基于加權基因共表達網(wǎng)絡和癌癥基因組圖譜臨床數(shù)據(jù)分析并鑒定肝細胞癌的Hub基因研究

【摘要】 背景 肝細胞癌（HCC）是全球常見的癌癥相關死亡的第三大原因，約占所有原發(fā)性肝癌病例的90%，其復發(fā)率和死亡率較高，目前發(fā)生的分子機制仍不清楚。目的 探索HCC潛在的分子機制，發(fā)掘新的生物標志物。方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載RNA-seq表達數(shù)據(jù)和臨床相關信息，通過差異基因表達分析正常肝臟組織與HCC組織的差異基因；對差異表達基因進行富集分析；基于TCGA中HCC的基因表達數(shù)據(jù)概況，使用WGCNA R包建立共表達網(wǎng)絡，進行加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA），選擇具有臨床意義的模塊，并篩選候選Hub基因；進一步分析候選Hub基因在HCC組織和正常肝臟組織顯著差異表達、與HCC患者總體生存期和無病生存期是否顯著相關，最終確定Hub基因；通過人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫對Hub基因蛋白表達進行驗證。結果 本研究的基因表達數(shù)據(jù)來自50個正常肝臟組織樣本和373個HCC組織樣本。通過差異基因表達分析發(fā)現(xiàn)7 230個在HCC和正常肝臟組織之間差異表達的基因（HCC中3 691個上調基因和3 539個下調基因）。富集分析表明，上調的差異表達基因主要參與細胞周期調控和有絲分裂過程；下調的差異表達基因主要參與小分子代謝和有機酸代謝等過程。WGCNA確定了19個與HCC患者臨床特征相關基因模塊，通過分析模塊與臨床特征之間的關系，篩選出青色模塊和紫色模塊。青色模塊基因中同時與患者總生存期和無病生存期強烈相關的前兩個基因為VPS45和FAM189B；紫色模塊基因中同時與患者總生存期和無病生存期強烈相關的前兩個基因分別為CLEC1B和FCN3，因此將VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3確定為最終的Hub基因。人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫免疫組織化學染色顯示：VPS45和FAM189B在HCC組織中的表達高于正常肝臟組織，F(xiàn)CN3在HCC組織中的表達低于正常肝臟組織，CLEC1B在HCC組織和正常肝臟組織中表達差異不明顯。結論 初步確定VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3可能是HCC的新型潛在生物標志物，這些Hub基因可能為HCC的靶向治療提供理論基礎。

【關鍵詞】 癌，肝細胞；加權基因共表達網(wǎng)絡分析；Hub基因；分子靶向治療

【中圖分類號】 R 730.261 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0243

Analysis and Identification of Hub Genes in Hepatocellular Carcinoma Based on Weighted Gene Co-expression Network and Cancer Genome Atlas Clinical Data

CHEN Chao1，CHEN Tianxiang2，LIU Qianwei1，ZHANG Zhi1，WANG Huanhuan2，WU Pingping1，GAO Lei1，YU Zhaoxiang1*

1.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University，Xi'an 710077，China

2.Department of Hepatobiliary Surgery，the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

*Corresponding author：YU Zhaoxiang，Professor/Chief physician；E-mail：yuzhaoxiang2@163.com

