• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    補(bǔ)料分批發(fā)酵條件優(yōu)化提高D-泛酸的產(chǎn)量

    2022-04-18 09:24:50周海巖周斌鄒樹平張博柳志強(qiáng)
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:泛酸丙氨酸補(bǔ)料

    周海巖,周斌,鄒樹平,張博,柳志強(qiáng)*

    1(浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué)),浙江 杭州,310014)2(手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué)),浙江 杭州,310014)

    D-泛酸是水溶性的B族復(fù)合維生素(B5),作為合成輔酶A和酰基載體蛋白的一種前體發(fā)揮作用[1-2]。作為一種重要的生長因子,D-泛酸參與碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪酸的代謝[3]。目前,D-泛酸被廣泛用于醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)等領(lǐng)域[4-5]。

    D-泛酸的生產(chǎn)方法主要包括物理誘導(dǎo)結(jié)晶法、化學(xué)拆分法和生物法。物理誘導(dǎo)結(jié)晶法工藝成熟,但只能生產(chǎn)泛酸鈣,無法用于其他泛酸衍生物的生產(chǎn)。化學(xué)拆分法是目前最主要的合成方法,但拆分劑價(jià)格昂貴,分離困難,還存在毒性和環(huán)境污染問題[6-7]。通過合理運(yùn)用微生物或酶來生產(chǎn)D-泛酸,不僅能夠保證泛酸的拆分質(zhì)量而且還能減低反應(yīng)成本[8],相較化學(xué)法,生物法具有更加綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)[9]。生物酶法是利用泛酸合成酶催化D-泛解酸和β-丙氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)生成D-泛酸,反應(yīng)條件溫和,沒有副產(chǎn)物的生成,更有利于產(chǎn)品分離[10-12]。20世紀(jì)90年代,就有學(xué)者開始研究生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-泛酸,并取得了一定的成果。但是目前D-泛酸的產(chǎn)量尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求,主要原因是D-泛酸代謝途徑長、分支代謝多,目的產(chǎn)物D-泛酸的積累量不高[13];其次,在D-泛酸合成過程中,需要很多前體物質(zhì),對(duì)培養(yǎng)基要求和發(fā)酵控制比較苛刻[14-16]。

    本文以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的E.coliDPA21/pBCST3為D-泛酸生產(chǎn)菌株,在5 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化,主要包括在分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中對(duì)發(fā)酵溫度、pH、轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化,以及在補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中對(duì)葡萄糖和β-丙氨酸的流加方式和濃度進(jìn)行優(yōu)化,以進(jìn)一步提高D-泛酸的產(chǎn)量,初步建立高效的發(fā)酵調(diào)控工藝,為后期的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    E.coliDPA21/pBCST3,保藏于浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所。E.coliDPA21的基因型為DPA17ΔpoxB ΔpflB ΔldhA ΔilvE。

    1.2 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L、(NH4)2SO416 g/L、KH2PO42 g/L、酵母粉2 g/L、金屬鹽溶液1 mL/L、L-異亮氨酸20 mg/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)0.2 mmol/L、卡那霉素(kanamycin,Kan)50 mg/L、維生素B15 mg/L、維生素B122 mg/L、β-丙氨酸 3 g/L。

    金屬鹽溶液(g/L):CaCl210、FeSO4·7H2O 10、ZnSO4·7H2O 1、CuSO40.20、NiCl2·7H2O 0.02。

    補(bǔ)料培養(yǎng)基:葡萄糖500 g/L、(NH4)2SO410 g/L、KH2PO414 g/L、酵母粉2 g/L、金屬鹽溶液1 mL/L、L-異亮氨酸 20 mg/L、MgSO4·7H2O 16 g/L、IPTG 0.2 mmol/L、Kan 50 mg/L、維生素B15 mg/L、維生素B122 mg/L;根據(jù)需要添加質(zhì)量濃度為30~50 g/L的β-丙氨酸。

