基于分子生物學(xué)技術(shù)的食品微生物檢測(cè)研究

作者簡介：劉佳麗（1989—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，本科，工程師。研究方向：食品檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)。

摘 要：食品微生物檢測(cè)是確保食品安全和公共健康的重要環(huán)節(jié)。分子生物學(xué)技術(shù)憑借其高靈敏度、高特異性和快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的主流技術(shù)。本文概述了分子生物學(xué)技術(shù)的基本概念及其在微生物檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)及常見的檢測(cè)技術(shù)，探討了這些技術(shù)在食品病原菌檢測(cè)、食品腐敗菌檢測(cè)、食品中益生菌的檢測(cè)與監(jiān)控以及微生物群落分析中的具體應(yīng)用，為食品行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；食品；微生物檢測(cè)

Research on Food Microbial Detection Based on Molecular Biology Technology

LIU Jiali1， XU Peng2， LU Lihua1， WANG Haiyu1， SANG Shuang1

（1.Inner Mongolia Autonomous Region Product Quality Inspection and Research Institute， Hohhot 010010， China; 2.Inner Mongolia Jiaran Technology Co.， Ltd.， Hohhot 010010， China）

Abstract： Food microbiological testing is an important step in ensuring food safety and public health. Molecular biology technology， with its advantages of high sensitivity， specificity， and rapid detection， has gradually become the mainstream technology in the field of food microbiology detection. This article outlines the basic concepts of molecular biology technology， its advantages in microbial detection， and common detection techniques. It explores the specific applications of these technologies in food pathogen detection， food spoilage bacteria detection， detection and monitoring of probiotics in food， and microbial community analysis， providing technical support for the sustainable development of the food industry.

Keywords： molecular biology; food; microbial testing

隨著食品生產(chǎn)和流通的全球化趨勢(shì)日益加劇，食品安全問題已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。平板培養(yǎng)、顯微鏡觀察和生化鑒定等傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，雖然在微生物分類鑒定中發(fā)揮了重要作用，但存在檢測(cè)周期長、靈敏度和特異性較低等問題，難以滿足現(xiàn)代食品安全檢測(cè)的需求。分子生物學(xué)技術(shù)的引入為食品微生物檢測(cè)提供了全新的解決方案。分子生物學(xué)技術(shù)通過對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)與分析，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的微生物成分，其高靈敏度和特異性使得這些技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)。

1 分子生物學(xué)技術(shù)概述

1.1 分子生物學(xué)技術(shù)的基本概念

分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用基于其對(duì)微生物生物學(xué)特性的深入理解和技術(shù)操作的精確性。分子生物學(xué)技術(shù)主要涉及對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行特異性的識(shí)別和定量分析，從而快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定食品樣本中的微生物種類和數(shù)量。核心技術(shù)包括核酸的提取、擴(kuò)增及其序列分析，這些步驟能夠揭示微生物的種屬、毒力因子和抗藥性等關(guān)鍵信息。提取核酸是檢測(cè)的初步步驟，其目的是從食品樣品中提取出純凈的微生物脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）通過選擇性地?cái)U(kuò)增特定的微生物DNA序列來提高檢測(cè)的靈敏度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）進(jìn)一步提供了定量數(shù)據(jù)，使得研究人員能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中微生物的數(shù)量，這對(duì)于評(píng)估食品的安全性和微生物污染的程度至關(guān)重要[1]。

1.2 分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)

分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)顯著，主要體現(xiàn)在其能夠提供快速、高靈敏度和高特異性的檢測(cè)結(jié)果。分子生物學(xué)技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、核酸雜交技術(shù)和下一代測(cè)序（Next-Generation Sequencing，NGS），它們通過直接分析微生物的遺傳物質(zhì)，極大地加快了識(shí)別過程，并能在無須培養(yǎng)的情況下檢測(cè)到微生物的種類和數(shù)量。PCR技術(shù)通過特定的引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列，大大縮短了從樣品中檢測(cè)微生物所需的時(shí)間，從而使檢測(cè)周期從數(shù)日縮短至數(shù)小時(shí)。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)利用熒光標(biāo)記探針，在擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA含量的變化，不僅可以定性分析，還能精確定量，提供關(guān)于微生物載量的直接信息，這對(duì)于評(píng)估食品安全和控制生產(chǎn)過程中的微生物污染至關(guān)重要。