【Abstract】 Background Hepatocellular carcinoma（HCC） is the third leading cause of common cancer-related mortality globally，accounting for approximately 90% of all primary liver cancer cases. Its recurrence and mortality rates are high，with the underlying molecular mechanisms remaining unclear. Objective To explore potential molecular mechanisms of HCC and explore novel biomarkers. Methods RNA-seq expression data and clinical information were retrieved from TCGA database，differential gene expression analysis was conducted between normal liver tissue and HCC tissue. Enrichment analysis on the differentially expressed genes was performed. Based on the gene expression data profiles of HCC in TCGA，a co-expression network was established using the WGCNA R package，and weighted gene co-expression network analysis（WGCNA） was performed to select clinically significant modules and screen candidate Hub genes；the candidate Hub genes were further analyzed for significant differential expression in HCC tissues and normal liver tissues，and whether they were significantly correlated with the overall survival and disease-free survival of HCC patients. The Hub genes were conclusively identified，and their protein expression was validated through the Human Protein Atlas database. Results The genetic expression data in this study were obtained from 50 normal liver tissue samples and 373 HCC tissue samples. Through differential gene expression analysis，a total of 7 230 genes differential expression between HCC and normal hepatic tissue，comprising 3 691 up-regulated genes and 3 539 down-regulated genes in HCC were identified. Enrichment analysis showed that the up-regulated differentially expressed genes were mainly involved in cell cycle regulation and mitotic processes；the down-regulated differentially expressed genes were mainly involved in processes such as small molecule metabolism and organic acid metabolism. WGCNA identified 19 gene modules related to the clinical features of HCC patients，the cyan and purple modules were screened by analyzing the relationship between the modules and the clinical features. The first two genes in the cyan module genes that were strongly associated with both overall survival and disease-free survival of patients were VPS45 and FAM189B. In the purple module genes，first two genes that were strongly associated with both overall survival and disease-free survival of patients were CLEC1B and FCN3，respectively；therefore，VPS45，F(xiàn)AM189B，CLEC1B and FCN3 were identified as the final Hub genes. Immunohistochemical staining in the Human Protein Atlas database showed that VPS45 and FAM189B were expressed higher in HCC tissues than in normal liver tissues. FCN3 was expressed in HCC tissues lower than in normal liver tissues，the difference in the expression of CLEC1B between HCC tissues and normal liver tissues was not obvious. Conclusion VPS45，F(xiàn)AM189B，CLEC1B and FCN3 have been preliminary identified as possible novel potential biomarkers for HCC，which may provide a theoretical basis for targeted therapy of HCC.

【Key words】 Carcinoma，hepatocellular；Weighted gene co-expression network analysis；Hub gene；Molecular targeted therapy

肝細胞癌（HCC）是癌癥相關死亡的第三大原因［1］，也是中國近年來癌癥相關死亡的主要原因。HCC在所有原發(fā)性肝癌病例中占90%［2］。HCC發(fā)病機制的主要危險因素包括慢性乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、吸煙、飲酒、超重和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、糖尿病以及黃曲霉毒素B1攝入量等［3］，這些因素導致DNA損傷，表觀遺傳改變和癌癥相關突變，最終導致HCC進展［4］。絕大多數(shù)患者確診時已是晚期。盡管HCC的治療在近幾年取得很大進展，主要包括經(jīng)導管動脈化療栓塞、分子靶向治療、消融治療、手術切除和肝移植等［3，5］，但HCC患者的5年生存率仍然很低［6］，并且其5年復發(fā)率高達80%～90%，預后較差［7］。HCC發(fā)生和發(fā)展的確切機制仍不清楚，因此，闡明HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制，開發(fā)新的診斷和治療方法來改善HCC的臨床結果是非常迫切和必要的。

近年來，隨著高通量測序技術不斷發(fā)展，為癌癥的基因組學、轉錄組學和表觀基因組學的特征提供了新的研究方法。表達譜的生物信息學分析已被廣泛用于鑒定新的和更有效的潛在生物標志物，用于癌癥的治療和患者預后［8］。通過生物信息學的大數(shù)據(jù)分析，可以有效整合復雜疾病，尤其是癌癥的多個大規(guī)模數(shù)據(jù)集［9］。加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）是一種先進的方法，其具有準確和高效的廣泛基因分析優(yōu)點，用于基于相似的基因表達模式構建共表達模塊，并分析臨床特征模塊與不同基因組之間的相關性［10］。WGCNA已被廣泛用于識別不同類型癌癥相關的臨床特征模塊和Hub基因。如一項基于WGCNA研究將6個Hub基因和人腎細胞癌的進展以及患者的預后聯(lián)系起來［11］，鑒定了在侵襲性腎上腺皮質惡性腫瘤中高表達并與總生存期呈明顯負相關的4個Hub基因（TOP2A、CHEK1、TTK和CENPA）［12］。

