數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及其在疾病檢測(cè)中的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；微流控芯片；疾病診斷；單分子檢測(cè)；評(píng)述

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和需求的多樣化，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction，PCR）的各種衍生核酸分析技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[1]。1992年，Higuchi等[2]提出實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativePCR，qPCR）的設(shè)想。qPCR通過在PCR反應(yīng)體系中引入熒光探針，可實(shí)現(xiàn)未知模板的相對(duì)定量分析，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和食品檢測(cè)等領(lǐng)域。但qPCR定量分析的準(zhǔn)確性會(huì)受到樣品擴(kuò)增效率和抑制劑等因素的影響，并且需要采用核酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，無法實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量分析，制約了其臨床應(yīng)用[3]。1999年，Vogelstein和Kinzler[4]首次提出數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Digitalpolymerasechainreaction，dPCR）的概念，將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)換成線性的數(shù)字信號(hào)，可不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線而直接實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的絕對(duì)定量分析。因dPCR具有單分子擴(kuò)增、可直接絕對(duì)定量分析和對(duì)抑制劑耐受性高等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤液體活檢和感染性疾病診斷等領(lǐng)域[5-8]。本文綜述了近年來dPCR技術(shù)在檢測(cè)精度、多重檢測(cè)和檢測(cè)速度等方面的研究進(jìn)展，介紹了dPCR在腫瘤和感染性疾病檢測(cè)等領(lǐng)域的相關(guān)研究，討論了其作為一種新興核酸分子檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的技術(shù)挑戰(zhàn)；最后，結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用深入討論了dPCR技術(shù)在發(fā)展過程中面臨的難題與機(jī)遇，并探討了其未來發(fā)展前景。

1dPCR技術(shù)概述

1.1dPCR技術(shù)原理

dPCR是基于單分子擴(kuò)增和反應(yīng)體系分割的一種核酸分子絕對(duì)定量分析技術(shù)。該技術(shù)將包含有引物、緩沖液、酶和模板DNA分子等組分的PCR反應(yīng)體系隨機(jī)分配到許多微小且獨(dú)立的反應(yīng)單元中進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)單元中可能包含有零個(gè)、一個(gè)或多個(gè)模板DNA分子[9-10]。PCR循環(huán)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，根據(jù)熒光信號(hào)的有無將反應(yīng)單元分別定義為陽性和陰性，最終根據(jù)泊松分布原理及陽性反應(yīng)單元的個(gè)數(shù)和比例，計(jì)算出模板DNA分子的起始拷貝數(shù)（圖1）[11]。

當(dāng)原始體系中模板DNA濃度較低，并且獨(dú)立反應(yīng)單元數(shù)量足夠多時(shí)，每個(gè)反應(yīng)單元理論上最多只含有一個(gè)模板DNA分子，通過統(tǒng)計(jì)陽性反應(yīng)單元數(shù)目即可確定DNA模板的起始拷貝數(shù)。但是，在通常情況下，部分反應(yīng)單元中可能含有兩個(gè)或兩個(gè)以上DNA分子，在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)需通過泊松分布概率公式對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正[12-13]：

其中，P（x=k）是確定觀察到k目標(biāo)分子的概率，λ是每個(gè)反應(yīng)單元內(nèi)平均目標(biāo)分子數(shù)，k是反應(yīng)單元內(nèi)實(shí)際存在的目標(biāo)分子數(shù)。由于dPCR技術(shù)采用終點(diǎn)熒光檢測(cè)和分子計(jì)數(shù)方式計(jì)算目的序列的拷貝數(shù)，無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算反應(yīng)的擴(kuò)增效率等繁瑣步驟，較傳統(tǒng)PCR技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度。

