3D打印制備復(fù)雜截面慣性流道及微粒慣性聚焦特性研究

關(guān)鍵詞微流控；3D打??；復(fù)雜截面；慣性聚焦；二次流調(diào)控

生物微粒（如細(xì)胞和細(xì)菌等）操控在分析化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有重要的研究?jī)r(jià)值，在單細(xì)胞質(zhì)譜分析和腫瘤檢測(cè)等方面具有重要的應(yīng)用前景[1-2]。作為一種高效的微粒操控手段，基于微流控芯片的微粒操控技術(shù)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，包括基于電、磁、聲和光等物理場(chǎng)的主動(dòng)式操控技術(shù)（如介電泳[3]、磁泳[4]、聲鑷[5]和光鑷[6]等）、基于微流道特殊結(jié)構(gòu)的被動(dòng)式操控技術(shù)（如確定性側(cè)向位移[7]、微阻隔過(guò)濾[8]和慣性操控[9]等）以及主動(dòng)與被動(dòng)糅合的操控技術(shù)[10]。主動(dòng)式技術(shù)對(duì)微粒具有較好的可控性和控制精度，但樣品處理通量較低且操作過(guò)程較復(fù)雜。被動(dòng)式技術(shù)的操控通量和精度較高且無(wú)需外場(chǎng)，因此具有更好的集成優(yōu)勢(shì)。其中，慣性操控技術(shù)利用流體慣性效應(yīng)使微粒受慣性力遷移實(shí)現(xiàn)精確操控，具有高通量和操作便捷等優(yōu)勢(shì)，在處理大體積樣品中的生物微粒時(shí)具有明顯優(yōu)勢(shì)[11]。

慣性微流控技術(shù)最早由DiCarlo等[12]于2007年提出，經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展已開(kāi)發(fā)出多種流道結(jié)構(gòu)的慣性微流控芯片。在各類慣性流道中，矩形截面流道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制作方便，研究最為廣泛。微粒在矩形截面直流道中受到流道壁面和流體剪切梯度共同誘導(dǎo)的慣性升力作用，聚焦在流道長(zhǎng)邊附近的中心線上[13]。將直流道改為彎流道，流道會(huì)產(chǎn)生二次流，粒子受慣性升力的同時(shí)還受二次流曳力影響，據(jù)此可以調(diào)整粒子的聚焦平衡位置[14]。除矩形截面流道外，一些學(xué)者研究了異形截面流道中粒子的慣性聚焦效應(yīng)，如梯形[15]、半橢圓形[16]、半圓形[17]和三角形[18]等。其中，梯形截面彎流道可產(chǎn)生偏置二次流，使粒子受增強(qiáng)的二次流曳力作用實(shí)現(xiàn)精確分離[19]。目前，矩形和梯形流道已廣泛應(yīng)用于各類生物細(xì)胞操控，例如從血液中分離癌細(xì)胞[20]、白細(xì)胞[21]和血漿[22]等。除上述流道外，Rafeie等[23]報(bào)道了組合形截面的慣性流道，通過(guò)將兩種及以上不同截面結(jié)構(gòu)的慣性流道組合為更復(fù)雜的流道，可綜合利用各獨(dú)立截面流道對(duì)微粒的慣性聚焦效果，使微粒聚焦位置更加多樣化。然而，組合形流道結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，目前報(bào)道的方法僅能通過(guò)超精密微銑加工的方式制作該類流道，而微銑加工對(duì)機(jī)床精度和穩(wěn)定性要求極高，加工成本高昂；此外，由于組合形流道鮮有報(bào)道，因此微粒在該類流道中的慣性聚焦機(jī)理仍需深入研究。

