山柰酚減輕心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制

摘要目的：探討山柰酚對(duì)心肌缺血再灌注（I/R）損傷中心肌細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制。方法：建立體內(nèi)SD大鼠心肌I/R模型和體外H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）模型，給予山柰酚干預(yù)。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定血漿心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）以評(píng)估心臟損傷程度，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法評(píng)估細(xì)胞活力，蛋白免疫印跡法（Western Blot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白和基因變化。結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)證明山柰酚改善H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，部分逆轉(zhuǎn)了鐵死亡相關(guān)蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、相關(guān)基因核糖體蛋白L8（RPL8）、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）和三磷酸腺苷合酶F0復(fù)合亞基C3（ATP5G3）的變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明山柰酚減輕I/R誘導(dǎo)心肌組織病理變化，降低血清中cTnI、CK和LDH水平，抑制鐵死亡相關(guān)蛋白和基因的變化。結(jié)論：山柰酚可能通過抑制心肌I/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注損傷；山柰酚；心肌細(xì)胞；鐵死亡；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.15.011

冠狀動(dòng)脈疾病嚴(yán)重影響著全球人類的健康，已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一［1］。溶栓治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療盡管是冠狀動(dòng)脈疾病病人最廣泛使用的治療和干預(yù)措施，但是會(huì)不可避免地誘發(fā)心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［1-2］。再灌注時(shí)，恢復(fù)氧氣供應(yīng)增加了活性氧的產(chǎn)生，這可能促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的打開并最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷或者死亡［1，3-4］。雖然藥物治療可以幫助恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)，但針對(duì) I/R損傷的藥物開發(fā)尚未成功。因此，I/R 損傷分子機(jī)制的探究和新治療藥物靶點(diǎn)的確定一直是研究的焦點(diǎn)。山柰酚（kaempferol，Kae）是一種黃酮類化合物，廣泛存在于許多水果、蔬菜和藥用植物中［5］。據(jù)報(bào)道，山柰酚在體內(nèi)外均具有抗氧化作用、抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)特性，目前已用于多種疾病的治療和預(yù)防，如缺血缺氧性腦病、類風(fēng)濕系統(tǒng)疾病、阿爾茨海默病和癌癥等［5-6］。 近年來的研究表明，山柰酚對(duì)心肌I/R損傷也具有一定的保護(hù)作用，如山柰酚可以通過抑制氧化應(yīng)激和抗炎作用縮小I/R誘導(dǎo)的心肌梗死面積［7］。然而，在心肌I/R損傷中山柰酚發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制目前尚不清楚。

鐵死亡是一種依賴于鐵離子和活性氧積累的非凋亡性細(xì)胞死亡方式，屬于一種獨(dú)特的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式。鐵死亡是由于谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）耗竭，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物積累形成的［4，8］。目前研究已經(jīng)確定了幾個(gè)導(dǎo)致鐵死亡的基因，包括核糖體蛋白 L8（ribosomal protein L8，RPL8）、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 2（iron response element binding protein 2，IREB2）和三磷酸腺苷（ATP）合酶F0復(fù)合亞基C3（ATP synthase F0 complex subunit C3，ATP5G3）等［4，9-10］。最近的多項(xiàng)研究表明，鐵死亡是心肌細(xì)胞死亡的一種重要形式，心肌I/R損傷時(shí)鐵死亡在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡和心肌病中起到重要作用，而且抑制鐵死亡可以明顯減輕I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［11-13］。但山柰酚是否可以抑制心肌I/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，尚未見報(bào)道。因此，本研究探討山柰酚對(duì)SD大鼠心肌I/R損傷的影響，并分析山柰酚對(duì)心肌I/R損傷中心肌細(xì)胞鐵死亡的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～8 周齡的健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2心肌I/R模型建立

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉。麻醉后于胸骨左緣第4肋間微小切開胸廓暴露心臟，絲線活扣結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，迅速將心臟回置胸腔、關(guān)胸。缺血45 min后體外松扎，再灌注24 h。

1.3分組及給藥方法

將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）、山柰酚組（Kae組）、I/R組、I/R＋Kae組。Con組：暴露左冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎，腹腔注射生理鹽水；Kae組：大鼠尾靜脈注射山柰酚10 mg/kg，其余處理同Con組；I/R組：大鼠左前降支結(jié)扎45 min，再灌注24 h；I/R＋Kae組：大鼠缺血前30 min尾靜脈注射山柰酚10 mg/kg，隨后大鼠左前降支結(jié)扎45 min，再灌注24 h。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧（H/R）模型