2 常見的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)能在食品微生物檢測(cè)中快速擴(kuò)增特定的DNA序列，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的精確識(shí)別和數(shù)量估計(jì)。該技術(shù)依賴于熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，這種酶能夠在反復(fù)的熱循環(huán)中持續(xù)工作，不斷地復(fù)制目標(biāo)DNA片段。PCR過程主要包括變性、退火和延伸3個(gè)步驟。在變性步驟中，雙鏈DNA通過加熱解開成為單鏈，為下一步引物的結(jié)合提供條件。退火步驟是將溫度降低，使得富含互補(bǔ)堿基的引物能夠特異性地結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上。在延伸步驟中，DNA聚合酶則沿著引物擴(kuò)展，合成新的DNA鏈。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

qPCR是基于傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，允許對(duì)特定DNA序列的復(fù)制過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與定量分析。該技術(shù)通過引入熒光標(biāo)記的探針或染料，實(shí)現(xiàn)在DNA擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)捕捉熒光信號(hào)的變化，從而精確測(cè)定目標(biāo)DNA的初始量。qPCR技術(shù)因其高靈敏度、高特異性和快速響應(yīng)而被廣泛認(rèn)可，特別適用于病原體的迅速檢測(cè)和微生物污染水平的精確測(cè)量。qPCR的關(guān)鍵步驟包括引物設(shè)計(jì)、熒光探針的選擇和熱循環(huán)條件的優(yōu)化。在每個(gè)擴(kuò)增周期中，熒光信號(hào)的增強(qiáng)與DNA模板的數(shù)量成正比，可根據(jù)熒光強(qiáng)度的增長曲線來估測(cè)出樣品中目標(biāo)DNA的初始濃度[2]。

2.3 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)用于檢測(cè)和鑒定食品樣品中特定的微生物DNA或RNA序列。這種技術(shù)依賴于互補(bǔ)核酸序列之間的自然結(jié)合能力，通過設(shè)計(jì)具有特定序列的探針與目標(biāo)微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的定性和定量。在食品微生物檢測(cè)中，核酸雜交技術(shù)尤其重要，因?yàn)樗梢栽诓恍枰囵B(yǎng)微生物的情況下直接從復(fù)雜的食品基質(zhì)中檢測(cè)出特定的病原體和腐敗微生物。核酸雜交的過程是將標(biāo)記有熒光或放射性同位素的核酸探針引入到處理過的樣品中。這些核酸探針是單鏈，能夠與目標(biāo)微生物的互補(bǔ)核酸序列結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物。此后，通過各種洗滌步驟去除未結(jié)合的探針，只有與目標(biāo)序列成功雜交的探針會(huì)被保留在樣品中。

2.4 基因組測(cè)序技術(shù)

在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域中，基因組測(cè)序技術(shù)能夠提供微生物種群的全基因組數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中存在微生物的精確識(shí)別和功能分析。該技術(shù)主要利用高通量測(cè)序平臺(tái)，如下一代測(cè)序和第三代測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行大規(guī)模DNA序列的快速讀取，使研究人員能在短時(shí)間內(nèi)獲取大量的遺傳信息?；蚪M測(cè)序的應(yīng)用不僅限于單一菌種的鑒定，能擴(kuò)展至復(fù)雜微生物群落的多樣性分析，包括病原體、腐敗微生物以及益生菌等?；蚪M測(cè)序技術(shù)特別適用于病原體的溯源和食品污染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，能夠迅速確定污染源和傳播路徑。此外，通過比較不同微生物的基因組，科研人員可以識(shí)別出特定的耐藥基因或致病基因，從而在食品處理和儲(chǔ)存過程中采取針對(duì)性的控制措施。

3 分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 食品病原菌檢測(cè)

分子生物學(xué)技術(shù)在食品病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用提升了食品安全領(lǐng)域的診斷效率和準(zhǔn)確性，這些技術(shù)能夠精確識(shí)別和定量各種病原體，包括細(xì)菌、病毒和真菌等。其中，PCR技術(shù)因其較高的靈敏性和特異性，已成為檢測(cè)食品中病原體的首選方法[3]。PCR能夠擴(kuò)增微量的DNA，即使是在食品加工和儲(chǔ)存過程中數(shù)量極少的病原體，也能被迅速識(shí)別和定量。此外，qPCR技術(shù)增加了對(duì)病原體濃度的定量能力，使得不僅能夠確認(rèn)病原體的存在，還可以評(píng)估其在食品中的負(fù)載量，這對(duì)于食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估至關(guān)重要。

為了更全面地監(jiān)測(cè)食品安全，基因組測(cè)序技術(shù)，如下一代測(cè)序已被引入到食品病原菌的檢測(cè)中。下一代測(cè)序允許對(duì)食品樣本中所有微生物的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，不僅可以識(shí)別出已知的病原體，還能夠發(fā)現(xiàn)新型或未被充分研究的病原體。此技術(shù)的應(yīng)用極大地增強(qiáng)了食品微生物檢測(cè)的廣度和深度，為食品行業(yè)提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具來處理復(fù)雜的食品安全問題。此外，核酸雜交技術(shù)，特別是熒光原位雜交（Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH），通過特異性探針與病原體DNA或RNA的結(jié)合，能夠在細(xì)胞層面直觀地觀察到病原體的分布，這種技術(shù)適用于食品加工環(huán)境中微生物污染的快速檢測(cè)。