本研究采用面投影光固化三維（3D）打印的加工方法，通過(guò)結(jié)合常規(guī)的聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模復(fù)刻技術(shù)，可制備高精度的組合形截面微流道?；谏鲜黾庸し椒?，研制了三階梯和五階梯截面螺旋流道慣性微流控芯片，并研究了不同尺寸粒子在階梯形流道中的運(yùn)動(dòng)過(guò)程及聚焦行為，解析了粒子的慣性聚焦遷移機(jī)理。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

XFP01-BD注射泵（蘇州訊飛科學(xué)儀器有限公司）；XDS-3倒置熒光顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）；StingrayF-033B/C高速CCD相機(jī)（德國(guó)AlliedVisionTechnologies公司）；PDC-MG等離子清洗機(jī)（成都銘恒科技發(fā)展有限公司）；nanoArch?S140微納3D打印系統(tǒng)（深圳摩方新材料科技有限公司）；ADSM301電子顯微鏡（深圳安東星科技有限公司）。

PDMS（美國(guó)道康寧公司）；聚苯乙烯熒光微球（直徑6μm和10μm，天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心），用于模擬生物細(xì)胞（如紅細(xì)胞和白細(xì)胞）；Tween20、無(wú)水乙醇和異丙醇（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；HTL耐高溫樹(shù)脂（深圳摩方新材料科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1階梯形截面流道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

兩種階梯形截面慣性流道的主體結(jié)構(gòu)均為螺旋線形（圖1A），具有1個(gè)入口和2個(gè)出口。兩種流道的主要區(qū)別在于截面尺寸不同，如圖1B和1C所示，流道截面均為階梯形，但階梯數(shù)量不同，分別為3個(gè)和5個(gè)階梯。兩種流道的內(nèi)壁高度均小于外壁高度，流道詳細(xì)尺寸參數(shù)分別見(jiàn)表1和表2。設(shè)計(jì)流道尺寸參數(shù)時(shí)，主要依據(jù)微粒慣性聚焦要求、慣性升力和迪恩曳力相關(guān)計(jì)算公式，對(duì)螺旋流道的起始內(nèi)圈半徑、流道總寬度、流道內(nèi)圈和外圈高度、階梯寬度和高度、流道圈數(shù)以及流道間隔等參數(shù)進(jìn)行設(shè)計(jì)。此外，流道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度和流道加工的可行性也需要綜合考慮。

1.2.2微流控芯片制備工藝

微流控芯片制備工藝流程如圖2所示，主要包括流道結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、流道陽(yáng)模制作、模具表面處理和PDMS倒模鍵合4個(gè)關(guān)鍵步驟。首先，在SoildWorks軟件中創(chuàng)建流道3D結(jié)構(gòu)模型，將其輸出為STL格式文件。接著，將STL文件導(dǎo)入3D打印機(jī)，對(duì)模型進(jìn)行添加支撐和切片操作，利用紫外光使液態(tài)HTL樹(shù)脂固化。為實(shí)現(xiàn)流道的高精度和快速打印成型，對(duì)模型正常層設(shè)置10μm切片厚度和1s曝光時(shí)間，對(duì)底層設(shè)置50μm切片厚度和2s曝光時(shí)間。對(duì)固化成形的流道陽(yáng)模進(jìn)行表面處理，采用異丙醇充分清洗陽(yáng)模。為確保消除模具表面未固化的材料，將模具放入無(wú)水乙醇中浸泡2h。為提升模具的脫模性能，將模具放入氧等離子清洗機(jī)中輝光照射2min。最后，采用PDMS倒模復(fù)刻技術(shù)制備微流控芯片，主要包括PDMS澆鑄、脫氣、固化、脫模、切割、打孔和鍵合等步驟，鍵合后得到完備的PDMS芯片。

