衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測阿加曲班中氯甲酸異丁酯殘留

關(guān)鍵詞阿加曲班；氯甲酸異丁酯；衍生反應(yīng)；氣相色譜-質(zhì)譜；甲基異丁基碳酸酯

阿加曲班是新一代抗血栓藥，是一種活性強(qiáng)、高選擇性的小分子直接凝血酶抑制劑，能可逆、迅速地與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制凝血酶催化或誘導(dǎo)的反應(yīng)，發(fā)揮抗凝血作用[1-2]。1990年，阿加曲班在日本首次上市，2002年在中國正式上市，商品名為諾保思泰，臨床用于缺血性腦梗死急性期患者的抗凝治療[3]、抗凝血酶缺乏患者進(jìn)行血透時(shí)的抗凝處理[4]和心肌梗死溶栓的輔助治療[5]，以及治療和預(yù)防肝素誘導(dǎo)的免疫性疾病-血小板減少癥，比肝素具有更好的抗凝和抗血栓作用[6]。

氯甲酸異丁酯（Isobutylchloroformate，IBCF）為無色具有刺激性氣味的液體，遇水或受熱易分解，是一種重要的化工原料，常用于有機(jī)物和藥物合成，是合成阿加曲班的重要原料[7-8]。IBCF屬于酰鹵類物質(zhì)，雖然目前尚無明確毒理學(xué)數(shù)據(jù)證明其基因毒性、致畸性和致癌性，但由于這類化合物含有結(jié)構(gòu)警示基團(tuán)，所以仍被認(rèn)為是潛在的基因毒性雜質(zhì)[9-11]。根據(jù)歐洲藥品管理局[12]和美國食品藥品管理局[13]的法規(guī)要求，基因毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾值（Thresholdoftoxicologicalconcern，TTC）限度為1.5μg/d，由于阿加曲班每日最高服用劑量為60mg，其中的IBCF的限度值即為25μg/g。因此，有必要建立對(duì)阿加曲班中IBCF的殘留進(jìn)行檢測分析的有效方法，但尚未見阿加曲班中IBCF分析測定的研究報(bào)道。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的氯甲酸酯類物質(zhì)的檢測方法很少，主要是氣相色譜法（Gaschromatography，GC）[14]和氣相色譜-質(zhì)譜法（Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）[15-16]，但由于氯甲酸酯類物質(zhì)受熱易分解[17]，影響了方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。氯甲酸酯類物質(zhì)是一類常用的衍生試劑[18]，可通過衍生作用改變目標(biāo)化合物的分子量、極性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性等理化性質(zhì)。IBCF是眾多氯甲酸酯類物質(zhì)的一種，目前被廣泛應(yīng)用于氨基酸[19-21]、生物胺[22-26]、脂肪酸[27]、對(duì)羥基苯甲酸酯[28]、哌啶類[29]和核酸堿基類[30]物質(zhì)的檢測分析。上述化合物雖然可與IBCF發(fā)生衍生反應(yīng)，但不具備樣品溶解、IBCF提取以及相關(guān)試液配制的功能?；诖?，本研究選取甲醇作為阿加曲班原料藥（簡稱阿加曲班）樣品的溶解和IBCF的提取及衍生試劑，通過IBCF與甲醇發(fā)生衍生反應(yīng)生成甲基異丁基碳酸酯（Methylisobutylcarbonate，MIBCB），有效改善了IBCF的熱不穩(wěn)定性和色譜行為，建立了阿加曲班中IBCF殘留的衍生化-GC-MS檢測方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。本方法能同時(shí)實(shí)現(xiàn)阿加曲班的溶解和IBCF的提取及衍生，通過檢測衍生產(chǎn)物MIBCB，間接實(shí)現(xiàn)了IBCF的準(zhǔn)確測定，大大簡化了樣品的前處理過程，提高了檢測效率，方法操作簡便、靈敏度高、基質(zhì)效應(yīng)低、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為阿加曲班中IBCF殘留的測定提供了新方法。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