本研究通過差異基因表達分析和WGCNA對從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中HCC的mRNA數(shù)據(jù)在表達和功能水平上進行分析。然后進行功能富集分析，確定與HCC患者臨床特征相關的模塊，以了解這些共表達基因的潛在生物學功能。通過這些生物信息學分析鑒定出Hub基因，并結合生存分析、HCC組織和正常肝臟組織表達差異分析、免疫組織化學染色分析和文獻分析進行驗證。這些結果將有助于臨床了解HCC的病因和潛在的分子機制，并為HCC提供新的治療靶點或生物標志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和數(shù)據(jù)處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫［13］（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）中下載HCC患者的RNA測序數(shù)據(jù)（50個正常樣本和373個HCC樣本）、臨床信息和生存信息（59個正常樣本和379個HCC樣本），具體信息見附表1～3（掃描正文首頁二維碼查看），患者臨床信息數(shù)據(jù)和樣本量見表1。根據(jù)注釋文檔將探針轉化為基因符號，通過測定所有對應探針的中位表達值，去除同一基因的重復探針。根據(jù)處理的結果，總共有11 627個基因被選中用于后續(xù)分析。分析的工作流程圖見附錄圖1（掃描正文首頁二維碼查看）。

1.2 HCC中差異表達基因的篩選

使用R軟件包UMAP（version 0.2.7.0）進行分析，對表達譜進行z-score，再使用UMAP函數(shù)進行降維分析以獲得降維后的矩陣。Limma（linear models for microarray data）［14］是一種基于廣義線性模型的差異表達篩選方法，用于識別正常肝臟組織和HCC組織之間的差異表達基因，在此處使用R軟件包limma（version 3.40.6）進行差異分析，以獲得正常肝臟組織與HCC組織的差異基因。獲取的表達譜數(shù)據(jù)集，利用lmFit函數(shù)進行多元線性回歸分析，進一步使用eBays函數(shù)進行分析，最終獲得顯著性差異的基因。

1.3 差異表達基因的功能富集

對于基因集進行功能富集分析，使用R軟件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的基因GO注釋，將其作為背景把基因映射到背景集合中，使用R軟件包clusterProfiler（version 3.14.3）進行富集分析，從而獲取基因集富集的結果。設定最小基因集為5，最大基因集為5 000，P<0.05和FDR<0.1作為顯著性差異。

1.4 加權基因共表達網(wǎng)絡分析

基于TCGA中HCC的基因表達數(shù)據(jù)概況，使用WGCNA R包建立共表達網(wǎng)絡。以基因表達譜為例：先對所有成對基因進行Pearson相關矩陣和平均連鎖法，然后使用冪函數(shù)amn=|Cmn|^β（Cmn=Gene_m和Gene_n）之間的Pearson's相關，構建出加權鄰接矩陣。β是一個軟閾值參數(shù)，其可以強調基因之間的強相關性。在選擇5的冪之后，將鄰接變換為拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix，TOM）TOMi，j = （lij+ aij）/［min（ki+kj）+1-aij］。為了將具有相似表達譜的基因分類為基因模塊，根據(jù)基于TOM的不相似性度量進行平均連鎖分級聚類，基因樹圖的最小大?。ɑ蚪M）為50。此外還合并了距離<0.25的模塊，最終獲得了19個共表達模塊，其中grey模塊被認為是無法被分配給任何模塊的基因集合。

1.5 具有臨床意義的模塊的選擇和HCC中的Hub基因的鑒定

基因表達和臨床特征之間的線性關系被賦予一個基因顯著性，等于單個基因P值的對數(shù)。如果基因顯著性與模塊成員密切相關，定義為模塊的特征基因與個體基因表達譜之間的相關性，從而得出結論該模塊的中心基因與HCC［15］相關，將這些基因視為候選Hub基因。如先前研究［16］所示：計算與基因的表達相關性以獲得基因顯著性，同時計算模塊特征向量與基因的表達相關性以獲得模塊成員，根據(jù)截止標準，76個在臨床顯著模塊中具有高連接性的基因被鑒定為候選Hub基因。

