微生物法測定嬰幼兒奶粉中泛酸的優(yōu)化研究

基金項目：云南省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（2022YSJK12，2022YSJK18）。

作者簡介：陳明瑤（1992—），女，云南大理人，本科，助理工程師。研究方向：食品質(zhì)量安全檢測分析。

通信作者：張加穩(wěn)（1989—），男，云南曲靖人，碩士，工程師。研究方向：食品質(zhì)量安全檢測分析。E-mail： 1098541655

@qq.com。

摘 要：通過優(yōu)化《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）中微生物法測定嬰幼兒奶粉中泛酸含量的關(guān)鍵實驗條件和步驟，提高數(shù)據(jù)的重復(fù)性和準確性。結(jié)果表明，優(yōu)化后，重復(fù)性實驗的相對標準偏差為1.36%～2.38%，加標回收率在99.2%～104.2%，解決了國標法因菌種生長差異導(dǎo)致菌懸液濃度不穩(wěn)定等問題，有效提高了檢測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：泛酸；微生物法；嬰幼兒奶粉；實驗條件優(yōu)化

Optimization Study on Microbial Method for Determining Pantothenic Acid in Infant Milk Powder

CHEN Mingyao1， ZHAO Yincheng1， ZHANG Lianqin2， GUO Ying2， QIAN Zhou1， ZHANG Jiawen2*

（1.Yunnan Products Quality Supervision amp; Inspection Institute， National Tropical Agricultural Products Quality Supervision and Inspection Center， Kunming 650223， China;

2.Kunming Food and Drug Inspection Institute， Kunming 650034， China）

Abstract： The reproducibility and accuracy of the data were improved by optimizing the key test conditions and steps for the determination of pantothenic acid content in infant milk powder by microbial method in GB 5009.210—2023. The results showed that after optimization， the relative standard deviation of the repeatability test was 1.36%～2.38%， and the recovery rate of the spike was 99.2%～104.2%， which solved the problem of unstable bacterial suspension concentration caused by the difference in bacterial growth in the national standard method， and effectively improved the stability and reliability of the detection data.

Keywords： pantothenic acid; microbiological method; infant milk powder; experimental condition optimization

泛酸又稱為維生素B5、本多生酸、遍多酸，是一種水溶性B族維生素，無臭、味微苦、偏酸性，在食物中普遍存在[1]。泛酸易溶于水和醋酸，在中性溶液中不易發(fā)生氧化還原作用，但易被酸堿破壞，對光敏感，檢測時需要避光操作[2]。泛酸作為人體必需的維生素參與如脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)等多個代謝過程[3]，其參與制造的抗體可緩解因抗生素引發(fā)的毒副作用，減輕相應(yīng)的過敏癥狀[4]。研究表明，嬰幼兒攝入的泛酸含量不足時，會導(dǎo)致其體重下降、毛發(fā)和皮膚生長遲緩，甚至出現(xiàn)過敏、濕疹及免疫力低下等癥狀。此外，泛酸對嬰幼兒的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也有促進作用，可見泛酸對嬰幼兒的生長和代謝都有重要作用[5]。目前，為滿足嬰幼兒生長發(fā)育對泛酸的正常需求，常把泛酸作為食品營養(yǎng)強化劑添加到嬰幼兒配方食品中。由于嬰幼兒食物來源單一，配方奶粉作為嬰幼兒主要的營養(yǎng)物質(zhì)來源之一，其中的泛酸含量顯得尤為重要。

目前，微生物法是國內(nèi)外測定嬰幼兒奶粉中泛酸含量的主要方法之一，其檢測原理是根據(jù)植物乳桿菌的生長和繁殖與泛酸存在的對應(yīng)關(guān)系，利用泛酸含量與吸光度的線性關(guān)系計算樣品中泛酸含量。微生物法的優(yōu)勢在于檢測過程中干擾物質(zhì)少、檢出限低、成本低、靈敏度高，以及能夠檢測泛酸含量較低的樣品，但此方法存在檢測周期較長、偶然因素多、菌懸液濃度不穩(wěn)定以及重復(fù)性差等不足[6]。本研究優(yōu)化《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）中微生物法的關(guān)鍵實驗條件及步驟，旨在提高測定結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