GCMSTQ8040氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配NIST20標(biāo)準(zhǔn)譜庫（日本Shimadzu公司）；XPE105電子天平（瑞士MettlerToledo公司）；Vortex-Genie2渦旋振蕩器（美國ScientificIndustries公司）。IBCF對(duì)照品（純度98%，上海阿拉丁生物試劑有限公司）；甲醇、正己烷、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜（色譜純，美國Fisher公司）；甲基叔丁基醚（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；吡啶（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。8批次阿加曲班樣品由兩家藥業(yè)公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)照品和供試品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10mgIBCF對(duì)照品，以甲醇溶解并定容至10mL，室溫靜置24h后，制得1000μg/mLIBCF對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液，以甲醇逐級(jí)稀釋，制得濃度分別為25、100、200、250、300和500ng/mL的系列對(duì)照品溶液。

準(zhǔn)確稱取100mg阿加曲班樣品，以甲醇溶解并定容至10mL，室溫靜置24h后，制得10mg/mL供試品溶液。

1.2.2儀器分析條件

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，固定相為5%苯基-甲基聚硅氧烷，美國Agilent公司）；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣模式：恒線速度控制模式；柱流量：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比為5∶1；進(jìn)樣體積為1.0μL；溶劑延遲2min。升溫程序：初始柱溫50℃（保持2min），以20℃/min升至100℃，再以30℃/min升至280℃（保持5min）。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（Electronimpact，EI）；電子能量：70eV；離子源溫度：230℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：280℃；采集模式為全掃描監(jiān)測模式（SCAN），掃描范圍為m/z29～600；采集模式為選擇離子監(jiān)測（Selectiveionmonitor，SIM）模式；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3方法學(xué)驗(yàn)證

依次檢測1.2.1節(jié)配制的濃度為25、100、200、250、300和500ng/mL的系列對(duì)照品溶液，考察方法的線性范圍；結(jié)合1.2.1節(jié)供試品溶液的制備過程，分別按信噪比（S/N）為3和10的原則，確定方法的檢出限（Limitofdetection，LOD）和定量限（Limitofquantification，LOQ）。向阿加曲班樣品中添加低（2.50μg/g）、中（25.00μg/g）、高（50.00μg/g）3個(gè)水平的對(duì)照品溶液，考察方法的加標(biāo)回收率。在不同日期，由不同實(shí)驗(yàn)人員測定加標(biāo)樣品溶液（25.00μg/g），考察方法的精密度。通過微小變動(dòng)測定條件，在不同的儀器條件下測定加標(biāo)樣品溶液，考察方法的耐用性。

2結(jié)果與討論

2.1提取和衍生試劑的篩選

測定阿加曲班中的IBCF時(shí)要求樣品和IBCF均能充分溶于提取試劑。稱取50mg阿加曲班并置于10mL離心管中，平行稱取7份，分別加入5mL甲醇、正己烷、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、甲基叔丁基醚和吡啶，考察其溶解度。結(jié)果表明，阿加曲班在正己烷、二氯甲烷和甲基叔丁基醚中的溶解度較差，不能被完全溶解，所以，后續(xù)不再考慮這3種溶劑。阿加曲班能完全溶于甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和吡啶，分別采用這4種溶劑配制濃度為100μg/mL的對(duì)照品溶液，考察IBCF的響應(yīng)。結(jié)果表明，IBCF在N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的響應(yīng)很低，N，N-二甲基甲酰胺還會(huì)干擾IBCF的測定；IBCF與吡啶會(huì)發(fā)生衍生反應(yīng)，生成的產(chǎn)物響應(yīng)低且不穩(wěn)定；IBCF不僅與甲醇發(fā)生衍生反應(yīng)生成MIBCB，而且產(chǎn)物穩(wěn)定、色譜峰形好、響應(yīng)高。綜上，甲醇同時(shí)具備可溶解樣品和提取以及衍生IBCF的功能，因此，選擇甲醇作為提取和衍生試劑。