1.6 Hub基因的基因驗證和生物信息學驗證

使用GEPIA在線網(wǎng)站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析HCC樣本中Hub基因的表達水平，并基于Kaplan-Meier分析使用R套件中的生存包（版本：3.2-7）。從TCGA獲得359個HCC腫瘤樣本的差異基因表達譜和預后數(shù)據(jù)，然后確定每個基因的中位數(shù)表達值，根據(jù)給定基因的表達水平是高于還是低于中位數(shù)，樣本被分配到給定基因的“高表達”或“低表達”組。使用對數(shù)秩檢驗評估高表達組或低表達組之間的總體生存期和無病生存期的顯著性。如果P<0.05，認為該基因是經(jīng)過驗證的Hub基因。根據(jù)來自TCGA和GEPIA網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)，篩選正常肝臟組織和HCC組織之間Hub基因表達的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.7 人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫對Hub基因蛋白表達的驗證

人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）主要用于為提供各種人類蛋白質的組織和細胞分布信息。使用來自人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫的免疫組織化學染色結果驗證了HCC組織和正常肝臟組織之間生存相關基因的蛋白質表達。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)預處理

本研究的表達數(shù)據(jù)來自50個正常肝臟組織樣本和373個HCC組織樣本（附表4）?；谥鞒煞址治鰪臄?shù)據(jù)中排除了14個腫瘤樣本（圖1A）。最終409個樣本的基因表達譜用于后續(xù)分析。

2.2 HCC樣本中差異表達基因的鑒定及GO富集分析

在50個正常樣本和359個HCC樣本之間共鑒定出7 230個差異表達基因，差異表達基因火山圖見圖1B，包括3 691個上調基因和3 539個下調基因（附表5），差異分析結果見表2。為了探索差異表達基因在HCC中的潛在生物學功能，本研究對其進行GO富集分析，結果見附表6和附表7。

上調的差異表達基因主要參與細胞周期調控、有絲分裂過程、核分裂和染色體分離等（圖2A、2C）；下調的差異表達基因主要參與對外刺激反應、小分子代謝和有機酸代謝等過程（圖2B、2D）。

比較HCC組織和正常肝臟組織的基因表達差異，獲得表達數(shù)據(jù)集，根據(jù)差異倍數(shù)為1.5倍，P<0.05為顯著差異，進一步利用lmFit函數(shù)進行多元線性回歸分析，再使用eBays函數(shù)進行分析，最終獲得每個基因的差異顯著性，并繪制差異表達基因熱圖（附錄圖2）。

2.3 WGCNA和關鍵模塊的識別

加權基因共表達網(wǎng)絡分析基于7 230個差異表達基因的表達矩陣和409個HCC樣本的臨床數(shù)據(jù)。進行聚類分析檢查409個樣本的數(shù)據(jù)質量，結果顯示所有樣本在聚類中并且在截止閾值內，加權基因共表達網(wǎng)絡分析中應用了6個臨床變量：疾病狀態(tài)、性別、年齡、體質量、TNM分期和微血管侵犯（圖3A）。409個樣本分為兩個簇，腫瘤和正常，HCC樣本的臨床特征和數(shù)據(jù)的聚類樹狀圖（圖3B）。

為了構建無標度網(wǎng)絡，將軟閾值β設置為5，獨立度設置為0.86，平均連通性接近0（圖4A、4B）。模塊參數(shù)設置為最小模塊30，敏感性為3，模塊合并閾值為0.25，將其中具有相似表達模式的差異表達基因聚集到相同的模塊中，此外合并距離<0.25的模塊，最終獲得了19個共表達模塊（附錄圖3），并繪制模塊特征基因熱圖（圖4C），其中grey模塊是無法被分配給任何模塊的基因集合，差異基因表達譜及差異基因見附表8。