3種市售嬰幼兒奶粉，詳細信息見表1。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，ATCC 8014），

廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。泛酸鈣標準品（98.8%），美國Sigma-Aldrich公司；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，美國BD公司；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、泛酸測定用培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甲苯，分析純，山東旭晨化工科技有限公司；乙酸鈉、鹽酸、乙醇，分析純，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

本實驗使用的儀器與設(shè)備信息見表2。

1.3 實驗方法

試劑及標準溶液的配制等按照GB 5009.210—2023[7]中微生物法相關(guān)步驟操作。

1.3.1 樣品制備

（1）樣品處理。將待測樣品過篩3次（篩板孔徑0.3 mm），分別準確稱取0.700 g上述樣品至100 mL錐形瓶中備用。

（2）待測樣品制備。在裝有待測樣品的錐形瓶中加入80 mL乙醇溶液，超聲提取4 h，用水定容至100 mL。隨后將待測樣品充分振蕩搖勻，于

3 000 r·min-1離心10 min，在避光和無菌條件下，用無菌注射器吸取上清液至離心管中。根據(jù)表1中各待測樣品的泛酸含量參考值，用0.9%的無菌生理鹽水將試樣提取液稀釋相應(yīng)倍數(shù)，并使最終濃度落在標準曲線范圍內(nèi)。3種待測樣品均按上述方法處理，每種樣品進行6次重復(fù)實驗，以確保測定結(jié)果的準確性。

1.3.2 接種液的制備

在避光和無菌條件下，將現(xiàn)配的2 mL泛酸標準工作液與4 mL泛酸測定用培養(yǎng)液充分振蕩混勻，分裝于2支5 mL離心管，高壓蒸汽滅菌15 min，取出后靜置30 s，后放置于37 ℃恒溫水浴鍋中冷卻。隨后使用泛酸測定用瓊脂培養(yǎng)基對菌株進行活化24 h。用接種環(huán)挑取經(jīng)活化的單個植物乳桿菌，分別置于

2支種子培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后取出，以3 000 r·min-1冷凍離心10 min，棄上清液，在無菌操作下用預(yù)先滅菌的0.9%生理鹽水淋洗2次，以3 000 r·min-1冷凍離心10 min，棄上清液，分別加入3 mL滅菌生理鹽水，振蕩混勻后備用。

利用紫外分光光度計于550 nm處測定接種液的透光率，確保透光率在60%～80%，若透光率不在該范圍，則使用0.9%的無菌生理鹽水稀釋調(diào)整透光率至60%～80%。

1.3.3 標準系列管的制備

按照表3依次在10支15 mL試管中加入泛酸標準工作液、蒸餾水和泛酸測定用培養(yǎng)液[8]，待滅菌。

1.3.4 菌懸液濃度的優(yōu)化

菌懸液濃度的高低取決于接種量和培養(yǎng)時間的長短，本實驗將分別對接種量和培養(yǎng)時間進行優(yōu)化篩選。

（1）接種量的優(yōu)化篩選。制備10組完全相同的標準系列管，于121 ℃高壓滅菌15 min后取出冷卻至室溫，在無菌條件下分別向每支測定管中滴加

5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、

40 μL、45 μL和50 μL的接種液，7 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后用紫外分光光度計在550 nm處測定各試管的吸光度值。以泛酸濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，利用ELISA Calc軟件擬合泛酸標準曲線，以標準曲線線性關(guān)系最佳的接種量作為最優(yōu)接種量。

（2）培養(yǎng)時間的優(yōu)化篩選。選取最優(yōu)接種量的標準系列管，測定不同培養(yǎng)時間（16～24 h）的吸光度，根據(jù)吸光度的變化，篩選最適宜的培養(yǎng)時間。

1.3.5 結(jié)果計算

以S0試管作為空白對照，在550 nm處測定各試管吸光值，以泛酸濃度（1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、