1.2.3微粒慣性操控實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建

為研究階梯形流道中粒子慣性聚焦行為，搭建了粒子慣性操控與運(yùn)動(dòng)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。首先，將微流控芯片入口用特氟龍管與裝有聚苯乙烯微球懸浮液的30mL注射器相連接，并將注射器裝載于精密注射泵上，芯片出口與離心管連接。將微流控芯片固定于倒置的熒光顯微鏡工作臺(tái)上，利用高速CCD、熒光發(fā)射模塊和10×物鏡拍攝流道出口附近直流道處粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡。相機(jī)控制軟件VimbaViewer設(shè)置曝光時(shí)間為500ms或更高，拍攝100張圖像。最后，將圖像序列在ImageJ軟件中進(jìn)行疊加處理和分析。為定量表征粒子的聚焦效果，利用ImageJ軟件獲取沿流道寬度方向上的熒光強(qiáng)度數(shù)值，并繪制粒子的歸一化熒光強(qiáng)度曲線。

1.2.4階梯形流道二次流數(shù)值建模

為便于解析階梯形流道中粒子慣性聚焦機(jī)理，采用多物理場(chǎng)仿真軟件COMSOLMultiphysics?對(duì)階梯形截面螺旋流道進(jìn)行3D數(shù)值建模，研究3D流道中的二次流場(chǎng)分布。由于螺旋流道的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，為簡(jiǎn)化模型，僅建立了半圈的彎曲流道模型，三階梯和五階梯流道模型的半徑均為6.5mm。流道模型采用層流模塊，流體離散化設(shè)置為P2+P2（二階速度+二階壓力），流道壁面定義為無(wú)滑移邊界。流道中的液體為納維-斯托克斯不可壓縮流體，流體材料設(shè)置為水，密度為1000kg/m3，動(dòng)力粘度為0.001Pa·s。流道的入口流速設(shè)置為0.43m/s，出口壓力設(shè)置為0。采用精細(xì)化的四面體網(wǎng)格劃分模型，通過(guò)計(jì)算模型得到階梯形流道截面中的二次流場(chǎng)及流速分布。

2結(jié)果與討論

2.13D打印微流控芯片質(zhì)量

3D打印流道陽(yáng)模實(shí)物如圖3A～3C所示，可見(jiàn)流道表面幾乎呈鏡面，無(wú)毛刺和樹(shù)脂殘留物黏連。用刀片將PDMS芯片沿流道正截面切開(kāi)，并置于顯微鏡下觀測(cè)，階梯形截面如圖3D和3E所示。對(duì)比兩種流道截面輪廓，發(fā)現(xiàn)三階梯流道截面的輪廓線平行度和垂直度較好，水平和垂直方向的尺寸誤差分別為±10μm和±6μm。五階梯流道截面的垂直度稍差，水平和垂直方向的尺寸誤差分別為±20μm和±10μm。微流控芯片實(shí)物如圖3F所示，芯片流道中填充了藍(lán)墨水，可以直觀表現(xiàn)微流道的平面結(jié)構(gòu)?？傮w而言，3D打印加工復(fù)雜階梯形微流道的質(zhì)量較好，可滿足后續(xù)粒子慣性操控實(shí)驗(yàn)要求。

2.2微粒慣性聚焦原理

微尺度直流道中粒子雷諾數(shù)Re≥1時(shí)，靠近流道壁的粒子會(huì)受到遠(yuǎn)離壁面方向的壁面升力FLW作用，同時(shí)粒子還受到指向壁面方向的剪切梯度升力FLS的作用（圖4）。當(dāng)粒子直徑滿足慣性聚焦要求（a/Dh≥0.07，a為粒子直徑，Dh為流道水力直徑）[12]時(shí)，粒子所受的凈慣性升力FL大于粒子所受到的流體粘性力，粒子慣性聚焦至流道內(nèi)的某一平衡位置。粒子所受的凈慣性升力FL按公式（1）和（2）計(jì)算[24]：

式中，ρ為流體密度，Um為流體最大速度，fL為升力系數(shù)（取決于流道雷諾數(shù)Re和粒子在流道橫截面內(nèi)的位置Xp），μ為流體動(dòng)力粘度。

