關(guān)鍵詞獸藥;雞蛋;氧化石墨烯;三聚氰胺海綿;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜
雞蛋中蛋白質(zhì)含量高,能夠提供人體所必須的氨基酸。自1985年以來(lái),我國(guó)的雞蛋產(chǎn)量一直保持世界領(lǐng)先地位[1]。在蛋禽飼養(yǎng)過(guò)程中,獸藥具有預(yù)防和治療疾病以及促進(jìn)生長(zhǎng)的作用,然而,不法商家和養(yǎng)殖戶為追求高經(jīng)濟(jì)效益,不遵循休藥期以及使用規(guī)定,導(dǎo)致獸藥殘留現(xiàn)象較為普遍[2-3]。由于獸藥理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定,可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,長(zhǎng)期攝入獸藥殘留超標(biāo)的食物可引起過(guò)敏反應(yīng)和消化系統(tǒng)功能紊亂等疾病[4-5],對(duì)人體健康造成威脅。為確保食品安全,降低對(duì)人類健康的危害,我國(guó)以及包括歐盟在內(nèi)的許多國(guó)家及組織對(duì)雞蛋中獸藥的最大殘留限量作出了明確規(guī)定[6-8]。
獸藥殘留檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫分析(ELISA)[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)[10-11]、毛細(xì)管電泳(CE)[12-13]、微生物分析(MAT)[14-15]、放射性免疫分析(RIA)[16]和膠體金檢測(cè)技術(shù)(CGT)[17]等。其中,HPLC-MS能夠同時(shí)對(duì)多種獸藥進(jìn)行檢測(cè)分析,已逐漸發(fā)展成為獸藥多殘留分析的主流技術(shù)。由于雞蛋基質(zhì)組成復(fù)雜,采用HPLC-MS分析獸藥殘留時(shí)易受到基質(zhì)干擾,因此需要進(jìn)行必要的樣品前處理。目前,獸藥的樣品前處理技術(shù)主要有液液萃?。↙LE)[18-19]、固相萃?。⊿PE)[20]、QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)[21-22]和固相微萃取(SPME)[23]等。其中,QuEChERS技術(shù)具有簡(jiǎn)單、可靠和高效的特點(diǎn),在凈化過(guò)程中應(yīng)用不同的基質(zhì)吸附劑,可以有效去除提取液中的干擾基質(zhì),然而QuEChERS法中常采用的微納米型基質(zhì)吸附劑尺寸小,其基質(zhì)分離過(guò)程主要通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高速離心實(shí)現(xiàn),不利于快速分析。隨著基于磁納米顆粒的基質(zhì)凈化劑[24-25]相繼被開(kāi)發(fā),通過(guò)強(qiáng)磁場(chǎng)輔助分離技術(shù),可在數(shù)秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的快速分離。然而,磁納米吸附劑存在的尺寸不均、顆粒團(tuán)聚和分散性差等問(wèn)題仍是需首要考慮的問(wèn)題[26-28]。
氧化石墨烯(GO)主要由單層sp2雜化碳原子排列而成,呈蜂窩狀,表面含有豐富的環(huán)氧基、羧基、羥基和芳烷基等功能吸附位點(diǎn),具有優(yōu)異的凈化效果[29-30]。然而,GO片層之間相互堆疊導(dǎo)致其分散穩(wěn)定性不足,因此,改善分散性是拓展其應(yīng)用范圍的重要方法。三聚氰胺海綿(MeS)具有彈性高、密度低和孔隙率高等特點(diǎn)。本研究通過(guò)水熱合成法將GO加載到MeS表面,改善了GO的分散穩(wěn)定性,通過(guò)簡(jiǎn)單的浸潤(rùn)與擠壓即可在數(shù)秒內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)對(duì)基質(zhì)的凈化與分離,無(wú)需離心和磁回收等過(guò)程?;诖私⒘艘环N基于還原氧化石墨烯改性三聚氰胺海綿(r-GO@MeS)的改良QuEChERS方法,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)用于同時(shí)快速測(cè)定雞蛋中32種獸藥殘留。本方法經(jīng)濟(jì)高效、方便快捷、適用性好,能夠滿足獸藥殘留的測(cè)定要求,可為雞蛋的質(zhì)量安全監(jiān)督提供技術(shù)支撐,同時(shí)也為開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便高效的樣品前處理方法提供了新思路。
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