1.2dPCR技術(shù)的分類

根據(jù)樣品分散方式不同，dPCR可分為兩大類。（1）基于油包水技術(shù)的微滴式dPCR（DropletdPCR，ddPCR） ddPCR是將PCR反應(yīng)體系在微滴發(fā)生芯片中制備成數(shù)以萬計(jì)的油包水微滴（nL～pL），DNA模板在單個(gè)微滴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終通過微滴讀數(shù)儀讀取每個(gè)液滴內(nèi)的終點(diǎn)熒光并進(jìn)行分析，得出初始拷貝數(shù)[14]。ddPCR反應(yīng)體系較微孔板和微陣列系統(tǒng)更簡(jiǎn)單、體積更小，易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，是目前較理想的dPCR技術(shù)平臺(tái)[15]。（2）基于微流控芯片的芯片式dPCR（ChipdPCR，cdPCR） cdPCR主要采用超高密度親疏水微孔芯片和微陣列芯片作為反應(yīng)載體，依靠微流控通道實(shí)現(xiàn)樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)[16]。cdPCR各個(gè)反應(yīng)單元之間的影響較小，避免了交叉污染，具有更高的穩(wěn)定性，尤其適用于單拷貝變異檢測(cè)、稀有異常序列檢測(cè)和測(cè)序等[17]。但是，cdPCR成本高、檢測(cè)通量低、操作較繁瑣。

2dPCR技術(shù)發(fā)展歷程

自dPCR技術(shù)提出至今，研究人員在檢測(cè)精度、多重檢測(cè)和檢測(cè)速度等關(guān)鍵問題上進(jìn)行了系列技術(shù)更新迭代（圖2）。首先，檢測(cè)精度主要與樣品分散和讀取方式等因素有關(guān)，其中，樣品分散方式占主導(dǎo)作用，包括反應(yīng)單元數(shù)量與體積等。從最早期的96或384單元，到如今已經(jīng)將微反應(yīng)體系縮小至納升或皮升級(jí)別，樣品高效均勻分散，顯著提升了檢測(cè)精度。例如，目前廣泛應(yīng)用的Bio-radQX200dPCR系統(tǒng)利用流動(dòng)聚焦結(jié)構(gòu)可將樣品分散為約20000個(gè)大小均一的納升級(jí)微滴。相較于傳統(tǒng)方法，流動(dòng)聚焦法受力更均勻，微滴尺寸均一性更好，進(jìn)而將dPCR技術(shù)的靈敏度提升至單拷貝水平，為基因突變和單細(xì)胞分析等領(lǐng)域的研究提供了高效、可靠的技術(shù)平臺(tái)。但是，該平臺(tái)的流動(dòng)聚焦結(jié)構(gòu)需要精確控制分散相和連續(xù)相的流速。近年來，階梯乳化技術(shù)已成為一種可靠的樣品分散技術(shù)，可借助界面張力驅(qū)動(dòng)微滴生成，不涉及剪切力的作用，所以微滴的大小與分散相和連續(xù)相的流速無關(guān)，確保微滴更均勻[18]。Nie等[19]采用階梯乳化技術(shù)開發(fā)了基于高通量微流控芯片的dPCR技術(shù)，可同時(shí)驅(qū)動(dòng)8個(gè)通道生成液滴，并在U形腔室中自組裝成單層液滴陣列，每個(gè)腔室可容納約10000個(gè)體積為0.35nL的微滴。將該技術(shù)應(yīng)用于HER2拷貝數(shù)變異分析，其平行檢測(cè)結(jié)果與商用dPCR平臺(tái)的結(jié)果一致。最近，賽默飛世爾公司推出的AppliedBiosystemsTMQuantStudioTMAbsoluteQTMdPCR系統(tǒng)采用微流體陣列技術(shù)，可在20480個(gè)納米級(jí)微孔中生成95%以上有效反應(yīng)微滴，最大限度地減少每次反應(yīng)的樣本損失，顯著提高了檢測(cè)精度。dPCR的信號(hào)讀取是影響檢測(cè)精度的另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)微液滴直徑介于10～100μm之間，并且陽性與陰性微液滴之間的熒光信號(hào)對(duì)比度偏低時(shí)，傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)技術(shù)難以分辨。Zhu等[20]采用準(zhǔn)共聚焦式熒光流式技術(shù)構(gòu)建了新型微液滴讀取儀，極大地提高了陽性與陰性微滴間的信號(hào)對(duì)比度，顯著提升了檢測(cè)精度，相對(duì)誤差小于5%。此外，采用顯微圖像檢測(cè)法進(jìn)行熒光采集，液滴破裂概率更低，精度更高。但是，受限于龐大的液滴數(shù)量與熒光強(qiáng)度異質(zhì)性，當(dāng)面臨多靶標(biāo)檢測(cè)時(shí)，常規(guī)圖像檢測(cè)技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)計(jì)數(shù)。李珊珊等[21]選擇提取微液滴灰度值提高陽性微液滴與陰性微液滴的信號(hào)強(qiáng)度，并采用數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)對(duì)原始圖像進(jìn)行降噪，提高圖像對(duì)比度，進(jìn)而顯著提高了dPCR的檢測(cè)精確性。