    1.3 培養(yǎng)方法

    1.3.1 種子培養(yǎng)

    從培養(yǎng)成熟的平板中挑出單一的菌落,接入到裝有50 mL種子培養(yǎng)基(含有50 mg/L Kan)的500 mL三角瓶中,于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)14 h。

    1.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

    按照15%的接種量將種子液接入5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵罐裝液量為2 L,培養(yǎng)溫度(30±1)℃,通氣量為1.5 vvm,流加30%的氨水和30%的磷酸溶液自動(dòng)控制pH使其維持在(6.8±0.1),初始攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,后期通過偶聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)溶氧(dissolved oxygen,DO)(維持在15%左右)進(jìn)行調(diào)節(jié),直到發(fā)酵結(jié)束。

    流加培養(yǎng):在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定來補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基。

    1.4 分析方法

    1.4.1 細(xì)胞濃度測(cè)定

    取適量的發(fā)酵液用蒸餾水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?用Eppendorf BioPhotometer測(cè)量600 nm處的吸光值(OD600),使用發(fā)酵液上清液作為對(duì)照,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成菌體干重(dry cell weight,DCW),按公式(1)計(jì)算:

    DCW(g/L)=0.393 5×OD600+0.014 8

    (1)

    1.4.2 葡萄糖含量檢測(cè)

    葡萄糖濃度采用DNS法[17]進(jìn)行檢測(cè)。

    1.4.3D-泛酸檢測(cè)

    將發(fā)酵液樣品在12 000 r/min離心5 min,取1 mL上清液按照一定的比例進(jìn)行稀釋使D-泛酸的含量檢測(cè)值在儀器的檢測(cè)范圍內(nèi);通過無菌濾膜過濾后,D-泛酸的濃度使用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

    HPLC檢測(cè)條件:儀器為日本日立(HITACHI)公司Primaide,色譜柱型號(hào)為Eclipse XD8-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫30 ℃,檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長210 nm,流動(dòng)相體積比A(磷酸)∶B(乙腈)∶C(水)=1∶50∶950,流速0.9 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)用Excel和Origin 2018軟件處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 5 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.1.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)D-泛酸的影響

    溫度是影響微生物生長和存活的主要環(huán)境因素之一,溫度對(duì)發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成、發(fā)酵液的物理性質(zhì)和生物合成方向等方面。為確定最佳發(fā)酵溫度,在其他條件不變的條件下,分別設(shè)置不同的溫度(27、30、33 ℃)進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

    如圖1所示,在3種不同的溫度下,菌體生長情況在發(fā)酵后期無顯著差別,葡萄糖在22 h左右消耗完,此時(shí)細(xì)胞干重開始呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。但由于D-泛酸的生物合成與菌體生長并不是完全耦合的,在基質(zhì)消耗完全后仍會(huì)利用發(fā)酵液中的有機(jī)酸(D-泛解酸、α-酮戊二酸和α-酮異戊酸)和氨基酸(β-丙氨酸、L-谷氨酸)等其他物質(zhì)繼續(xù)合成D-泛酸,最終產(chǎn)量分別達(dá)到5.31、7.30和6.56 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度從27 ℃升高至30 ℃時(shí),D-泛酸產(chǎn)量隨之增加;隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步升高(33 ℃),D-泛酸產(chǎn)量隨之下降,原因可能為高溫會(huì)影響D-泛酸合成途徑中一些關(guān)鍵酶的活力。因此,選擇30 ℃作為分批發(fā)酵的溫度。

    a-菌體生長;b-D-泛酸生產(chǎn);c-葡萄糖消耗圖1 不同培養(yǎng)溫度下D-泛酸發(fā)酵參數(shù)Fig.1 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different temperatures