粒子處于彎流道內(nèi)時(shí)，彎流道中心區(qū)域與近壁面區(qū)域流體流速不匹配，產(chǎn)生二次流，使流體在流道截面上產(chǎn)生兩個(gè)對(duì)稱旋轉(zhuǎn)的漩渦，該現(xiàn)象即為Dean流效應(yīng)。Dean流的大小可以采用無(wú)量綱參數(shù)De來(lái)表示（式（3））[24]：

式中，R為流道的起始半徑。若流體遵循斯托克斯定律，則粒子在彎流道中所受的Dean曳力FD的計(jì)算公式（式（4））近似為[24]：

式中，UD為Dean流速。當(dāng)Dean曳力遠(yuǎn)大于慣性升力時(shí)，粒子忽略慣性升力影響隨Dean流運(yùn)動(dòng)。當(dāng)Dean曳力遠(yuǎn)小于慣性升力時(shí)，粒子幾乎不受Dean流影響，將慣性聚焦至流道內(nèi)的平衡位置。當(dāng)Dean曳力與慣性升力處于同一量級(jí)時(shí)，粒子在流道內(nèi)的聚焦位置可通過(guò)調(diào)節(jié)Dean流的強(qiáng)度進(jìn)行精確控制。

2.3微粒慣性操控實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1三階梯流道中粒子慣性聚焦效應(yīng)

配制微粒懸浮液，將10μm和6μm粒子原液分別加入到去離子水中，再各加入質(zhì)量濃度為0.5%的Tween20，以降低粒子團(tuán)聚及黏附于流道壁面的現(xiàn)象。配制得到的10μm粒子懸浮液的濃度約為105particle/mL，6μm粒子懸浮液的濃度約為106particle/mL。

圖5顯示了三階梯流道出口處粒子的聚焦遷移熒光軌跡，粒子進(jìn)樣流量均為0.1～1.8mL/min，流量增量為0.1mL/min，流量對(duì)應(yīng)的迪恩數(shù)De為0.8～14.4。對(duì)10μm粒子的熒光軌跡進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)粒子在低流量（De=0.8）時(shí)主要分布于流道外側(cè)（階梯Ⅰ和Ⅱ的交界處）。隨著流量逐步增大，粒子逐漸聚焦并向流道內(nèi)壁面方向移動(dòng)。當(dāng)De=4時(shí)，大部分粒子已聚焦在流道中心附近。隨著流量的繼續(xù)加大（De=6.4～14.4），粒子聚焦效果變得更好，并且大部分粒子已在內(nèi)壁面附近形成聚焦粒子束。值得注意的是，有部分粒子在階梯Ⅱ的內(nèi)壁面處形成了單列聚焦，另有少量粒子在階梯Ⅰ的內(nèi)壁面處形成單列聚焦，最終呈現(xiàn)出三平衡位置聚焦現(xiàn)象。10μm粒子的規(guī)格化熒光強(qiáng)度曲線如圖6A所示，當(dāng)De值較低時(shí)（De=1.6），粒子束具有一個(gè)靠近流道外壁面的聚焦峰。當(dāng)De值分別增大至3.2、6.4和11.2時(shí)，粒子束均具有2個(gè)明顯的聚焦峰，并且聚焦峰位置逐步向流道內(nèi)壁移動(dòng)。從插圖中的明場(chǎng)粒子軌跡可知，De值分別為1.6和11.2時(shí)粒子的聚焦?fàn)顩r很好地佐證了上述結(jié)論。此外，階梯Ⅰ內(nèi)粒子聚焦束在熒光強(qiáng)度曲線中無(wú)聚焦峰存在，原因在于該位置處粒子數(shù)量極少，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度較弱。

