超高效液相色譜質(zhì)譜法快速測定血漿中6種蘑菇毒素

[摘要]目的建立超高效液相色譜質(zhì)譜法快速測定血漿中異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的含量。方法取血漿樣本，以1∶3的比例加入乙腈，旋渦混勻1min后，以10000轉(zhuǎn)/min、4℃離心3min。吸取上清液，以0.03%氨水和乙腈進(jìn)行超高效液相分離，在電噴霧正離子模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測檢測。結(jié)果一次進(jìn)樣4min即可實(shí)現(xiàn)血漿中異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的分離檢測。血漿中6種蘑菇毒素的線性范圍為40～500μg/L，檢出限分別為10.0μg/L、10.0μg/L、10.0μg/L、6.0μg/L、6.0μg/L和6.0μg/L（S/N=3），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%～1.90%（n=11），回收率為90.8%～127.0%。結(jié)論本方法可實(shí)現(xiàn)血漿中包括異絨白乳菇醛在內(nèi)的6種蘑菇毒素的快速同時(shí)測定，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，為中毒患者的蘑菇毒素快速確證提供技術(shù)平臺。

[關(guān)鍵詞]蘑菇毒素；快速測定；血漿；超高效液相色譜質(zhì)譜法

[中圖分類號]Ｏ658[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.19.002

Rapiddeterminationofsixmushroomtoxinsinplasmabyultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry

LIQi1，XUJunqing1，QIANJiaqing2，JILyu1

1.DepartmentofLaboratory，LishuiCenterforDiseaseControlandPrevention，Lishui323000，Zhejiang，China;2.SchoolofEcology，LishuiUniversity，Lishui323000，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToestablishamethodforrapiddeterminationofisovelleral，α-amanitin，β-amanitin，γ-amanitin，dihydroxy-phallotoxinandcarboxy-dihydroxy-phallotoxininplasmabyultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry.MethodsTakeplasmasamplesandaddacetonitrilesolutionina1：3ratio.Thesamplewasvortexmixedfor1min，thencentrifugatedat10000r/minand4℃for3min.Thesupernatantwasinjected，while0.03%ammoniawaterandacetonitrilewereusedasmobilephasesforultrahighperformanceliquidphaseseparation.Multireactionmonitoringwascarriedoutinthepositiveionmodeofelectricspray.ResultsTheseparationanddetectionofisovelleral，α-amanitin，β-amanitin，γ-amanitin， dihydroxy-phallotoxin?;andcarboxyl-dihydroxy-phallotoxininplasmacouldbeachievedwithin4minbyoneinjection.Thelinearrangeofsixmushroomtoxinsinplasmawas40-500μg/L，andthedetectionlimitswere10.0μg/L10.0μg/L，10.0μg/L，6.0μg/L，6.0μg/Land6.0μg/L（S/N=3），respectively.Therelativestandarddeviationswere0.60%-1.90%（n=11），andtherecoveryrateswere90.8%-127.0%.ConclusionThismethodrealizestherapidandsimultaneousdeterminationof6kindsofmushroomtoxinsinplasma，includingisovelleral.Theoperationissimpleandtheresultisaccurate，whichprovidesatechnicalplatformfortherapidconfirmationofmushroomtoxinsinpoisonedpatients.

[Keywords]Mushroomtoxin;Rapiddetermination;Plasma;Ultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry

目前全世界已知的毒蘑菇有400多種，所含毒素種類眾多，結(jié)構(gòu)差異大，單獨(dú)或聯(lián)合作用可引起復(fù)雜的臨床表現(xiàn)[1-3]。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的多蘑菇毒素確證測定方法，第一時(shí)間確定蘑菇毒素種類，可為中毒患者的準(zhǔn)確救治爭取時(shí)間，對降低死亡率十分重要。液相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合液相色譜的強(qiáng)有效分離能力和質(zhì)譜的強(qiáng)組分鑒定能力，特別是超高效液相色譜質(zhì)譜法（ultraperformanceliquidchromatography-massspectrometry，UPLC-MS）采用比普通液相色譜柱更小粒徑和更高性能的色譜柱填充顆粒，具有更準(zhǔn)確和更靈敏的優(yōu)勢，近年被越來越多地應(yīng)用到蘑菇毒素的測定中，尤其適用于血液、尿液等復(fù)雜生物樣本中低濃度蘑菇毒素的測定，在蘑菇毒素的應(yīng)急診斷確證等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[4-10]。但仍普遍存在生物樣本前處理過程較為煩瑣、同時(shí)測定蘑菇毒素種類有限等問題。本文通過簡化生物樣本的前處理過程，首次建立血漿中包括異絨白乳菇醛在內(nèi)的6種蘑菇毒素的UPLC-MS快速測定方法。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