然后嘗試評估模塊與臨床特征之間的關系，發(fā)現(xiàn)青色模塊的特征基因與HCC之間具有強正相關（cor=0.64，P=3.6×10-50），而紫色模塊的特征基因與HCC之間具有高度負相關（cor=-0.80，P=5.6×10-97）（附錄圖4）。結果表明，青色模塊可能促進HCC的腫瘤發(fā)生，而紫色模塊可能會預防HCC。因此，分析青色模塊和紫色模塊的Hub基因。

2.4 從青色和紫色模塊中識別候選Hub基因

MM和GS分數(shù)在青色和紫色模塊中彼此呈正相關（圖5）。青色模塊中選擇Hub基因的標準相對低于標準截止閾值（MM>0.8）。在青色模塊中，選擇滿足“cor.gene Module Membership”>0.7和“cor.gene Trait Significance”>0.5閾值的前8個基因，分別為TOMM40L、VPS45、MSTO1、FAM189B、TTC13、PYGO2、NVL和EHMT2。在紫色模塊中，選擇滿足“cor.gene Module Membership”>0.8和“cor.gene Trait Significance”>0.7閾值的前16個基因，分別為CLEC4M、BMP10、CLEC1B、CLEC4G、GDF2、NDST3、BMPER、STAB2、CCL23、CHRM2、COL6A6、CRHBP、FCN3和CCBE1。

2.5 Hub基因表達及其與生存的相關性

青色模塊基因中僅與患者總生存期強相關的前3個基因分別為TOMM40L、VPS45和FAM189B；青色模塊基因中同時與患者總生存期和無病生存期強相關的前兩個基因為VPS45和FAM189B。紫色模塊基因中僅與患者總生存期強相關的前3個基因分別為CLEC1B、CCL23和FCN3；紫色模塊基因中同時與患者總生存期和無病生存期強相關的前兩個基因分別為CLEC1B和FCN3（圖6）。因此，將VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3確定為最終的Hub基因。兩個模塊中與無病生存期有顯著差異的基因有VPS45、FAM189B、CLEC1B、FCN3和BMPER（附錄圖5）。

使用GEPIA網(wǎng)站，分析這些模塊基因在HCC組織和正常組織之間表達情況（圖7），結果顯示，VPS45和FAM189B在HCC組織中上調，而CLEC1B和FCN3在HCC組織中下調。使用GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)獲得了類似的結果（附錄圖6）。

2.6 免疫組織化學染色驗證

從人類蛋白質圖譜（The Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫［17］（https：//www.proteinatlas.org）中獲得的免疫組織化學染色顯示：VPS45和FAM189B在HCC組織中的表達高于正常肝臟組織，而FCN3在HCC組織中的表達低于正常肝臟組織，CLEC1B在HCC組織和正常肝臟組織中表達差異不明顯（圖8）。

3 討論

HCC篩查指對符合HCC高風險的患者定期進行檢查，其目標是在早期時間檢測出HCC并予以及時干預，使患者存活率和生存質量提高。在HCC的臨床應用中，常見的傳統(tǒng)篩查方式包括肝臟超聲檢查和血清甲胎蛋白，其靈敏度和特異度相對有限。因此，開發(fā)出新的更準確的檢測方式十分具有臨床應用價值。目前研究表明幾個基因已被確定為HCC診斷的新型生物標志物。例如，長鏈非編碼RNA KDM4A-AS1在許多腫瘤中過度表達，尤其是在HCC中，長鏈非編碼RNA KDM4A-AS1水平與疾病分期和腫瘤分級呈正相關，與患者生存呈負相關［18］，LV等［19］研究顯示BAI3和CKAP2L可能是結直腸癌的潛在預后因子和治療靶點。

