微生物快速檢測技術(shù)在食品安全保障中的應(yīng)用

作者簡介：劉長波（1975—），女，寧夏銀川人，本科，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：食品安全監(jiān)管。

摘 要：隨著食品安全問題的日益突出，傳統(tǒng)的微生物檢測方法已無法滿足現(xiàn)代社會對快速、準(zhǔn)確檢測的需求。微生物快速檢測技術(shù)，包括免疫學(xué)檢測、基因探針和傳感器技術(shù)，為食品安全保障提供了新途徑。本文介紹了這些技術(shù)在肉類、乳制品和果蔬中的具體應(yīng)用，并探討了適用于不同食品基質(zhì)的技術(shù)選擇策略。通過優(yōu)化和組合不同檢測方法，能夠提高檢測的靈敏度和特異性，為食品安全檢測提供可靠保障。

關(guān)鍵詞：食品安全；微生物快速檢測；免疫學(xué)檢測

Application of Rapid Microbial Detection Technology in Food Safety Guarantee

LIU Changbo

（Yinchuan Market Supervision Administration， Yinchuan 750001， China）

Abstract： With the increasing prominence of food safety issues， traditional microbial detection methods can no longer meet the needs of modern society for fast and accurate detection. Microbial rapid detection technology， including immunological testing， gene probes， and sensor technology， provides new avenues for food safety assurance. This article reviews the specific applications of these technologies in meat， dairy products， and fruits and vegetables， and explores technology selection strategies applicable to different food matrices. By optimizing and combining different detection methods， the sensitivity and specificity of detection can be improved， providing reliable guarantees for food safety testing.

Keywords： food safety; rapid microbial testing; immunological testing

隨著人們對食品安全的日益重視，傳統(tǒng)微生物檢測方法已無法滿足快速、準(zhǔn)確的檢測需求。微生物快速檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，為食品安全保障提供了新的解決方案。本文綜述了免疫學(xué)檢測、基因探針和傳感器等主要微生物快速檢測技術(shù)，并詳細(xì)探討了這些技術(shù)在肉類、乳制品、果蔬和飲用水等不同食品領(lǐng)域的具體應(yīng)用[1]。

1 食品安全檢測中的微生物快速檢測技術(shù)

1.1 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過抗體與食品樣品中待測物質(zhì)的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)快速檢測。常用方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定、免疫熒光法和免疫層析法等。以酶聯(lián)免疫吸附測定中夾心法為例，簡述操作步驟：將特異性抗體包被于微孔板上，加入待測樣品，若存在目標(biāo)抗原則與抗體結(jié)合；洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)后，加入酶標(biāo)記的二抗，與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌后加入顯色底物，根據(jù)顏色變化判斷樣品中是否含有目標(biāo)物質(zhì)，并可通過比色定量分析。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)對食源性致病菌、毒素、農(nóng)藥殘留等有害物質(zhì)的快速篩查[2]。但該法同時(shí)存在操作較煩瑣、容易出現(xiàn)假陽性、抗體制備及保存成本較高等局限性。因此，在實(shí)際應(yīng)用中還需進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)，如采用非標(biāo)記免疫檢測技術(shù)簡化操作步驟，開發(fā)高親和力重組抗體提高特異性，并與其他技術(shù)聯(lián)用提升檢測性能，以更好地滿足食品安全檢測的需求。

1.2 基因探針技術(shù)

基因探針技術(shù)是以核酸分子雜交原理為基礎(chǔ)，利用DNA或RNA探針與樣品中特定序列互補(bǔ)結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物的快速檢測。制備寡核苷酸探針時(shí)，先根據(jù)目標(biāo)微生物的特異性基因序列設(shè)計(jì)并合成探針，并進(jìn)行標(biāo)記，常用標(biāo)記方式有放射性同位素、生物素和熒光染料等。將標(biāo)記探針與變性后的樣品DNA雜交，在適宜條件下探針與目標(biāo)序列特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物[3]。未雜交探針被洗脫去除，而結(jié)合探針的數(shù)量可通過檢測標(biāo)記物的信號強(qiáng)度來判斷，且信號強(qiáng)度與目標(biāo)序列含量成正比。采用熒光原位雜交可實(shí)現(xiàn)對樣品中微生物的原位可視化檢測，通過熒光顯微鏡直接觀察并計(jì)數(shù)發(fā)光菌體?；蛱结樇夹g(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、無須培養(yǎng)等優(yōu)勢，但操作相對復(fù)雜，對檢測環(huán)境和操作人員技術(shù)要求較高。

1.3 傳感器技術(shù)