XevoTQ-S超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；LQ1multireax旋渦振蕩器（德國Heidolph公司）；3-30K低溫高速離心機(jī)（美國Sigma-Aldrich公司）；D11911超純水器（美國ThermoFisher公司）。

異絨白乳菇醛：純度≥99%；α-鵝膏毒素、β-鵝膏毒素、γ-鵝膏毒素、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽：純度≥90%（美國Enzo公司）；人工H血漿（北納生物研發(fā)中心）；甲醇、乙腈：HPLC級（德國Merck公司）；氨水：優(yōu)級純（美國ThermoFisher公司）。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇分別配制濃度均為100mg/L的異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，–20℃保存。用甲醇稀釋配制濃度為1mg/L的6種蘑菇毒素混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，–20℃保存。用0.03%氨水-乙腈（95∶5，V/V）配制不同濃度的異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3分析條件

色譜條件：ACQUITYUPLCBEHC18柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫：35℃；樣品室溫度：4℃；進(jìn)樣體積10μl。流動(dòng)相A：0.03%（V/V）氨水，流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫條件：0～1.0min，95%～80%A；1.0～1.2min，80%～65%A；1.2～1.8min，65%A；1.8～2.2min，65%～10%A；2.2～3.6min，10%A；3.6～4.5min，10%～95%A；4.5～6.5min，95%A。流速：0.35ml/min。

質(zhì)譜條件：MRM模式，ESI+；離子源溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：2.5kV；脫溶劑氣溫度：600℃；脫溶劑氣流量：950L/h，見表1。

1.4樣本前處理

取適量血漿樣本，按1∶3體積比加入乙腈，渦旋振蕩混勻1min，沉淀去除蛋白。以10000轉(zhuǎn)/min、4℃離心3min，吸取上清液，過0.22μm微孔濾膜后待用。

1.5樣本檢測

取血漿樣本，在1.3條件下進(jìn)行血漿中異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的同時(shí)測定，并開展系統(tǒng)性能實(shí)驗(yàn)。

1.6性能實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法

按1.2配制不同濃度的異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3條件下進(jìn)行分離測定。分別以6種蘑菇毒素濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。配制高、低兩個(gè)不同加標(biāo)濃度的6種蘑菇毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察方法回收率。配制蘑菇毒素平行樣本，重復(fù)11次測定計(jì)算方法精密度。以基線噪聲3倍信號對應(yīng)的濃度為方法檢出限。

2結(jié)果

2.1色譜條件優(yōu)化

本研究比較ACQUITYUPLCHSST3（100mm×2.1mm，1.8μm）和ACQUITYUPLCBEHC18（100mm×2.1mm，1.7μm）兩種色譜柱對異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽等6種蘑菇毒素分離測定的影響。譜圖顯示α-鵝膏毒素、β-鵝膏毒素、γ-鵝膏毒素、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽在兩種色譜柱上得到的分離效果和響應(yīng)強(qiáng)度差別不大，但異絨白乳菇醛在ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱上得到的分離效果更好，響應(yīng)更強(qiáng)，故選擇ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱作為色譜柱。

本研究分別考察了水-甲醇、0.2%甲酸水-甲醇、0.5%甲酸水-甲醇、0.03%氨水-甲醇、水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、0.5%甲酸水-乙腈、0.03%氨水-乙腈等8種流動(dòng)相體系對6種蘑菇毒素分離測定的影響。譜圖顯示流動(dòng)相體系的水相采用堿性溶劑0.03%氨水，有機(jī)相采用乙腈時(shí)，得到的6種蘑菇毒素信號響應(yīng)更強(qiáng)，色譜峰對稱無拖尾，分離效果比酸性溶劑甲酸水、中性溶劑水和甲醇更好，故選擇0.03%氨水-乙腈作為流動(dòng)相體系。

2.2系統(tǒng)性能

2.2.1最佳測定條件通過參數(shù)優(yōu)化，得到6種蘑菇毒素的最佳色譜和質(zhì)譜條件，見1.3。以流動(dòng)相為基質(zhì)，配制濃度為200μg/L的異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述最佳測定條件下實(shí)現(xiàn)6種蘑菇毒素的一次進(jìn)樣4min內(nèi)基線分離，見圖1。

2.2.2線性范圍和敏感度分別繪制6種蘑菇毒素的工作曲線，見表2。結(jié)果表明異絨白乳菇醛在20～400μg/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，α-鵝膏毒素、β-鵝膏毒素、γ-鵝膏毒素、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽在2～500μg/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.999。根據(jù)1.6性能實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法得到異絨白乳菇醛的檢出限為1.0μg/L，α-鵝膏毒素和γ-鵝膏毒素的檢出限為0.2μg/L，β-鵝膏毒素的檢出限為0.4μg/L，羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽的檢出限為0.1μg/L（S/N=3）。