將H9c2細(xì)胞接種在60 mm培養(yǎng)皿中，在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和100 μg/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞同步化處理之后，H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%的密度時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧（H/R）處理。將細(xì)胞的培養(yǎng)基換成無FBS的低糖培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞在低氧三氣培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2和 1%O2）中缺氧培養(yǎng)12 h，隨后將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM，在普通培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2和95%空氣）中進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)12 h［14］。將一直在普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)但不更換培養(yǎng)基且培養(yǎng)時(shí)間相同的細(xì)胞作為Con組。而H/R＋Kae組細(xì)胞用不同濃度的山柰酚（selleck，USA）預(yù)處理2 h，然后進(jìn)行H/R處理。

1.5四甲基偶氮唑鹽（MTT）法

通過MTT法評(píng)估體外細(xì)胞活力。將 H9c2 細(xì)胞接種在96孔板中，經(jīng)過H/R或GL處理后，將細(xì)胞在含有3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑的MTT溶液（0.5 mg/mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h。棄掉上清，加入二甲基亞砜（DMSO），吸出含有細(xì)胞的DMSO懸液并在490 nm處量化吸光度值（optical density，OD）。通過計(jì)算公式量化細(xì)胞活力：細(xì)胞活力＝治療組OD/對(duì)照組OD。

1.6蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色

左心室心肌組織在4%多聚甲醛中固定24 h，隨后用石蠟包埋。包埋的心臟組織切片（5 μm），將切片固定、沖洗并用HE染色，然后用光學(xué)顯微鏡對(duì)其進(jìn)行成像拍照。

1.7心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)

再灌注后收集血樣，在4 ℃以5 000×g離心20 min分離出血清，根據(jù)大鼠心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（SEKR-0048，Solarbio）的說明書檢測(cè)cTnI水平；根據(jù)大鼠肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性試劑盒（BC1145，Solarbio）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒（BC0680，Solarbio）的說明書檢測(cè)CK和LDH水平。

1.8蛋白免疫印跡法（Western Blot）

從心肌組織和H9c2細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，通過二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)（10～20 μg）通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并利用電轉(zhuǎn)膜槽轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。裁膜并將膜放到兔抗GPX4（1∶1 000，Abcam，USA）和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，1∶3 000，Abcam，USA）一起孵育。隨后將孵過一抗的膜與山羊抗兔二抗一起孵育2 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯像并保存圖片。最后使用Image J測(cè)量軟件對(duì)圖片進(jìn)行灰度值半定量分析。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）

使用 TRIzol試劑盒（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，USA）提取心肌梗死周圍組織的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，USA）逆轉(zhuǎn)錄RNA（2 μg）合成cDNA。隨后根據(jù)SYBR q-PCR試劑盒（TaKaRa，Japan）說明書和RT-PCR儀的特點(diǎn)，加入引物的同時(shí)加入SYBR熒光染料，測(cè)出對(duì)應(yīng)引物的表達(dá)量。具體的引物序列見表1。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過GraphPad Prism 8軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用Student′s t檢驗(yàn)，多組間比較采用Bonferroni校正的單向方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1山柰酚對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的影響

首先，在體外觀察山柰酚對(duì)H9c2細(xì)胞的影響。MTT結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，加入山柰酚處理H9c2細(xì)胞24 h后，在山柰酚濃度為100 μmol/L以內(nèi)時(shí)，對(duì)心肌細(xì)胞活力并不產(chǎn)生影響，但當(dāng)山柰酚的濃度達(dá)到200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降（見圖1）。其次，觀察山柰酚對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響。與Con組相比，H/R組心肌細(xì)胞活力明顯下降，而給予山柰酚預(yù)處理后，山柰酚以劑量依賴性促進(jìn) H/R后心肌細(xì)胞活力的恢復(fù)（見圖2）。最后，選擇山柰酚10 μmol/L做了進(jìn)一步觀察，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和對(duì)培養(yǎng)基中LDH的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Con組和Kae組細(xì)胞計(jì)數(shù)和培養(yǎng)基中LDH水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Con組相比，H/R組細(xì)胞計(jì)數(shù)減少并且釋放到培養(yǎng)基中的LDH增加（P＜0.05），而H/R＋Kae組提升了細(xì)胞計(jì)數(shù)水平并降低了培養(yǎng)基中LDH含量（P＜0.05）。詳見圖 3、圖4。表明山柰酚在一定濃度（100 μmol/L）內(nèi)，并不會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，并且可以減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷。

2.2山柰酚對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞鐵死亡的影響

為了驗(yàn)證山柰酚是否通過抑制鐵死亡來減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷，檢測(cè)鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4和鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與Con組相比，H/R組GPX4表達(dá)降低（P＜0.05），而H/R＋Kae組GPX4表達(dá)較H/R組升高（P＜0.05），詳見圖 5。RT-PCR結(jié)果顯示，與Con組相比，H/R組鐵死亡相關(guān)基因RPL8、IREB2和ATP5G3表達(dá)升高（P＜0.01），而H/R＋Kae組鐵死亡相關(guān)基因RPL8、IREB2和ATP5G3表達(dá)較H/R組降低（P＜0.05），詳見圖6。表明山柰酚預(yù)處理可以減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白和基因的變化。