傳感器技術(shù)通過將微生物代謝產(chǎn)物或細(xì)胞組分與傳感器表面的識別元件特異性結(jié)合，將生物信號轉(zhuǎn)化為可檢測的電信號，實(shí)現(xiàn)對食品中微生物的快速、實(shí)時(shí)檢測?；谧R別元件的不同，傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、DNA傳感器等[4]。①以免疫傳感器為例，其基本原理為將特異性抗體固定在電極表面，當(dāng)樣品中存在相應(yīng)抗原時(shí)，抗原抗體結(jié)合引起電極界面性質(zhì)改變，導(dǎo)致電信號變化，將電信號采集處理后，即可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的定性定量分析。②電化學(xué)傳感器靈敏度高、選擇性強(qiáng)、響應(yīng)速度快，但易受環(huán)境因素干擾，如pH值、溫度、樣品基質(zhì)效應(yīng)等均會影響檢測結(jié)果。③光學(xué)傳感器包括表面等離子體共振傳感器、光導(dǎo)波導(dǎo)傳感器和光纖傳感器等，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、在線和無標(biāo)記檢測，但儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜。④還有基于微生物代謝產(chǎn)生揮發(fā)性化合物的氣敏傳感器，基于微生物呼吸作用引起pH值變化的氧氣傳感器等。隨著微納米加工技術(shù)和信號處理技術(shù)的發(fā)展，傳感器正朝著微型化、集成化和智能化方向發(fā)展，有望實(shí)現(xiàn)便攜、高通量、多指標(biāo)聯(lián)合檢測，為食品安全檢測提供更加快速、靈敏的解決方案。

2 微生物快速檢測技術(shù)在食品安全中的具體應(yīng)用

2.1 在肉類產(chǎn)品中的應(yīng)用

肉類產(chǎn)品中微生物快速檢測技術(shù)的應(yīng)用主要針對肉類加工各環(huán)節(jié)中的致病菌和腐敗菌檢測。①采用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)檢測肉類中的沙門氏菌時(shí)，應(yīng)先提取肉樣中總DNA，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，針對沙門氏菌特異性基因invA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增過程中，TaqMan探針特異性結(jié)合于擴(kuò)增子，并被Taq DNA聚合酶5'→3'核酸外切酶活性水解，釋放出熒光基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)度變化，可判斷樣品中是否存在沙門氏菌，且起始循環(huán)數(shù)與菌量呈負(fù)相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)定量分析[5]。該方法靈敏度可達(dá)10 CFU·g-1，檢測時(shí)間縮短為4～6 h。②而采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)檢測肉制品中的單增李斯特菌時(shí)，只需在恒溫條件下通過兩對特異性引物進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，無須溫度循環(huán)，可大大簡化操作流程和儀器設(shè)備。同時(shí)，采用pH指示劑或濁度法可實(shí)時(shí)檢測LAMP反應(yīng)過程，實(shí)現(xiàn)目視化判斷結(jié)果，無須電泳等復(fù)雜檢測手段。③此外，將核酸適配體與量子點(diǎn)結(jié)合，構(gòu)建熒光傳感器可實(shí)現(xiàn)肉類中致病菌的快速、靈敏檢測。核酸適配體通過指數(shù)富集

的配體系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）技術(shù)篩選獲得，對目標(biāo)菌具有極高的特異性和親和力，而量子點(diǎn)具有發(fā)光穩(wěn)定、抗光漂白等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)樣品中存在目標(biāo)菌時(shí)，核酸適配體特異性結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，與量子點(diǎn)分離，熒光信號顯著增強(qiáng)，通過檢測熒光強(qiáng)度變化即可判斷致病菌的存在。

2.2 在乳制品中的應(yīng)用

乳制品中微生物快速檢測技術(shù)的應(yīng)用旨在檢測乳品生產(chǎn)加工各環(huán)節(jié)中的致病菌、腐敗菌以及食品安全指示菌。①采用核酸適配體芯片技術(shù)檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌時(shí)，以表面等離子體共振成像（Surface Plasmon Resonance imaging，SPRi）為信號讀出方法，將篩選獲得的核酸適配體探針點(diǎn)樣固定于芯片表面，芯片表面還可修飾親水性化合物以減少非特異性吸附。將樣品通入芯片表面，樣品中目標(biāo)菌與核酸適配體特異性結(jié)合引起SPR信號變化，根據(jù)信號強(qiáng)度與變化速率可實(shí)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的定性定量分析。SPRi可實(shí)現(xiàn)多通道、高通量檢測，無須標(biāo)記，靈敏度與特異性較傳統(tǒng)SPR技術(shù)大大提高。②基于核酸適配體的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移傳感器也可用于乳制品中致病菌的快速檢測。以大腸桿菌為例，將巰基化的核酸適配體修飾于金電極表面，另一端標(biāo)記光敏染料如釕配合物，大腸桿菌存在時(shí)，核酸適配體特異性結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，染料基團(tuán)遠(yuǎn)離電極表面，光照時(shí)產(chǎn)生的光電子不能傳遞至電極表面，因此光電流顯著降低。該方法無須分離純化，可實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞一步檢測，且染料標(biāo)記的核酸適配體更加穩(wěn)定，可重復(fù)利用。與之類似，將核酸適配體與量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米材料等熒光納米材料偶聯(lián)構(gòu)建的光學(xué)傳感器也可實(shí)現(xiàn)乳制品中致病菌的快速、靈敏檢測，為食品安全提供有力保障。