Agilent1290InfinityⅡUPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);ABSCIEXQTRAP5500質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司);Vortex-Genie2多功能旋渦混合器(美國(guó)ScientificIndustries公司);3K15高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);ME204分析天平(瑞士MettlerToledo公司)。
32種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;甲醇和乙腈(HPLC級(jí),美國(guó)ThermoFisherScientific公司);甲酸和乙酸銨(LC-MS級(jí),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);Na2EDTA(HPLC級(jí),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);NaCl和無(wú)水Na2SO4(分析純,阿拉丁試劑上海有限公司);抗壞血酸(AA,分析純,上海麥克林生化科技有限公司)。GO(純度98%,蘇州碳豐石墨烯科技有限公司);MeS(濮陽(yáng)市覓潔泡綿有限公司);0.22μm有機(jī)微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2MΩ·cm,美國(guó)Millipore公司超純水系統(tǒng)制備)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取32種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制成1mg/mL的單標(biāo)溶液。分別移取適量的各藥物單標(biāo)溶液于10mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于–20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
移取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于5mL容量瓶中,以甲醇定容,配制成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。按比例用甲醇逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,配制成系列待測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.2.2改性海綿的制備
根據(jù)文獻(xiàn)[31]的水熱合成法制備r-GO@MeS。準(zhǔn)確稱取50mgAA和50mgGO,在磁力攪拌下加入到100mL超純水中,超聲10min使其充分混合。將MeS裁剪為底部直徑和高度分別為8和4mm的微型圓柱(~201mm3),浸入到上述分散液中,通過(guò)反復(fù)擠壓海綿排除其內(nèi)部氣泡。將分散液與海綿放入玻璃瓶中密封,置于烘箱中,在95℃下水熱反應(yīng)3h后,冷卻至室溫,以超純水和乙醇洗滌,在40℃烘箱中干燥24h,得到r-GO@MeS。
1.2.3樣品制備與前處理
72份雞蛋樣品購(gòu)自國(guó)內(nèi)8個(gè)城市的超市,去蛋殼后采用高速均質(zhì)機(jī)混勻,于?20℃保存?zhèn)溆谩ku蛋樣品中獸藥殘留提取與凈化采用文獻(xiàn)[32]的方法并略作修改:精確稱取5.0g均質(zhì)雞蛋于50mL聚乙烯離心管中,分別加入5mL0.1mmol/LNa2EDTA和20mL含1%乙酸的乙腈,渦旋1min后,分別加入4.0g無(wú)水Na2SO4和1.0gNaCl,繼續(xù)渦旋1min,在4℃以8000r/min離心5min,取上清液備用。
吸取1mL上清液至預(yù)裝有30個(gè)底部直徑和高度分別為8和4mm的r-GO@MeS(6.0cm3/mL)的2mL針型過(guò)濾器中,反復(fù)“抽拉-擠壓”凈化5次后,濾液過(guò)0.22μmPTFE濾膜,進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。
1.2.4儀器分析條件
色譜條件:AgilentEclipsePlusC18RRHD色譜柱(100mm×2.1mm,1.8μm);流動(dòng)相A為含有5mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸和2%甲醇的水溶液,流動(dòng)相B為甲醇,梯度洗脫(0~2min,0%B;2~10min,0%~45%B;10~15min,45%~98%B;15~17min,98%B;17~17.1min,98%~0%B;17.1~20.1min,0%B);流速為0.3mL/min;進(jìn)樣體積為2μL;柱溫為45℃。
質(zhì)譜條件:電噴霧電離源,選擇正離子模式(ESI+),霧化氣流速為3L/min,干燥氣流速為10L/min,加熱氣流速為10L/min,加熱氣溫度500℃,掃描模式為多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。