2.2衍生反應(yīng)的機(jī)理

準(zhǔn)確稱取適量IBCF對(duì)照品，以甲醇為溶劑，配制成100μg/mL對(duì)照品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，按1.2.2節(jié)的儀器分析條件，在SCAN模式下立即進(jìn)行檢測分析，所獲取的總離子流色譜圖（Totalionchromatogram，TIC）見圖1。由于采用甲醇溶解后立即測定，IBCF雖發(fā)生了衍生化，但是反應(yīng)不完全，仍有部分IBCF為原型，所以共檢測出2個(gè)色譜峰：峰1的峰形不對(duì)稱，峰2的峰形和響應(yīng)均良好。對(duì)2個(gè)色譜峰進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索（表2），分別為IBCF和MIBCB，相似度均高達(dá)96%。IBCF與MIBCB的分子結(jié)構(gòu)很相近，只有1個(gè)取代基的差異，推測MIBCB為IBCF的衍生產(chǎn)物，衍生機(jī)理如圖2所示，通過此衍生反應(yīng)，IBCF的色譜行為發(fā)生了顯著改善。

2.3質(zhì)譜的碎裂機(jī)理及定性、定量離子的選擇

為了減小基質(zhì)背景干擾、降低基質(zhì)效應(yīng)以及提高檢測的靈敏度，本研究采用SIM模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測分析。圖3為2.2節(jié)圖1中IBCF和MIBCB對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖。在質(zhì)譜定量檢測的過程中，通常選擇m/z值大且豐度高的碎片離子作為定性離子，再從定性離子中選擇豐度最高的碎片離子作為定量離子。由圖3可見，m/z41、43、56和57為IBCF和MIBCB豐度較高的共性離子，但由于m/z41和43質(zhì)荷比較小，受基質(zhì)干擾的可能性較大，因此IBCF首先選定m/z值較大、豐度次之的m/z56和57作為定性離子，MIBCB首先選定m/z值較大，豐度最高的m/z56和豐度次之的m/z57作為定性離子；其次分別選擇m/z值較大、豐度也較高的特征離子m/z63和90作為IBCF和MIBCB的另一個(gè)定性離子；最后，再從上述定性離子中選擇豐度最高的m/z56作為二者的定量離子。本方法同時(shí)采集m/z56、57、63和90這4個(gè)特征碎片離子，可實(shí)現(xiàn)IBCF和MIBCB的同時(shí)測定，在保證IBCF完全衍生為MIBCB的前提下，通過檢測MIBCB間接實(shí)現(xiàn)IBCF的準(zhǔn)確測定。IBCF和MIBCB可能的碎裂機(jī)理如圖4所示。

2.4衍生反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

由圖1可知，現(xiàn)配現(xiàn)測IBCF對(duì)照品甲醇溶液在檢出MIBCB的同時(shí)，仍有明顯的IBCF檢出，說明IBCF與甲醇混合后雖能發(fā)生衍生反應(yīng)，但不能立即反應(yīng)完全，為了確保IBCF能在最短的時(shí)間內(nèi)完全衍生為MIBCB，需對(duì)衍生時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。溫度是影響反應(yīng)速度的關(guān)鍵因素。相比于室溫，雖然升高衍生溫度能夠增加反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時(shí)間，但I(xiàn)BCF在高溫下不穩(wěn)定，易分解，并且高溫會(huì)加快反應(yīng)試劑的揮發(fā)，引發(fā)不必要的副反應(yīng)，不利于衍生反應(yīng)的順利進(jìn)行和控制。因此，本研究選擇在室溫條件下對(duì)衍生時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