隨著實(shí)驗(yàn)室中測(cè)試數(shù)量及指標(biāo)日益增多，多靶標(biāo)檢測(cè)成為未來的主要發(fā)展趨勢(shì)?；赿PCR的多重檢測(cè)可通過增加熒光通道數(shù)量或改變引物及探針濃度實(shí)現(xiàn)[22]。Bai等[23]開發(fā)了自吸分液式dPCR芯片，并利用3種熒光染料（FAM、HEX和Cy5）標(biāo)記的分子信標(biāo)實(shí)現(xiàn)了對(duì)3種長(zhǎng)鏈非編碼RNA的同步檢測(cè)。除此之外，商業(yè)化的QX600ddPCR系統(tǒng)通過配置六色熒光（FAM、HEX、Cy5、Cy5.5、ATTO590和ROX）檢測(cè)通道，其單孔可定量分析12個(gè)靶標(biāo)，極大地拓展了dPCR技術(shù)在多重基因檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用空間。雖然增加熒光通道可提升檢測(cè)靶標(biāo)的數(shù)量，但同時(shí)也增加了體系的復(fù)雜性和儀器成本；此外，熒光通道間存在潛在干擾，難以實(shí)現(xiàn)高階的多重檢測(cè)?？紤]到體系設(shè)計(jì)的可控性，通過引物更換及探針比例調(diào)整，有望進(jìn)一步為多靶標(biāo)分析提供可選方案。Zhong等[24]通過改變探針濃度，僅需利用兩種熒光即可構(gòu)建脊髓萎縮癥的五重檢測(cè)體系，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)20例患者樣本中3個(gè)基因（SMN1、SMN2和BCKDHA）的突變拷貝數(shù)以及單核苷酸突變（c.815Agt;G，SMN1）的檢測(cè)。然而，該方法未解決反應(yīng)體系復(fù)雜、擴(kuò)增引物相互干擾的難題。由于dPCR是通過終點(diǎn)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行信號(hào)采集，這使其可在熒光信號(hào)、熒光強(qiáng)度和檢測(cè)區(qū)域等多個(gè)維度有所區(qū)別，開發(fā)新的多重檢測(cè)方法、簡(jiǎn)化反應(yīng)體系并提高檢測(cè)穩(wěn)定性，將是促進(jìn)多重dPCR廣泛應(yīng)用的有效手段。

在檢測(cè)速度方面，dPCR需要讀取數(shù)以萬計(jì)的反應(yīng)單元的熒光才能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析，這使其檢測(cè)速度顯著慢于常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。早期的dPCR系統(tǒng)采用光電倍增管等圖像處理策略，一次只能處理一個(gè)反應(yīng)單元，不適合于高通量定量檢測(cè)。近年來，隨著激光誘導(dǎo)熒光細(xì)胞術(shù)和三維成像等技術(shù)的引入，dPCR在檢測(cè)速度方面得到極大改進(jìn)，顯著提升了其臨床疾病診斷性能。Zhu等[20]將激光誘導(dǎo)熒光細(xì)胞術(shù)與微流控芯片相結(jié)合，開發(fā)了一種新型液滴讀取器，該方法可以實(shí)現(xiàn)每秒數(shù)百到數(shù)千液滴的熒光信號(hào)分析，極大地提高了檢測(cè)效率。此外，Liao等[25]開發(fā)了一種三維成像策略，用于在試管中原位掃描微液滴。該策略在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，采用旋轉(zhuǎn)掃描方式讀取液滴，并用高速相機(jī)捕獲其平面熒光圖像，等效于對(duì)整個(gè)微液滴平面的掃描過程。得益于100幀/秒的快速采集速率，該技術(shù)可在6s內(nèi)完成整管的高速掃描，在保證準(zhǔn)確性的前提下大大提高了檢測(cè)速度。