    2.1.2 不同pH對(duì)D-泛酸生產(chǎn)的影響

    隨著菌種對(duì)培養(yǎng)基中碳、氮源的利用以及有機(jī)酸和氨基酸的積累,培養(yǎng)液的pH會(huì)發(fā)生一定的變化。pH值主要影響菌體內(nèi)某些關(guān)鍵酶的活性,從而影響產(chǎn)物的產(chǎn)量。pH對(duì)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活力影響顯著[18],而D-泛酸內(nèi)酯水解酶是泛酸合成中的關(guān)鍵酶,當(dāng)pH為6.0~7.5時(shí)最有利于D-泛酸的合成。因此本實(shí)驗(yàn)選擇pH為6.2~7.4進(jìn)行研究。

    由圖2可知,在pH 6.2~7.4,pH為6.8時(shí)的菌體生長和D-泛酸合成量在整個(gè)培養(yǎng)過程中均略高于其他pH值時(shí)的水平,因此,選擇pH 6.8作為發(fā)酵pH。

    a-菌體生長;b-D-泛酸生產(chǎn);c-葡萄糖消耗圖2 不同pH條件下D-泛酸發(fā)酵參數(shù)Fig.2 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different pH

    2.1.3 不同DO對(duì)D-泛酸生產(chǎn)的影響

    如圖3所示,在發(fā)酵的前12 h,菌體生長情況基本一致,而發(fā)酵12 h后呈現(xiàn)不同的變化降勢(shì),5%、15%和25%條件下的DCW分別為7.08、7.57和7.44 g/L。DO為5%時(shí)菌體量較低,這說明攪拌轉(zhuǎn)速過低可能會(huì)造成供氧不足,從而影響菌體生長;而過高的轉(zhuǎn)速會(huì)產(chǎn)生剪切力,對(duì)菌體造成一定損傷,使其過早衰亡或自溶[20]。而18 h后,DO為15%時(shí)的D-泛酸產(chǎn)量高于其他2個(gè)溶氧條件下的產(chǎn)量,綜合考慮菌體生長、D-泛酸產(chǎn)量以及工業(yè)生產(chǎn)中能耗的因素,選擇15%作為分批發(fā)酵的溶氧水平。

    a-菌體生長;b-D-泛酸生產(chǎn);c-葡萄糖消耗圖3 不同DO條件下D-泛酸發(fā)酵參數(shù)Fig.3 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different DO levels

    2.2 β-丙氨酸補(bǔ)料方式和濃度對(duì)發(fā)酵的影響

    在發(fā)酵參數(shù)確定的基礎(chǔ)上,對(duì)β-丙氨酸的補(bǔ)料方式進(jìn)行優(yōu)化。主要分為β-丙氨酸與糖混合流加和β-丙氨酸單獨(dú)流加2種方式,β-丙氨酸的質(zhì)量濃度為30、40、50 g/L。

    由圖4和圖5可知,在2種不同的β-丙氨酸補(bǔ)料條件下,D-泛酸的最高產(chǎn)量均在β-丙氨酸質(zhì)量濃度40 g/L時(shí),混合流加方式下最高產(chǎn)量為40.25 g/L,高于分開流加時(shí)的27.38 g/L。比較在同一種β-丙氨酸流加方式不同濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵20 h左右,即開始補(bǔ)糖時(shí),D-泛酸的合成速率出現(xiàn)差異,流加質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí),D-泛酸合成速率最高,但快速進(jìn)入生產(chǎn)穩(wěn)定期。流加質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí),D-泛酸合成速率先增大后減小,緩慢進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)流加質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),D-泛酸的合成速率較補(bǔ)料前有所下降,但D-泛酸產(chǎn)量一直處于緩慢增長狀態(tài)。說明β-丙氨酸的流加濃度對(duì)D-泛酸的合成有顯著的影響。原因可能為在20 h左右菌體內(nèi)合成D-泛酸的相關(guān)酶活力較高,能夠?qū)⑤^高濃度的β-丙氨酸轉(zhuǎn)化合成D-泛酸。在35 h左右,菌體的活力開始下降,不能夠迅速地將β-丙氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化,此時(shí),β-丙氨酸消耗速率小于補(bǔ)給速率,使胞外β-丙氨酸大量積累,從而抑制D-泛酸的合成。

    a-30 g/L;b-40 g/L;c-50 g/L圖4 混合流加方式下β-丙氨酸的濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of β-alanine concentration in mixed feeding mode

    a-30 g/L;B-40 g/L;C-50 g/L圖5 單獨(dú)流加方式下β-丙氨酸的濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of β-alanine concentration under separate feeding mode