3.2 食品腐敗菌檢測(cè)

在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)顯著提升了對(duì)食品腐敗菌的識(shí)別和定量能力。食品腐敗菌，通常是指能引起食品感官屬性變化（如顏色、氣味、味道和質(zhì)地）的微生物，包括某些細(xì)菌、酵母和霉菌。這些微生物活動(dòng)不僅導(dǎo)致食品品質(zhì)下降，還可能產(chǎn)生對(duì)人體健康有害的代謝產(chǎn)物。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法往往依賴培養(yǎng)技術(shù)，這些方法耗時(shí)且有時(shí)難以檢測(cè)到微生物污染的全貌。相對(duì)而言，分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、核酸雜交技術(shù)，提供了快速、敏感和特異性高的檢測(cè)方案。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)特別適合于檢測(cè)特定種類的腐敗菌，如產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸菌等，它們?cè)谑称穬?chǔ)存期間能迅速繁殖并引起腐敗。qPCR允許檢測(cè)特定DNA序列，能夠在幾小時(shí)內(nèi)定量分析樣品中的微生物含量，這對(duì)于評(píng)估食品的保質(zhì)期和制定合理的保鮮策略至關(guān)重要[4]。核酸雜交技術(shù)，尤其是熒光原位雜交也在食品腐敗菌的檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。

3.3 食品中益生菌的檢測(cè)與監(jiān)控

在食品科學(xué)領(lǐng)域，益生菌的檢測(cè)與監(jiān)控是確保食品功能性和安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而分子生物學(xué)技術(shù)在此過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。益生菌，作為一類有益健康的活性微生物，常用于各類發(fā)酵食品中，如酸奶、其他益生菌補(bǔ)充食品。益生菌檢測(cè)技術(shù)可以確保這些微生物的種屬和數(shù)量達(dá)到足夠的生物活性水平，從而保證其對(duì)人體的益處。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是益生菌檢測(cè)中的一項(xiàng)核心技術(shù)，它允許精確量化特定益生菌的DNA，從而提供其在食品中的具體數(shù)量。通過設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，qPCR能夠區(qū)分和量化乳酸菌和雙歧桿菌等關(guān)鍵益生菌。基因組測(cè)序技術(shù)，尤其是下一代測(cè)序提供了另一種強(qiáng)大的工具，用于益生菌的全面分析。下一代測(cè)序能夠揭示食品中益生菌的完整基因組信息，這有助于識(shí)別其遺傳多樣性和潛在的健康促進(jìn)特性。熒光原位雜交等核酸雜交技術(shù)同樣適用于食品中益生菌的直接觀察和定量[5]。

3.4 微生物群落分析

微生物群落分析在評(píng)估食品安全和質(zhì)量控制方面起著至關(guān)重要的作用。高通量測(cè)序技術(shù)如下一代測(cè)序，已經(jīng)成為分析食品中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵工具。下一代測(cè)序允許同時(shí)從單一樣品中測(cè)定成千上萬的微生物基因組，提供了一種前所未有的方式來深入了解食品中存在的微生物多樣性和其潛在的生物學(xué)活性。通過對(duì)食品樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，研究人員可以獲得未經(jīng)培養(yǎng)的微生物群落的全面遺傳快照，包括那些傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以檢測(cè)到的微生物。這種方法不僅揭示了微生物種類和數(shù)量，還能夠分析微生物的代謝途徑和抗性基因，這對(duì)于食品安全監(jiān)管至關(guān)重要。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和熒光原位雜交技術(shù)也被用于目標(biāo)特定微生物或微生物群落的檢測(cè)。qPCR通過定量特定的微生物DNA序列來評(píng)估微生物群落中特定成員的相對(duì)豐度，而FISH技術(shù)則允許在微觀層面上直觀地觀察這些微生物在食品基質(zhì)中的空間分布。

4 結(jié)語

分子生物學(xué)技術(shù)為食品微生物檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，其在食品安全保障中的應(yīng)用前景廣闊。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，將進(jìn)一步提高食品微生物檢測(cè)的靈敏度、特異性和檢測(cè)效率，為確保食品安全提供更為科學(xué)、有效的手段。這不僅有助于提高公眾對(duì)食品安全的信心，也為食品行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了技術(shù)保障。

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