3dPCR技術(shù)在疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1dPCR在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用

組織活檢是目前癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有侵入性，易增加患者的感染幾率[26]。液體活檢是一種通過微創(chuàng)手段獲得患者體液，檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA（CirculatingtumorDNA，ctDNA）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞等標(biāo)志物的新型癌癥診斷技術(shù)[27]。然而，這些分子在體液中的濃度極低，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)難以檢出。近年來，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確性的dPCR技術(shù)在腫瘤液體活檢中展示出巨大潛力。

ctDNA是液體活檢中應(yīng)用最廣泛的分析指標(biāo)。但是，ctDNA在不同患者體內(nèi)的含量和核酸多態(tài)性差異很大，常規(guī)技術(shù)難以直接檢測(cè)血漿中的腫瘤特異性基因突變。dPCR技術(shù)因具有能夠從復(fù)雜背景中檢測(cè)低豐度靶標(biāo)的能力，在腫瘤基因突變檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。Wu等[28]開發(fā)了一種基于dPCR技術(shù)的自供電雙向分區(qū)微流控芯片，采用嵌入式微孔布置，增加了微孔數(shù)量，可直接檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者血漿中EGFR突變。臨床樣本檢測(cè)結(jié)果表明，該芯片對(duì)L858R突變的敏感性為85.71%，特異性為94.44%，對(duì)T790M突變的敏感性為100%，特異性為86.96%。盡管該方法實(shí)現(xiàn)了血漿中低豐度EGFR突變的準(zhǔn)確定量分析，同時(shí)在其它單核苷酸突變基因的分子診斷和治療監(jiān)測(cè)中具有一定的應(yīng)用潛力，但其靈敏度仍有提升空間。進(jìn)一步，Xiang等[29]將侵入反應(yīng)引入dPCR體系，由于侵入反應(yīng)在單堿基識(shí)別方面具有高度特異性，因此在一個(gè)反應(yīng)單元中允許大量野生型DNA與突變DNA分子共存，靈敏度較傳統(tǒng)dPCR技術(shù)提高了1000倍。臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血漿中的EGFR突變檢測(cè)結(jié)果與第二代測(cè)序結(jié)果一致。同時(shí)，由于擴(kuò)增引物和侵入探針的可編程性，該方法可實(shí)現(xiàn)多種基因突變檢測(cè)。

隨著癌癥生物標(biāo)志物測(cè)試數(shù)量及指標(biāo)越來越多，多重檢測(cè)的重要性與必要性越來越突出。為了優(yōu)化檢測(cè)方法，Yin等[30]設(shè)計(jì)了一種多通道單色熒光自引dPCR芯片，具有6個(gè)檢測(cè)區(qū)域，可利用自吸將特定的反應(yīng)混合物預(yù)先引入到某個(gè)檢測(cè)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)dPCR芯片中同時(shí)檢測(cè)5種EGFR突變（圖3A）。Yu等[31]通過結(jié)合基于振幅/比率的多重檢測(cè)技術(shù)，開發(fā)了新型多重dPCR分析方法，只需進(jìn)行3次反應(yīng)即可檢測(cè)KRAS、MRAS、BRAF和PIK3CA基因中至少69種最常見的熱點(diǎn)突變。該技術(shù)具有快速的周轉(zhuǎn)時(shí)間和較低的成本，可在樣本量有限的情況下篩查突變和篩選關(guān)鍵預(yù)后生物標(biāo)志物。以ctDNA為代表的液體活檢作為dPCR的重要應(yīng)用領(lǐng)域，其精確性受到了廣泛認(rèn)可。但是，由于液體活檢需要處理毫升級(jí)的血液和復(fù)雜的下游分析，罕見突變的集成化液體活檢的重要性與必要性不言而喻。為此，Geng等[32]研發(fā)了一種集成液滴dPCR（IntegrateddropletdigitalPCR，IddPCR）微型裝置，設(shè)計(jì)了一系列試劑混合結(jié)構(gòu)，包括宏、中、微混合器，以便根據(jù)試劑體積選擇不同的混合器，通過流體動(dòng)力學(xué)參數(shù)和器件結(jié)構(gòu)尺寸確定系統(tǒng)的微尺度閥值，打破了傳統(tǒng)dPCR微器件設(shè)計(jì)對(duì)設(shè)備的依賴（圖3B）。該方法可實(shí)現(xiàn)以“樣本-結(jié)果”的輸出模式從血漿中檢測(cè)出罕見的T790M突變，為液體活檢的自動(dòng)化提供了解決方案。

