細(xì)胞儀和在線樣品處理等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。此項(xiàng)技術(shù)不僅限于血細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究和血漿分選，還可望應(yīng)用于細(xì)胞分析、藥物篩選和生物傳感器等領(lǐng)域。通過深入研究Dean 二次流的生成機(jī)制和特性，可進(jìn)一步改進(jìn)通道設(shè)計(jì)和微結(jié)構(gòu)排列，實(shí)現(xiàn)更精確的粒子和細(xì)胞聚焦效果，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供更多可能性。本研究為理解和利用Dean 二次流在微流體系統(tǒng)中的作用提供了重要的實(shí)證基礎(chǔ)，此技術(shù)可為細(xì)菌檢測(cè)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選、藥物篩選以及單細(xì)胞分析等提供新的技術(shù)手段，對(duì)開展環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)和生物分析等領(lǐng)域的研究具有重要的參考意義。