與10μm粒子相比，6μm粒子的慣性聚焦行為有所不同。在低流量（De≤1.6）時(shí)，大部分6μm粒子分散于外側(cè)流道中。當(dāng)流量逐漸增大時(shí)，粒子分別在3個(gè)階梯的內(nèi)壁面附近形成3個(gè)穩(wěn)定的聚焦位置（De=4.8～8.8）。其中，階梯Ⅱ處的粒子聚焦束熒光強(qiáng)度最高，表明大多數(shù)粒子聚焦于該位置。階梯Ⅲ處的粒子束熒光強(qiáng)度略高于階梯Ⅰ處，表明聚焦在流道內(nèi)壁附近的粒子數(shù)略多于流道外壁面。隨著流量進(jìn)一步增大（De=9.6～14.4），之前聚焦于流道內(nèi)壁附近的粒子逐漸消失，而聚焦于流道外壁附近的粒子則逐漸增加，表現(xiàn)為外壁面附近的粒子束熒光強(qiáng)度增加。圖6B中6μm粒子歸一化熒光強(qiáng)度曲線也很好地驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)，隨著De值從低到高增大時(shí)，聚焦粒子束的熒光峰從2個(gè)變?yōu)?個(gè)，最后再變?yōu)?個(gè)。

由仿真結(jié)果可知，內(nèi)壁面階梯Ⅲ中的二次流最弱，外壁面階梯Ⅰ中的二次流最強(qiáng)，因此低流量時(shí)10和6μm粒子均受主導(dǎo)的強(qiáng)迪恩曳力作用，隨二次流在外側(cè)流道附近來(lái)回旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，呈分散狀分布。隨著流量的增大，粒子所受的慣性升力逐漸與迪恩曳力平衡，表現(xiàn)為粒子逐漸聚焦并向流道內(nèi)壁面方向移動(dòng)。由于三階梯流道中存在3對(duì)相對(duì)獨(dú)立的二次流旋渦，每個(gè)階梯中的二次流旋渦均對(duì)粒子造成了一定的束縛作用，因此導(dǎo)致粒子具有3個(gè)慣性聚焦平衡位置。由于10μm粒子尺寸較大，所受的慣性升力也較大，因此絕大部分10μm粒子聚焦在流道內(nèi)壁面附近。6μm粒子所受的慣性升力較小，因此內(nèi)壁面處的粒子受強(qiáng)迪恩曳力作用被拖拽至階梯Ⅱ和Ⅲ中，最終形成了2個(gè)聚焦平衡位置。

2.3.2五階梯流道中粒子慣性聚焦效應(yīng)

圖7A顯示了10μm粒子在五階梯流道中的熒光運(yùn)動(dòng)軌跡，粒子進(jìn)樣流量設(shè)為0.1～1.2mL/min，流量增量為0.1mL/min，流量對(duì)應(yīng)的De=0.7～8.0?；诹Ｗ釉诹鞯乐械木劢剐袨?，可將粒子聚焦過(guò)程大體分為單平衡位置聚焦和雙平衡位置聚焦兩個(gè)階段。當(dāng)De值在0.7～2.0范圍內(nèi)時(shí)，粒子在階梯Ⅱ中處于單平衡位置聚焦階段，并且隨流量增大，聚焦粒子束緩慢向內(nèi)側(cè)流道遷移。當(dāng)流量進(jìn)一步增大時(shí)（De=2.7～5.4），大部分粒子快速進(jìn)入階梯Ⅳ中，而小部分粒子的遷移速度較慢，從而產(chǎn)生明顯的雙平衡聚焦?fàn)顟B(tài)。當(dāng)流量較高時(shí)（Degt;6），聚焦粒子束逐漸分散。6μm粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡如圖7B所示，6μm粒子在所有流量范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出了雙平衡位置聚焦?fàn)顟B(tài)，并且粒子聚焦位置靠近流道外側(cè)。隨著流量增大，部分粒子的聚焦位置緩慢向流量?jī)?nèi)壁移動(dòng)。圖7C和7D分別顯示了10μm和6μm粒子的歸一化熒光強(qiáng)度曲線。隨著De值不斷增大，10μm粒子束的聚焦峰從1個(gè)變?yōu)?個(gè)，并且2個(gè)聚焦峰的位置逐步向流道內(nèi)壁移動(dòng)。6μm粒子束具有2個(gè)聚焦峰，但聚焦峰位置隨De值變化較小。