dPCR技術(shù)具有高敏感性和高精密度，在液體活檢方面具有其它技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)。dPCR整合液體活檢技術(shù)為癌癥檢測(cè)提供了準(zhǔn)確、高效、安全的平臺(tái)。然而，dPCR在腫瘤臨床檢驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn)，例如，目前商業(yè)化的dPCR平臺(tái)不成熟、沒有標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)處理方式等，仍需進(jìn)行深入的臨床研究和驗(yàn)證。

3.2dPCR在感染性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

感染性疾病是威脅人類健康的主要疾病，根據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)，感染性疾病死亡人數(shù)占全球死亡總?cè)藬?shù)的28%[33]。病原體的快速、特異和靈敏檢測(cè)是治療感染性疾病的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)病原體核酸檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度難以達(dá)到臨床需求等缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中受到一定限制[34]。近年來，單分子檢測(cè)技術(shù)極大地推動(dòng)了病原體檢測(cè)的發(fā)展，其中，dPCR憑借其可絕對(duì)定量分析、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)，在感染性疾病檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

3.2.1病毒檢測(cè)

病毒是造成全球范圍內(nèi)感染性疾病發(fā)病率和死亡率居高不下的最主要病原體。目前病毒檢測(cè)常用的方法主要是通過免疫學(xué)方法檢測(cè)其蛋白質(zhì)或通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)其特定核酸序列[35]。dPCR作為新興的痕量核酸分子技術(shù)，具有靈敏度高、耐受性強(qiáng)、可絕對(duì)定量分析等優(yōu)點(diǎn)，在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）、BK病毒、人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）和乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）定量檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[34]。Sun等[36]采用濕法蝕刻工藝和硅-玻璃鍵合，設(shè)計(jì)了一種基于腔室的dPCR芯片，并通過模擬流體力學(xué)優(yōu)化了芯片的結(jié)構(gòu)，確保樣品在微室中的均勻性和獨(dú)立性。利用該芯片檢測(cè)了不同濃度的SARS-CoV-2病毒ORF1ab基因，檢出限可低至10copy/μL，顯著優(yōu)于qPCR（圖4）。但該方法檢測(cè)分析時(shí)間較長(zhǎng)，難以在資源有限地區(qū)實(shí)現(xiàn)快速便攜的新冠病毒檢測(cè)?；诖?，Yin等[37]結(jié)合ddPCR和快速PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)SARS-CoV-2。該方法單次PCR熱循環(huán)周期僅需7s，可在115s內(nèi)檢測(cè)出陽性信號(hào)，總運(yùn)行時(shí)間小于5min。臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法與qPCR一致性較好，在COVID-19現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)中擁有巨大應(yīng)用潛力。

BK病毒屬于人類多瘤病毒中的一個(gè)亞型，其感染引發(fā)的相關(guān)性腎病是導(dǎo)致腎移植失敗的重要原因[38]。BK病毒檢測(cè)主要依賴于組織活檢，患者依從性較低。為了優(yōu)化檢測(cè)方法，Xu等[39]開發(fā)了一種便攜式集成dPCR系統(tǒng)，可直接從尿液樣本定量分析BK病毒。該系統(tǒng)帶有自分區(qū)滑動(dòng)芯片微流控裝置，利用具有交替深度和寬度的微通道進(jìn)行流體操作，并與熱控制和熒光成像模塊集成，可在2h內(nèi)完成“一步法”檢測(cè)，線性范圍為3.0×104～1.5×108copy/mL，為床旁檢測(cè)和病毒感染監(jiān)測(cè)提供了方法學(xué)參考。