2.2.3回收率和精密度根據(jù)1.6性能實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法，配制高、低兩個(gè)不同加標(biāo)濃度的異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察方法回收率，得到6種蘑菇毒素的回收率為93.7%～101.0%。200μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行11次進(jìn)樣檢測，考察方法精密度，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～3.31%（n=11），見表3。

2.3血漿樣本

2.3.1線性范圍和敏感度以血漿為基質(zhì)配制異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)1.4對血漿樣本進(jìn)行前處理，根據(jù)1.5進(jìn)行樣本檢測。工作曲線結(jié)果顯示血漿中6種蘑菇毒素在40～500μg/L的濃度范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.999。根據(jù)1.6性能實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法得到異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒素和β-鵝膏毒素的檢出限為10.0μg/L，γ-鵝膏毒素、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽的檢出限為6.0μg/L（S/N=3），見表4。

2.3.2回收率和精密度以血漿為基質(zhì)配制成高、低兩個(gè)不同加標(biāo)濃度的異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察血漿樣本中該方法的回收率，結(jié)果見表5。根據(jù)1.6性能實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法得到6種蘑菇毒素的回收率為90.8%～127.0%。100μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行11次進(jìn)樣考察血漿樣本中該方法的精密度，得到6種蘑菇毒素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%～1.90%（n=11）。

3討論

食用毒蘑菇中毒患者大多沒有毒蘑菇樣本留存，因此通過鑒定毒蘑菇判斷中毒的毒素種類較為困難。據(jù)報(bào)道，毒蘑菇中毒事件未能進(jìn)行毒蘑菇鑒定和毒素檢測的占同期毒蘑菇中毒事件數(shù)的92.59%[11]；中毒者的癥狀多在食用毒蘑菇后12h、甚至幾天后才出現(xiàn)，此時(shí)大部分的毒素己進(jìn)入靶器官，尿液和血液等生物樣本中毒素濃度很低，僅為ng/ml數(shù)量級，極難被測出[9]。此時(shí)通過蘑菇毒素中毒患者的血漿樣本第一時(shí)間確定蘑菇毒素種類，對及時(shí)救治中毒患者、降低死亡率至關(guān)重要[11-12]。

1949年，Wieland等[13]最早采用點(diǎn)跡法對鵝膏肽類蘑菇毒素進(jìn)行測定，之后各地逐步發(fā)展出毛細(xì)管電泳法、液相色譜法等其他測定方法。近年來質(zhì)譜檢測技術(shù)的出現(xiàn)為蘑菇毒素的測定帶來更高敏感度和準(zhǔn)確度，優(yōu)勢明顯。張秀堯等[9]采用UPLC-MS方

法實(shí)現(xiàn)尿液和血漿中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽等5種蘑菇毒素的同時(shí)測定，分析時(shí)間為9min，在尿液和血漿中的檢出限<1μg/L。徐小民等[7]建立在線固相萃取–液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定蘑菇中毒患者尿液中α-鵝膏毒肽，分析時(shí)間為11min。方力等[8]建立TurboFlow在線凈化–液相色譜–三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測定尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽等5種蘑菇毒素，分析時(shí)間為9min。上述UPLC-MS方法的前處理過程較為煩瑣，對操作人員的要求較高，測定的蘑菇毒素種類也較為局限。本研究僅對血漿樣本做簡單前處理，以1∶3的比例加入乙腈溶液，沉淀去除蛋白，經(jīng)微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣測定，大大縮短前處理分析時(shí)間。據(jù)此建立的UPLC-MS方法在4min內(nèi)即可完成血漿中異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽等6種蘑菇毒素的分離測定，分析速度快，適用于蘑菇毒素中毒患者的毒素種類快速確證。與此同時(shí)，本研究首次完成血漿中異絨白乳菇醛的測定，拓寬蘑菇毒素的可檢出種類。最終，采用本研究建立的UPLC-MS方法，血漿中異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒素和β-鵝膏毒素的檢出限為10.0μg/L，γ-鵝膏毒素、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽的檢出限為6.0μg/L，6種蘑菇毒素在40～500μg/L的濃度范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.999，敏感度高；血漿中6種蘑菇毒素的加標(biāo)回收率為91.2%～127.0%，準(zhǔn)確度高；6種蘑菇毒素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%～1.90%，重現(xiàn)性好。

綜上，本研究建立的UPLC-MS方法能快速、準(zhǔn)確、靈敏地測定蘑菇毒素中毒患者血漿中異絨白乳菇醛、α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽的含量，不僅可為6種蘑菇毒素的快速同時(shí)確證提供技術(shù)支持，也為醫(yī)療機(jī)構(gòu)準(zhǔn)確制定中毒患者的救治措施提供科學(xué)依據(jù)，具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024-01-02）

（修回日期：2024-03-05）