2結(jié)果與討論
2.1UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化
在進(jìn)行液相色譜分離時(shí),流動(dòng)相組成會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果和色譜峰形有明顯影響。本研究采用梯度洗脫程序,分別使用水和甲醇作為色譜流動(dòng)相進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)添加少量甲酸(0.1%)可以防止部分化合物的色譜峰分叉或拖尾,達(dá)到改善峰形和穩(wěn)定保留時(shí)間的目的;此外,在流動(dòng)相中添加適量乙酸銨(5mmol/L)能夠增強(qiáng)部分目標(biāo)物的離子化效率。本研究最終選擇含5mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸與2%甲醇的水溶液和甲醇分別作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。
根據(jù)歐盟委員會(huì)第2002/657/EC號(hào)決議[33],陽(yáng)性樣品的確認(rèn)至少需要2對(duì)MRM離子對(duì)。分別將32種獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液依次注入質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測(cè),獲得化合物相應(yīng)的母離子;在MS/MS模式下使母離子裂解,選擇2個(gè)強(qiáng)度高的子離子,其中強(qiáng)度最高的子離子用于定量分析,另一個(gè)用于定性分析,通過(guò)優(yōu)化去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)等參數(shù)得到32種獸藥最優(yōu)的質(zhì)譜分析條件(見(jiàn)電子版文后支持信息表S1)。
2.2r-GO@MeS的表征
MeS是由三聚氰胺、甲醛和硫磺酸鈉共聚而成的多孔高分子材料,具有成本低、孔隙率和比面積大、機(jī)械穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)改變GO分散液濃度(0.25、0.50和1.00mg/mL),采用水熱還原法[31]制備了3種改性海綿r-GO@MeS-0.25%、r-GO@MeS-0.50%和r-GO@MeS-1.00%。采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察MeS改性前后的微觀形貌(圖1),改性前MeS骨架表面平滑齊整(圖1A和1B);改性后,r-GO@MeS-0.25%(圖1C和1D)、r-GO@MeS-0.50%(圖1E和1F)和r-GO@MeS-1.00%(圖1G和1H)均可以明顯地觀察到表面均勻覆蓋了GO片層。此外,當(dāng)r-GO濃度為0.50和1.00mg/mL時(shí),進(jìn)一步增加其加載量,過(guò)剩的GO片層相互堆疊而形成較大的片層,覆蓋于海綿纖維骨架邊緣及微孔處(圖1E和1H)。此外,r-GO@MeS-0.25%整體呈淺灰色,r-GO@MeS-0.50%呈深灰色,r-GO@MeS-1.00%呈深黑色,這應(yīng)與海綿表面的GO加載量相關(guān),與掃描電鏡觀察結(jié)果一致。將上述3種改性海綿分別置于水、甲醇和乙腈等常用提取溶劑中反復(fù)擠壓后,彈性良好,并未有明顯的GO脫落現(xiàn)象。此結(jié)果表明,所制備的r-GO@MeS性質(zhì)穩(wěn)定、彈性良好,可作為一種新型彈性凈化材料用于萃取液中復(fù)雜基質(zhì)的快速吸附。
2.3GO濃度的選擇
通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn),在同等條件下考察r-GO@MeS-0.25%、r-GO@MeS-0.50%和r-GO@MeS-1.00%對(duì)目標(biāo)獸藥回收率的影響。如圖2所示,3種r-GO@MeS基質(zhì)凈化效果良好,大部分獸藥的回收率均在80%~110%范圍內(nèi)。其中,采用r-GO@MeS-0.25%作為基質(zhì)吸附劑時(shí),恩諾沙星(ENR)、氨苯砜(DAP)、琥珀?;前粪邕颍⊿ST)和磺胺甲噁唑(SMZ)的回收率分別為79.2%、110.6%、112.6%和113.1%;采用r-GO@MeS-0.50%作為基質(zhì)吸附劑時(shí),奧比沙星(ORB)和SMZ的回收率為78.1%和111.7%;采用r-GO@MeS-1.00%作為基質(zhì)吸附劑時(shí),磺胺甲基嘧啶(SM1)和ORB、噁喹酸(OXA)和SST的回收率分別為66.4%、70.7%、114.2%和121.1%??傮w而言,當(dāng)采用r-GO@MeS-0.50%作為基質(zhì)吸附劑時(shí),回收率為80%~110%的獸藥數(shù)量相對(duì)較多。因此,后續(xù)研究選用r-GO@MeS-0.50%作為基質(zhì)凈化劑。