除上述病毒外，dPCR在HIV和HBV感染診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。Strain等[40]分別用ddPCR和qPCR對(duì)外周血樣本中的總HIVDNA含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在模板拷貝數(shù)較低時(shí)，dPCR的檢測(cè)精度是qPCR的20倍以上，顯著提升了HIV檢測(cè)的靈敏度。Huang等[41]首次采用ddPCR對(duì)肝癌病人FFPE樣本中的HBV拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并研究了肝癌分級(jí)與病毒DNA含量之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，ddPCR的檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)100%，檢測(cè)范圍達(dá)到1.1～175.5copy/μL。與血清學(xué)分析法相比，dPCR可實(shí)現(xiàn)單分子水平的核酸定量分析，有望在臨床上實(shí)現(xiàn)慢性肝炎患者組織樣本的檢測(cè)及抗病毒的療效評(píng)估。

3.2.2細(xì)菌檢測(cè)

細(xì)菌是眾多疾病的病原體，可通過多種途徑廣泛傳播，威脅人類健康，因此，細(xì)菌的快速檢測(cè)和鑒定對(duì)于公共衛(wèi)生和醫(yī)療保健具有重要意義。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)基于培養(yǎng)分離和生化鑒定，通常需要較長(zhǎng)時(shí)間（幾天甚至幾周），而且在目標(biāo)含量低、檢測(cè)基質(zhì)復(fù)雜的情況下，檢測(cè)結(jié)果會(huì)有明顯偏差[42-43]。利用dPCR技術(shù)高靈敏度的特點(diǎn)，Abram等[44]研發(fā)出一步法血滴dPCR檢測(cè)和高通量3D粒子計(jì)數(shù)系統(tǒng)，可直接從全血標(biāo)本中進(jìn)行細(xì)菌鑒定和抗生素敏感分析（圖5），檢出限達(dá)到10CFU/mL，較qPCR低1個(gè)數(shù)量級(jí)，并且檢測(cè)時(shí)間少于1h，該方法在靶向檢測(cè)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的抗生素耐藥基因方面具有巨大應(yīng)用潛力。Tao等[45]構(gòu)建了數(shù)字化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，以此替代傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)低濃度牛結(jié)核分枝桿菌的精確定量分析，靈敏度達(dá)到14CFU/mL，并整合了樣品前處理步驟，建立了牛奶中牛結(jié)核分枝桿菌高效全流程檢測(cè)方案，具有良好的特異性和準(zhǔn)確性，為環(huán)境和生理樣本中各種病原體的定量分析和分子檢測(cè)提供了檢測(cè)平臺(tái)，為食品安全檢測(cè)提供了參考。

除上述細(xì)菌感染外，dPCR在大腸桿菌和副溶血弧菌的感染診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。由于單純的DNA擴(kuò)增難以區(qū)分死菌和活菌，易造成假陽性結(jié)果。Pan等[46]利用疊氮溴化丙錠預(yù)先去除死菌DNA，構(gòu)建基于dPCR的大腸桿菌O157∶H7絕對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)，檢出限低至5copy/μL。此外，Lei等[47]報(bào)道了一種多重dPCR方法，通過引物及探針的合理設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了副溶血弧菌TLH、TDH、URER和ORF8基因的同時(shí)檢測(cè)，檢出限為39CFU/mL，靈敏度與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法一致。該研究開發(fā)的基于4重dPCR的副溶血弧菌檢測(cè)方法大大促進(jìn)了不同血清型的檢測(cè)，為檢測(cè)更多目的基因提供了方法學(xué)參考。