3 ng·mL-1、4 ng·mL-1、5 ng·mL-1、6 ng·mL-1、7 ng·mL-1、8 ng·mL-1、9 ng·mL-1和10 ng·mL-1）和吸光值為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線，計算各待測樣品中泛酸含量，計算公式為

（1）

式中：X為試樣中泛酸含量，mg/100 g；為試樣稀釋液泛酸濃度均值，ng·mL-1；V為試樣提取液的定容體積，mL；f為試樣提取液稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

1.3.6 方法學(xué)評價

對待測樣品檢測結(jié)果進行精密度計算，并通過計算不同加標水平下的回收率，對優(yōu)化后的檢測方法進行方法學(xué)評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取過程的優(yōu)化

通過離心操作后，3種待測樣品的提取液在

550 nm波長處的透光率比國標法制備的提取液透光率分別提高了23.7%、24.0%、30.2%，詳見表4。

如圖1所示，相較于國標中的提取方法，本實驗提取方法不會使待測樣品中原有泛酸含量損失，優(yōu)化后各個樣品中的泛酸含量比泛酸含量標示值

（表1）高6.75%、7.51%、5.86%，國標法測定的泛酸含量值比泛酸含量標示值高18.8%、11.3%、21.4%。這表明優(yōu)化提取方法后泛酸的測定值更接近于產(chǎn)品泛酸含量的標示值。

2.2 接種液添加量篩選結(jié)果

對10組添加不同接種液的標準系列管進行標準曲線擬合，可得對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)r2值，詳見表5。利用ELISA Calc軟件擬合泛酸標準曲線，泛酸標準生長曲線呈平緩且單調(diào)的S形曲線，當各點均落于曲線上時，其線性關(guān)系最強。當接種量為30 μL時，線性關(guān)系最好，r2可達0.999 8。因此，選擇30 μL作為本次實驗的最優(yōu)接種量。

2.3 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

以培養(yǎng)時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制30 μL接種量下菌液的生長曲線，結(jié)果見圖2。當培養(yǎng)時間少于16 h時，菌懸液濃較低，吸光值增加緩慢，因此本文選取培養(yǎng)16～24 h進行詳細分析。培養(yǎng)時間在16～19 h時，植物乳桿菌處于對數(shù)生長期，其生長速度較快，吸光值與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)；當培養(yǎng)時間超20 h時，由于菌懸液濃度過高，吸光值趨于最大限度值（1）。當培養(yǎng)時間為20 h時，吸光值較高，菌液處于穩(wěn)定生長期，所以選擇20 h作為本實驗的最適培養(yǎng)時間。

2.4 準確性與重復(fù)性實驗

對3種樣品進行6次平行實驗，結(jié)果以x±s表示，并計算相對標準偏差（Relative Standard Deviation，

RSD）。如表6所示，3種樣品的RSD為1.36%～

2.38%，符合《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》

（GB 10765—2021）的要求，表明本方法精密度較高、重復(fù)性較好。

分別稱取3份A樣品0.2 g，加入不同量的泛酸標準液進行3次重復(fù)實驗，加標回收實驗結(jié)果見表7。不同加標水平下，樣品的加標回收率在99.2%～104.2%，平均回收率為101.6%，加標回收率結(jié)果理想，符合實驗要求，說明本方法準確度高、可操作性強。

3 討論與結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，待測樣品在加入乙醇溶液且超聲提取4 h的情況下，樣品中泛酸能夠完全溶解。本實驗對待測樣品進行離心后，去除了未溶解的大顆粒分子，解決了因奶粉顆粒附著，菌種在培養(yǎng)過程中抱團，從而導(dǎo)致吸光度測定值偏差較大的問題，有效提高了試樣提取液的透光率，從而提高了吸光值和實驗的準確性。

微生物法測定泛酸含量的實驗中，接種量會直接影響菌懸液的濃度，進而影響實驗結(jié)果。接種量過高或過低對實驗結(jié)果的準確性有較大影響[9]。當接種量大于30 μL時，菌懸液濁度增加，透光率降低，菌種會快速進入穩(wěn)定生長期，所需的培養(yǎng)時間較短，吸光值起伏波動較大，從而導(dǎo)致實驗的準確性降低；當接種量小于30 μL時，菌懸液濃度降低，菌種生長緩慢，導(dǎo)致實驗周期增加，不確定干擾因素增多，從而導(dǎo)致實驗的可靠性降低。因此，本實驗選擇