2.4MeS用量的優(yōu)化
凈化海綿的基質(zhì)吸附能力與海綿用量密切相關(guān)。理論上,增加海綿用量能夠增加r-GO@MeS的吸附位點(diǎn),提升其基質(zhì)凈化能力。以1mL待凈化提取液為研究對(duì)象,分別采用6、18、30和42個(gè)海綿凈化上述溶液,即料液比分別為1.2、3.6、6.0和8.4cm3/mL,比較了r-GO@MeS海綿用量對(duì)獸藥回收率總體分布的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示??傮w上,除磺胺氯吡嗪(SPZ)外,料液比對(duì)磺胺類獸藥回收率影響不大;而大部分喹諾酮類獸藥回收率隨著料液比增加而呈明顯下降趨勢(shì)。此外,當(dāng)料液比為1.2和3.6cm3/mL時(shí),回收率高于120%的獸藥分別有3種(SPZ,128.3%;ENR,133.1%;二氟沙星(DIF),122.1%)和2種(SPZ,128.9%;DIF,121.1%);當(dāng)料液比提高到8.4cm3/mL時(shí),部分喹諾酮類獸藥ORB、萘啶酸(NA)、DIF、氟甲喹(FLU)和西諾沙星(CIN)的回收率顯著降低,特別是CIN的回收率降至70%以下;當(dāng)料液比為6.0cm3/mL時(shí),所監(jiān)測(cè)獸藥回收率(77.0%~118.1%)均處于可接受區(qū)間內(nèi)。因此,后續(xù)研究選用料液比為6.0cm3/mL。
2.5凈化模式的選擇
MeS具有良好的彈性和機(jī)械性能,能夠通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)提取液中干擾基質(zhì)的凈化:(1)通過(guò)靜置使干擾基質(zhì)以自由擴(kuò)散形式到達(dá)吸附海綿表面的靜態(tài)凈化模式,其基質(zhì)凈化效果與靜置時(shí)間相關(guān);(2)通過(guò)反復(fù)“浸潤(rùn)-擠壓”以加速渦流擴(kuò)散形式到達(dá)吸附海綿表面的動(dòng)態(tài)凈化模式,其基質(zhì)凈化效果與擠壓次數(shù)相關(guān)??疾靸煞N凈化模式下不同靜置時(shí)間和擠壓次數(shù)對(duì)獸藥回收率的影響:(1)靜態(tài)模式(1、5和10min);(2)動(dòng)態(tài)模式(5、10和15次)。結(jié)果如圖4所示,可見(jiàn)隨靜置時(shí)間和擠壓次數(shù)增加,部分喹諾酮類藥物的回收率逐漸降低。例如,當(dāng)靜置時(shí)間達(dá)到10min時(shí),ENR的回收率降至40%以下;當(dāng)擠壓次數(shù)為15次時(shí),OXA的回收率降至60%以下。這可能與ENR和OXA等喹諾酮類獸藥分子中較大的共軛平面結(jié)構(gòu)相關(guān),延長(zhǎng)靜置時(shí)間和增加擠壓次數(shù)均能夠增強(qiáng)其與改性海綿表面GO片層之間的吸附作用,從而導(dǎo)致其回收率降低。當(dāng)靜置時(shí)間分別為1、5和10min時(shí),所監(jiān)測(cè)獸藥回收率分別為45.8%~106.8%、47.5%~106.7%和32.2%~112.6%;當(dāng)擠壓次數(shù)分別為5、10和15次時(shí),所監(jiān)測(cè)獸藥回收率分別為72.5%~116.6%、65.8%~113.4%和57.2%~115.8%。
比較而言,動(dòng)態(tài)擠壓5次和10次時(shí)所得回收率均處于可接受的范圍(60%~120%)內(nèi),均能滿足獸藥多殘留的檢測(cè)要求。但是,動(dòng)態(tài)擠壓5次時(shí),回收率處于80%~120%的化合物數(shù)量更多且凈化速度更快。因此,后續(xù)研究選擇動(dòng)態(tài)擠壓5次作為基質(zhì)凈化模式。
2.6方法驗(yàn)證
2.6.1方法的基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限及定量限
質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行電噴霧離子化時(shí)離子信號(hào)強(qiáng)度易受到樣品溶液中共存基質(zhì)的干擾。為檢驗(yàn)本方法的基質(zhì)效應(yīng)(ME,%),分別構(gòu)建了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式為:其中,ka為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,kb為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME在?20%~+20%范圍時(shí),認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不顯著;MEgt;+20%表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);MElt;?20%表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。本研究中各獸藥的基質(zhì)效應(yīng)均在?7.8%~+18.9%范圍內(nèi),表明r-GO@MeS在雞蛋獸藥多殘留凈化過(guò)程中具有良好的基質(zhì)凈化效果。盡管如此,本研究仍采用基質(zhì)匹配曲線以獲得更準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果。