2.3 在果蔬中的應(yīng)用

果蔬中微生物快速檢測技術(shù)的應(yīng)用主要針對農(nóng)藥殘留、重金屬、腐敗菌和致病菌的檢測。①利用量子點(diǎn)作為生物標(biāo)記，可構(gòu)建紙基芯片實(shí)現(xiàn)對果蔬農(nóng)藥殘留的快速、便攜檢測。以有機(jī)磷農(nóng)藥為例，將其特異性識別的核酸適配體固定在纖維素紙上，另一端連接生物素化的量子點(diǎn)，存在農(nóng)藥分子時(shí)，核酸適配體特異性結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，使得量子點(diǎn)與紙基分離，紙基熒光顯著減弱。而當(dāng)果蔬中農(nóng)藥殘留含量較低時(shí)，量子點(diǎn)保持在紙基上，紙條在紫外燈下發(fā)出明亮熒光。使用一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的熒光強(qiáng)度繪制工作曲線，可實(shí)現(xiàn)對果蔬中農(nóng)藥殘留的定量分析。該方法操作簡單，無須復(fù)雜儀器設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，且熒光量子點(diǎn)具有發(fā)光穩(wěn)定、抗光漂白等優(yōu)點(diǎn)，是理想的現(xiàn)場快檢工具。采用核酸適配體與金納米顆粒偶聯(lián)構(gòu)建比色傳感器，通過顏色變化也可實(shí)現(xiàn)對果蔬農(nóng)藥殘留的快速、靈敏檢測。②在果蔬致病菌檢測方面，基于免疫磁性分離與核酸同位素探針雜交的檢測技術(shù)可顯著提高致病菌檢測的靈敏度和特異性。以檢測甜瓜中沙門氏菌為例，將抗沙門氏菌抗體偶聯(lián)于磁性微球表面，果蔬樣品經(jīng)勻漿、離心等前處理后，與免疫磁珠混合，沙門氏菌特異性結(jié)合于磁珠表面，經(jīng)磁分離洗滌除去干擾雜質(zhì)后，加入放射性同位素標(biāo)記的核酸探針，與結(jié)合在磁珠上的沙門氏菌核糖體RNA特異性雜交，通過檢測放射性同位素的量即可實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌的高靈敏定量檢測，為確保果蔬食品安全提供重要保障。

3 微生物快速檢測技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用策略

食品基質(zhì)復(fù)雜多樣，在應(yīng)用微生物快速檢測技術(shù)時(shí)需綜合考慮食品樣品類型、待測微生物特性、檢測目的及靈敏度、特異性要求等因素。①對于固體食品樣品，如肉制品、奶酪等，由于其組織結(jié)構(gòu)致密，微生物與基質(zhì)結(jié)合緊密，采用傳統(tǒng)方法難以有效釋放微生物，影響檢測效果。此時(shí)宜選擇超聲波處理、酶解等樣品前處理技術(shù)，破碎組織結(jié)構(gòu)，釋放微生物細(xì)胞，再結(jié)合免疫磁性分離技術(shù)富集分離目標(biāo)菌，去除雜菌和PCR抑制物的干擾，從而提高檢測的靈敏度和特異性。②對于高蛋白、高脂肪含量的食品基質(zhì)，PCR易受抑制，采用核酸提取純化試劑盒去除抑制物的同時(shí)，可能導(dǎo)致核酸損失，影響檢測靈敏度。此時(shí)可選擇基于RNA的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如核酸序列等溫?cái)U(kuò)增（Nuclear Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）技術(shù)等，RNA作為擴(kuò)增模板，降低了PCR抑制物的影響，且RNA水平與細(xì)菌活性相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)活菌檢測。③對于易形成生物膜的微生物，如李斯特菌等，可選擇高壓均質(zhì)、超聲波處理等樣品處理技術(shù)，破碎生物膜，釋放微生物細(xì)胞，提高檢測靈敏度。而對于芽孢桿菌等有芽孢的耐熱菌，傳統(tǒng)的DNA提取方法難以破碎其芽孢壁，影響核酸提取效率。此時(shí)可采用梯度PCR技術(shù)，根據(jù)不同引物退火溫度設(shè)置多個(gè)反應(yīng)管，有效提高擴(kuò)增效率，降低假陰性率。④對于食源性致病菌的毒力基因檢測，可選擇熒光PCR技術(shù)，根據(jù)特異性毒力基因設(shè)計(jì)引物和探針，實(shí)現(xiàn)對標(biāo)志性致病基因的快速篩查，為判斷微生物的致病性提供依據(jù)。

4 結(jié)語

本文系統(tǒng)地討論了微生物快速檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用，并探討了不同食品基質(zhì)下的技術(shù)應(yīng)用策略。結(jié)合免疫學(xué)檢測、基因探針和傳感器技術(shù)，可以顯著提高食品中微生物檢測的靈敏度和特異性。未來，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，微型化、集成化和智能化將是微生物快速檢測技術(shù)的發(fā)展方向。

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