2.3山柰酚對(duì)I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響

通過HE染色觀察山柰酚對(duì)I/R誘導(dǎo)的心肌形態(tài)學(xué)的影響。HE染色顯示，Con組和Kae組心肌結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，心肌橫紋清晰。與Con組相比，I/R組心肌肌纖維斷裂，細(xì)胞外間隙增大，表明I/R組心肌組織病理變化非常明顯。與I/R組相比，I/R＋Kae組大鼠的心臟切片顯示橫紋肌纖維相對(duì)更完整，破壞較少。詳見圖7。同時(shí)測(cè)定血漿cTnI、CK和LDH水平以評(píng)估心臟損傷程度。與Con組相比，I/R組血清中cTnI、CK和LDH水平均明顯升高（P＜0.01），而I/R＋Kae組血清cTnI、CK和LDH水平較I/R組降低（P＜0.05）。詳見圖8。表明山柰酚對(duì)I/R引起的心肌損傷具有保護(hù)作用。

2.4山柰酚對(duì)I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡的影響

通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估鐵死亡相關(guān)蛋白和基因的變化。與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，與Con組相比，I/R組鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4表達(dá)降低（P＜0.05），鐵死亡相關(guān)基因RPL8、IREB2和ATP5G3表達(dá)升高（P＜0.01），而與I/R組比較，I/R＋Kae組GPX4表達(dá)升高（P＜0.05），鐵死亡相關(guān)基因RPL8、IREB2和ATP5G3表達(dá)降低（P＜0.05）。表明山柰酚可抑制I/R誘導(dǎo)的SD大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。詳見圖9、圖10。

3討論

再灌注療法在治療缺血心肌的同時(shí)，本身會(huì)誘發(fā)心肌梗死，導(dǎo)致心肌損傷或心肌細(xì)胞死亡［2，14］。心肌I/R損傷可表現(xiàn)為心律失常、心肌細(xì)胞凋亡、血流動(dòng)力學(xué)紊亂、心肌酶損傷等［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌I/R損傷時(shí)發(fā)生鐵死亡，并伴有心肌酶的改變，而用山柰酚干預(yù)心肌I/R損傷后，心肌細(xì)胞鐵死亡減少，并伴有心肌酶損傷水平降低，表明山柰酚可能通過抑制心肌細(xì)胞鐵死亡減輕心肌I/R損傷。

山柰酚是一種廣泛分布的黃酮醇類化合物，已被證明具有抗氧化、抗炎等多種生物活性，并且具有保護(hù)心臟等作用［16］。在順鉑誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠心臟毒性模型中，山柰酚可通過調(diào)節(jié)干擾素基因刺激因子（STING）/核因子-κB（NF-κB）通路來降低順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕心臟毒性反應(yīng)［17］。Guo等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚通過沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）介導(dǎo)的線粒體途徑來減少活性氧生成，保存線粒體膜電位，減少細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/再氧合損傷；此外，山柰酚也可通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白及對(duì)抑制Caspase-3的激活，調(diào)節(jié)心肌I/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，減輕心臟損傷［19］。本研究中的體外實(shí)驗(yàn)顯示，山柰酚明顯減輕了H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，并降低了培養(yǎng)基中LDH含量；同樣，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，山柰酚可明顯抑制SD大鼠I/R損傷時(shí)的心肌結(jié)構(gòu)損傷并降低血清中cTnI、CK和LDH水平。上述結(jié)果表明山柰酚對(duì)I/R引起的心肌損傷具有保護(hù)作用。

鐵死亡是一種相對(duì)較新的可調(diào)控的細(xì)胞死亡形式［20］。導(dǎo)致鐵死亡的關(guān)鍵因素是二價(jià)鐵的積累，谷胱甘肽依賴性抗氧化防御機(jī)制的破壞，導(dǎo)致GPX4的耗竭和脂質(zhì)過氧化物的積累［4，12］。多項(xiàng)研究表明，鐵死亡是心肌細(xì)胞死亡的一種重要形式，I/R損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞鐵死亡［11］。本研究從體內(nèi)心肌I/R損傷和體外H/R損傷模型中發(fā)現(xiàn)，模型組心肌細(xì)胞中GPX4活性降低，鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)增加，提示I/R和H/R模型組中心肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，而給予山柰酚治療后，促進(jìn)了GPX4的表達(dá)，抑制了鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)，表明山柰酚治療可以抑制I/R和H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。因此，山柰酚對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用，可能是通過抑制心肌細(xì)胞鐵死亡而發(fā)揮作用的。

總之，本研究表明，山柰酚具有減弱SD大鼠心肌I/R損傷的作用，并且山柰酚通過抑制心肌I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡發(fā)揮心臟保護(hù)作用。表明山柰酚是一種治療心肌I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的天然化合物。

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（收稿日期：2023-12-08）

（本文編輯郭懷印）