采用甲醇作為溶劑，配制100μg/mLIBCF對(duì)照品溶液，在室溫下靜置0、2、4、8、16、24、36和48h后，按1.2.2節(jié)的儀器分析條件進(jìn)行檢測，根據(jù)IBCF和MIBCB的定量離子m/z56的峰面積可知，衍生16h后，MIBCB的響應(yīng)基本保持穩(wěn)定，IBCF仍有微弱檢出，對(duì)應(yīng)的S/N=3.3，接近儀器的檢出限。衍生24h后，已完全無法檢出IBCF，MIBCB仍保持穩(wěn)定，m/z56峰面積的變化趨勢如圖5所示，因此，確定衍生反應(yīng)時(shí)間定為24h。衍生24h后，IBCF對(duì)照品溶液的SIM譜圖見圖6。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的條件下檢測系列對(duì)照品溶液，以衍生產(chǎn)物MIBCB的定量離子m/z56的峰面積（y）對(duì)IBCF的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，IBCF在25～500ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=62.18x+476.69，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9999。逐級(jí)稀釋IBCF對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測分析，分別按S/N為3與10的原則確定方法的LOD和LOQ分別為0.75和2.50μg/g。

2.5.2加標(biāo)回收率和精密度

按1.2.1節(jié)方法制備某批次的阿加曲班供試品溶液，采用本方法進(jìn)行測定，未檢出IBCF。配制濃度為250、2500和5000ng/mL的IBCF對(duì)照品溶液。稱取上述阿加曲班樣品100mg，分別加入上述對(duì)照品溶液1mL，以甲醇定容至10mL，制得加標(biāo)濃度分別為2.5（低）、25.0（中）和50.0μg/g（高）的加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)濃度水平重復(fù)測定6次，加標(biāo)回收率分別為97.8%（RSD=3.1%）、97.4%（RSD=2.1%）和95.2%（RSD=2.0%）。為了考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)方法精密度的影響，在不同日期，由不同實(shí)驗(yàn)人員分別重復(fù)測定加標(biāo)樣品溶液（25.00μg/g）6次，12次測定結(jié)果的平均值為24.28μg/g，RSD為2.1%。

2.5.3方法的耐用性

耐用性是指在測定條件發(fā)生微小變化時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度。分別在原測試條件、初始柱溫±5℃、升溫速率±2℃/min和柱流量±0.1mL/min的條件下，檢測IBCF對(duì)照品溶液（250ng/mL）和加標(biāo)樣品溶液（25.00μg/g），采用外標(biāo)法單點(diǎn)計(jì)算加標(biāo)樣品溶液中IBCF的含量，考察方法的耐用性。在不同測定條件下，7次檢測結(jié)果的平均值為24.16μg/g，RSD為2.2%，表明本方法耐用性良好，檢測結(jié)果穩(wěn)定，測定條件的微小改變對(duì)檢測結(jié)果的影響較小。

2.6實(shí)際樣品分析

對(duì)兩家藥業(yè)公司生產(chǎn)的8批次阿加曲班樣品進(jìn)行測定，檢測結(jié)果如圖7所示，IBCF和MIBCB均無響應(yīng)，表明上述8批樣品中均未檢出IBCF。

3結(jié)論

本研究對(duì)提取和衍生試劑、衍生反應(yīng)時(shí)間、定性和定量離子進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，推測了衍生反應(yīng)和特征碎片離子的碎裂機(jī)理，建立了阿加曲班中IBCF殘留的衍生化-GC-MS檢測方法，同時(shí)進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果令人滿意。本方法在SIM模式下同時(shí)采集IBCF和MIBCB的4個(gè)特征碎片離子，在保證IBCF與甲醇完全衍生為MIBCB的前提下，通過檢測MIBCB，間接實(shí)現(xiàn)IBCF的準(zhǔn)確測定。采用本方法對(duì)兩家藥業(yè)公司生產(chǎn)的阿加曲班樣品進(jìn)行測定，結(jié)果表明，8批次的阿加曲班樣品中均未檢出IBCF。本方法能同時(shí)實(shí)現(xiàn)阿加曲班的溶解和IBCF的提取及衍生，操作簡便、靈敏度高、基質(zhì)效應(yīng)低、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為阿加曲班中IBCF殘留的測定提供了參考方法。