從基因表達(dá)研究到各種靶點(diǎn)的絕對(duì)定量分析，dPCR在靈敏度、特異性、可重復(fù)性和檢出限等方面優(yōu)于許多其它分子診斷技術(shù)。當(dāng)對(duì)拷貝數(shù)較低的靶點(diǎn)進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，dPCR因具有單拷貝級(jí)的靈敏度，較常規(guī)分子診斷平臺(tái)更可靠，在各類感染性疾病診斷領(lǐng)域具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。目前，檢測(cè)核酸的dPCR技術(shù)種類繁多且各有特點(diǎn)，但用于其它多種小分子檢測(cè)的dPCR方法仍然較少，有待進(jìn)一步開發(fā)。

3.3dPCR在其它疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

除上述疾病外，dPCR也被用于耳聾基因檢測(cè)和產(chǎn)前診斷。2018年，Wang等[48]建立了一種基于咽拭子的液滴dPCR方法，實(shí)現(xiàn)了8個(gè)耳聾相關(guān)基因突變的無創(chuàng)檢測(cè)，特異性為100%，動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為101～105copy/μL，可以準(zhǔn)確量化m.1494Cgt;T和m.1555Agt;G兩個(gè)異質(zhì)性率低至1%的突變位點(diǎn)，有望成為一種具有競(jìng)爭(zhēng)力和應(yīng)用前景的基因篩選方法。

第二代測(cè)序技術(shù)是產(chǎn)前診斷21-三體綜合征的常用方法，但其成本較高，步驟繁瑣，限制了其臨床應(yīng)用。基于此，Xu等[49]通過dPCR定量檢測(cè)母親血漿cfDNA中21號(hào)染色體數(shù)量增加的部分，提出了新型21-三體綜合征檢測(cè)方法。以21號(hào)染色體和1號(hào)染色體上的重復(fù)片段作為dPCR檢測(cè)目標(biāo)，在母體cfDNA中成功檢出低至10%的21-三體綜合征胎兒cfDNA。在產(chǎn)前診斷中，dPCR技術(shù)因靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，顯示出重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。雖然目前dPCR在檢測(cè)準(zhǔn)確性方面還有待提高，但隨著應(yīng)用研究的逐步深入和完善，其適用范圍會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展，靈敏度和準(zhǔn)確性也會(huì)逐步提高。

4結(jié)論與展望

相較于傳統(tǒng)核酸定量分析方法，dPCR不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，可直接定量檢測(cè)目標(biāo)序列的原始拷貝數(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢(shì)。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，dPCR體系因其可在短時(shí)間內(nèi)分割成大量獨(dú)立反應(yīng)單元，極大地降低了反應(yīng)成本，進(jìn)一步拓展了dPCR在癌癥的精準(zhǔn)診療和感染性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用[50-51]。

dPCR作為一項(xiàng)新興技術(shù)，仍存在許多亟待解決的問題：（1）分散技術(shù)尚不成熟，微滴制備過程中存在樣本消耗的問題，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；（2）dPCR的信號(hào)輸出及結(jié)果分析需要大型儀器設(shè)備輔助，限制了其在資源有限地區(qū)的廣泛應(yīng)用；（3）多靶標(biāo)檢測(cè)困難，熒光基團(tuán)間存在相互干擾，難以在單個(gè)微滴中實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)的同步檢測(cè)；（4）缺乏國家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，商品化的dPCR平臺(tái)繁多，平臺(tái)內(nèi)部暫無可比性，影響檢測(cè)結(jié)果的說服力[52-53]。總之，dPCR技術(shù)在疾病檢測(cè)領(lǐng)域中仍然有較大的提升空間。

近年來，隨著基于階梯乳化的樣品分散法、三維成像技術(shù)和電化學(xué)生物傳感器等前沿技術(shù)不斷與dPCR技術(shù)結(jié)合，有望提高dPCR技術(shù)的靈敏度和精確性。數(shù)據(jù)處理模塊以及整個(gè)設(shè)備都可由成本較低的微型計(jì)算機(jī)控制，使用自主開發(fā)的圖像處理和輸出量化軟件也可為dPCR技術(shù)的發(fā)展提供新思路。這些新的dPCR技術(shù)或?qū)⑦M(jìn)一步推進(jìn)人們對(duì)疾病快速、敏感和準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。