由仿真圖可知，階梯Ⅰ和階梯Ⅱ中共存一對(duì)非對(duì)稱的二次流旋渦，其它3個(gè)階梯中存在3對(duì)相對(duì)獨(dú)立的二次流旋渦。由于外側(cè)流道的二次流強(qiáng)度遠(yuǎn)大于內(nèi)側(cè)流道，因此絕大多數(shù)粒子在低流量時(shí)被束縛于外側(cè)流道中。考慮到慣性升力與流道水力直徑的平方成反比，粒子在五階梯流道中受到的慣性升力遠(yuǎn)大于三階梯流道，因此10μm粒子在低流量時(shí)的慣性升力即可與迪恩曳力達(dá)到平衡，從而實(shí)現(xiàn)單束聚焦。隨著流量增大，10μm粒子所受的慣性升力逐漸大于迪恩曳力，使得大部分粒子向階梯Ⅲ遷移，小部分粒子則受外側(cè)強(qiáng)二次流束縛仍然保持在階梯Ⅱ中的平衡位置。在高流量時(shí)，由于整個(gè)流道中的二次流顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致10μm聚焦粒子束受二次流擾動(dòng)產(chǎn)生一定的分散性。與10μm粒子相比，6μm粒子由于尺寸小，所受慣性升力較小，因此在低流量時(shí)受迪恩曳力作用隨二次流在外側(cè)流道中作散亂運(yùn)動(dòng)。在高流量時(shí)，一部分6μm粒子受增強(qiáng)的慣性升力進(jìn)入階梯Ⅲ中，另一部分粒子則被階梯Ⅱ中的強(qiáng)二次流所束縛，從而產(chǎn)生2個(gè)穩(wěn)定的聚焦位置。

綜上所述，三階梯和五階梯流道中二次流漩渦的數(shù)量、形態(tài)和強(qiáng)度顯著不同。通過(guò)改變流道截面形狀，可顯著改變二次流特性，最終改變流道中粒子的慣性聚焦平衡位置和聚焦粒子束數(shù)量。

3結(jié)論

提出了面投影微立體光刻3D打印制作復(fù)雜階梯形截面慣性流道的加工方法，研制了高精度的三階梯和五階梯截面螺旋流道慣性微流控芯片。針對(duì)上述兩種階梯形流道，開(kāi)展了粒子慣性操控實(shí)驗(yàn)研究，并結(jié)合仿真結(jié)果解析了10μm和6μm粒子在流道中的慣性聚焦遷移機(jī)理。在三階梯流道中，10μm粒子主要聚焦在流道內(nèi)壁面附近，少量粒子單束聚焦在流道中心和流道外壁面處，6μm粒子則聚焦在流道中心和外壁面處的2個(gè)平衡位置。在五階梯流道中，10μm和6μm粒子均出現(xiàn)雙平衡位置聚焦現(xiàn)象。其中，10μm粒子的2個(gè)聚焦平衡位置隨著流量增大逐步向內(nèi)壁面遷移；而6μm粒子的平衡位置變化不大。綜上，階梯形截面流道中存在多對(duì)二次流漩渦，通過(guò)調(diào)整階梯形狀，顯著改變了二次流的數(shù)量、形態(tài)和強(qiáng)度，使粒子在流道中具有多個(gè)聚焦平衡位置。本研究成果有助于進(jìn)一步拓展慣性微流控理論，為生物細(xì)胞精準(zhǔn)慣性操控提供新的思路，促進(jìn)慣性微流控技術(shù)在分析化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的發(fā)展。