配制32種獸藥的基質(zhì)加標(biāo)溶液,分別以目標(biāo)藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表1所示,32種獸藥線性關(guān)系良好,線性范圍為5~200μg/kg,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。分別根據(jù)信噪比(S/N)≥3和S/N≥10確定方法的檢出限(LODs)和定量限(LOQs),32種獸藥的檢出限為0.2~10.2μg/kg,定量限為0.6~28.0μg/kg,表明本方法具有良好的靈敏度。
2.6.2準(zhǔn)確性及精密度
分別在3個(gè)加標(biāo)水平(10、100和150μg/kg)下通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確性??紤]到部分獸藥定量限較高(≥10μg/kg),因此,磺胺二甲基異噁唑(SSX)、SPZ、磺胺苯吡唑(SPP)、SST、FLU和柱晶白霉素(KIT)的低濃度加標(biāo)水平選為20μg/kg;磺胺胍(SGD)的低濃度加標(biāo)水平選為30μg/kg,目標(biāo)藥物在低加標(biāo)濃度下對(duì)應(yīng)譜圖見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1。通過(guò)日內(nèi)重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)(重復(fù)6次)和日間重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)(連續(xù)3d,每天重復(fù)3次)考察方法的精密度,其中,日內(nèi)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平(10~150μg/kg)下進(jìn)行,日間重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)在中等濃度加標(biāo)水平(100μg/kg)下進(jìn)行。所有獸藥的回收率均在66.5%~117.5%之間,日內(nèi)RSDlt;13.3%,日間RSDlt;16.3%,表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度(電子版文后支持信息表S2)。
2.6.3方法性能比較
與文獻(xiàn)報(bào)道的雞蛋中獸藥多殘留檢測(cè)方法相比(表2),本方法的基質(zhì)分離過(guò)程可在數(shù)秒內(nèi)通過(guò)快速的“浸潤(rùn)-擠壓”過(guò)程便捷實(shí)現(xiàn),無(wú)需離心、磁場(chǎng)輔助、上樣、淋洗、洗脫、氮吹和濃縮等復(fù)雜過(guò)程,縮短了樣品前處理時(shí)間,提升了操作便捷度,并且具有良好的回收率以及較低的基質(zhì)效應(yīng)和定量限,結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)雞蛋中獸藥多殘留進(jìn)行定性和定量分析。
2.7實(shí)際樣品分析
72份雞蛋樣品分別購(gòu)自國(guó)內(nèi)8個(gè)城市,利用本方法進(jìn)行檢測(cè)分析,共檢出陽(yáng)性樣品4份,所檢出獸藥殘留分別為SD、SQZ、DIF和JOS。上述檢出藥物中,SD殘留濃度較高(15.4μg/kg),其余3種檢出獸藥殘留濃度較低,均在定量限以下。
3結(jié)論
建立了一種基于r-GO@MeS的改良QuEChERS方法,考察了GO加載量、料液比及凈化模式對(duì)獸藥回收率的影響,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù),實(shí)現(xiàn)了雞蛋中32種獸藥殘留的靈敏檢測(cè)。本方法基質(zhì)凈化過(guò)程方便、快捷,通過(guò)快速擠壓即可在數(shù)秒內(nèi)完成對(duì)干擾基質(zhì)的分離與凈化。本方法具有較低的基質(zhì)效應(yīng)、良好的線性關(guān)系、較高的準(zhǔn)確性和精密度以及較低的檢出限和定量限。r-GO@MeS用于基質(zhì)凈化不僅為動(dòng)物源食品獸藥多殘留的快速檢測(cè)提供了新的分析策略,也為彈性多孔吸附材料在樣品前處理方面的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。