30 μL作為最優(yōu)接種量。

此外，培養(yǎng)時間的長短也會影響菌種的增殖趨勢，最終影響菌懸液濃度。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間過長，植物乳桿菌將經(jīng)過對數(shù)生長期、穩(wěn)定期后進入衰退期，此時的菌懸液因前期植物乳桿菌的大量增殖而濃度過高，透光率過低，從而導(dǎo)致吸光值的準確性降低，最終影響實驗結(jié)果。相反，如果培養(yǎng)時間過短，植物乳桿菌將處于生長初期或?qū)?shù)生長期，此時的菌懸液濃度變化較快，且吸光值和培養(yǎng)時間呈線性關(guān)系，如果以此階段的數(shù)據(jù)作為最終實驗結(jié)果將導(dǎo)致所測定的泛酸含量低于實際含量。所以，選擇20 h作為本實驗的最適培養(yǎng)時間。

微生物法相比于化學(xué)分析法不易掌握，本研究對該方法中的關(guān)鍵步驟、影響因素等問題進行歸納總結(jié)，具體如下。①實驗操作過程中應(yīng)保持避光和無菌操作，測定前應(yīng)使用鹽酸浸泡試管2 h，于170 ℃烘干3 h后使用，操作過程中應(yīng)佩戴手套，且實驗過程中應(yīng)全程佩戴口罩和手套，避免油脂、維生素等外源因素影響測定結(jié)果的準確性[10]。②微生物法檢測周期長、操作煩瑣，對植物乳桿菌菌種的保藏及活化要求高，應(yīng)該在特定的微生物實驗室完成檢測，以確保實驗結(jié)果的準確性[11]。③在菌懸液的制備過程中，用接種環(huán)挑取活化的植物乳桿菌菌株時應(yīng)選取外觀圓潤、潮濕、光滑的單個菌株，以確保菌株活性以及實驗數(shù)據(jù)的可靠性[12]。④樣品滅菌結(jié)束取出冷卻至室溫過程中，為保證能夠快速冷卻至室溫避免受雜菌污染，可在取出30 s后置于恒溫水浴鍋中冷卻，確保試樣中基本不出現(xiàn)絮狀沉淀和其他顏色，避免影響實驗結(jié)果。⑤實驗結(jié)束后應(yīng)將試管和試劑做滅菌處理。⑥為了使嬰幼兒配方奶粉中泛酸含量的計算結(jié)果更加準確，本實驗利用ELISA Calc軟件擬合泛酸標準曲線，并計算樣品中泛酸含量。

另外，微生物法測定泛酸含量的實驗中不確定性較多，測量重復(fù)性、標準物質(zhì)稱取、標準溶液配制、試樣稱量、試樣前處理及稀釋，以及紫外分光光度計測量誤差等[13]都可能引入不確定因素。即使本實驗已經(jīng)對接種量、接種時間和樣品處理等3個方面進行優(yōu)化，但仍存在因菌種間的個體生長差異、試樣稱量偏差等導(dǎo)致菌懸液濃度不穩(wěn)定等問題。因此，在今后的研究中，還需對微生物法中所有不確定性因素進行探索，解決菌種個體生長差異問題，或者最大限度地減少實驗過程中的試劑配制、稱量過程中泛酸含量的損失。不斷優(yōu)化操作標準、實驗條件，有助于提升該方法測定嬰幼兒奶粉中泛酸含量的準確性及應(yīng)用的廣泛性。

綜上所述，對國標法中微生物法測定嬰幼兒奶粉中泛酸含量的關(guān)鍵實驗條件進行優(yōu)化后，方法線性關(guān)系r2=0.999 8，重復(fù)性實驗的RSD為1.36%～2.38%，加標回收率在99.2%～104.2%，數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，滿足實驗室對泛酸檢測的要求。該方法適用于嬰幼兒配方奶粉中泛酸含量的實驗室檢測。

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