在這項研究中，將差異表達基因和加權基因共表達網(wǎng)絡結合起來，以提高識別HCC相關基因的能力。差異基因功能富集顯示，主要參與細胞周期調控的基因在HCC組織中失調，與近些年相關研究結果一致［20］。正常細胞周期的紊亂是導致癌癥的原因之一，靶向調節(jié)癌細胞周期是一種潛在的治療方法［21］。生物信息學分析基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，分析在HCC中重要模塊和Hub基因，確定了兩個關鍵模塊，分別為青色模塊和紫色模塊。分析這兩個模塊基因與患者總生存期和無病生存期的相關性，選擇了青色模塊中顯著相關的前兩個基因VPS45和FAM189B，選擇了紫色模塊中顯著相關的前兩個基因CLEC1B和FCN3，這4個基因作為入選的Hub基因。

VPS45缺陷型中性粒細胞和成纖維細胞表面的β1整合素水平降低，VPS45缺陷型成纖維細胞運動能力受損和細胞凋亡增加［22］。另外有研究顯示VPS45的表達水平和多種癌癥相關，比如YAMANOI等［23］研究表明VPS45表達水平和惡性腫瘤卵巢癌相關。FAM189B又稱為COTE1，通過機制分析表明，F(xiàn)AM189B可以與腫瘤抑制因子結構域氧化還原酶發(fā)生物理關聯(lián)，F(xiàn)AM189B與HCC細胞的侵襲密切相關［24］；FAM189B蛋白和mRNA的過表達可能會增加胃癌的發(fā)生率，并且細胞周期的通路是其KEGG富集分析最具有顯著差異的通路［25］。CLEC1B是C型凝集素結構域家族1成員，并且其與肝細胞癌的免疫浸潤相關，過表達的CLEC1B抑制HuH7細胞的增殖和遷移能力［26］。FCN3是一種分泌型凝集素，能夠激活補體通路，F(xiàn)CN3的異位表達能夠激活內質網(wǎng)應激未折疊蛋白，抑制內質網(wǎng)應激反應可提高肺腺癌細胞的存活率，F(xiàn)CN通過誘導內質網(wǎng)應激發(fā)揮抑癌作用［27］。本研究方法具有數(shù)據(jù)挖掘的局限性，研究所用數(shù)據(jù)來源于網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)樣本可能存在偏倚，測序結果在技術上可能存在偏差，為了提高WGCNA結果的可靠性，使用人類蛋白質圖譜的免疫組織化學數(shù)據(jù)進行確認，然而由于數(shù)據(jù)庫的限制，無法獲得每個基因的腫瘤和鄰近正常樣本的所有相關IHC數(shù)據(jù)。獲得的Hub基因在肝癌預后中的分子調節(jié)機制還需要進一步通過臨床數(shù)據(jù)和基礎實驗來證實，其可能作為肝癌早期篩查分子標志物、預后分子標志物及肝癌治療靶點，為人群篩查或肝癌患者治療提供幫助。

總之，本研究進行了全面的生物信息學分析，以確定HCC和正常肝臟組織之間的潛在生物預測標志物，本研究結果表明，VPS45、FAM189B、CLEC1B和FCN3可能是HCC的新型潛在生物標志物，具有特殊臨床意義，然而需要在大量臨床樣本中進行驗證。

作者貢獻：陳超提出研究目標，負責數(shù)據(jù)分析和寫作；陳天翔負責數(shù)據(jù)驗證；劉錢偉、張秩、王歡歡、吳平平和高磊負責數(shù)據(jù)整理；于照祥負責文章的質量控制與審查，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2023-03-17；修回日期：2023-08-18）

（本文編輯：賈萌萌）

基金項目：陜西省科技廳面上項目（2021JM-503）

引用本文：陳超，陳天翔，劉錢偉，等. 基于加權基因共表達網(wǎng)絡和癌癥基因組圖譜臨床數(shù)據(jù)分析并鑒定肝細胞癌的Hub基因研究［J］. 中國全科醫(yī)學，2024，27（32）：4050-4059. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0243. ［www.chinagp.net］

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? Editorial Office of Chinese General Practice. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.