    2.3 葡萄糖補(bǔ)料方式優(yōu)化

    在β-丙氨酸的補(bǔ)料工藝確定的基礎(chǔ)上,對(duì)補(bǔ)糖工藝進(jìn)行優(yōu)化。葡萄糖作為一種重要的發(fā)酵底物,對(duì)微生物生長和代謝至關(guān)重要。從前期的分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在D-泛酸分批發(fā)酵結(jié)束時(shí),菌體生長和D-泛酸合成都沒有出現(xiàn)快速的下降。因此在葡萄糖耗盡之前如果及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖,將可以提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。目前,葡萄糖的流加方式有很多種,本實(shí)驗(yàn)結(jié)合D-泛酸合成的特性,采用2種補(bǔ)料方式,即脈沖補(bǔ)料和勻速補(bǔ)料進(jìn)行D-泛酸的發(fā)酵。理論上較低的葡萄糖濃度更有利于發(fā)酵[21],根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和ZHANG等[16]的研究,發(fā)現(xiàn)糖質(zhì)量濃度維持在5 g/L左右時(shí)有利于D-泛酸的積累。所以當(dāng)殘余葡萄糖質(zhì)量濃度下降到5 g/L或以下時(shí)開始進(jìn)行葡萄糖流加。

    2.3.1 不同脈沖濃度對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響

    由圖6可知,在3種不同脈沖(5~10、5~20、5~30 g/L)條件下,DCW變化趨勢(shì)相似。在發(fā)酵后期,當(dāng)脈沖質(zhì)量濃度為5~30 g/L時(shí),D-泛酸的合成早于其他2種條件下達(dá)到平衡,但產(chǎn)量較低;而脈沖質(zhì)量濃度為5~10 g/L時(shí),D-泛酸的產(chǎn)量明顯高于其他2種條件下的水平,達(dá)到41.5 g/L,表明低濃度的葡萄糖更有利于D-泛酸的合成。

    a-5~10 g/L;b-5~20 g/L;c-5~30 g/L圖6 不同脈沖糖濃度對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of different pulsed glucose concentrations on D-pantothenic acid production

    2.3.2 不同恒速補(bǔ)糖對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響

    分別以2.0、2.5和3.0 g/(L·h)進(jìn)行勻速補(bǔ)糖。由圖7-a可知,當(dāng)補(bǔ)糖速率為2.0 g/(L·h)時(shí),發(fā)酵過程中出現(xiàn)較長時(shí)間的低糖(<5 g/L)階段,菌體生長較緩慢。而當(dāng)補(bǔ)糖速率為2.5 g/(L·h)時(shí)(圖7-b),糖質(zhì)量濃度可以很好地控制在5~10 g/L,菌體生長速率也相對(duì)更快,最終D-泛酸產(chǎn)量達(dá)到32.33 g/L。而當(dāng)補(bǔ)糖速率為3.5 g/(L·h)時(shí)(圖7-c),發(fā)酵后期由于補(bǔ)糖速率超過菌體耗糖速率,發(fā)酵液中糖濃度過高而導(dǎo)致菌體生長和D-泛酸受到影響。總體而言,在勻速補(bǔ)料條件下,D-泛酸的最高產(chǎn)量(32.33 g/L)明顯低于間歇性補(bǔ)料(5~10 g/L)的最高產(chǎn)量(41.5 g/L)。因此,最佳的葡萄糖流加方式為脈沖補(bǔ)料,質(zhì)量濃度為5~10 g/L。

    a-2.0 g/(L·h);b-2.5 g/(L·h);c-3.0 g/(L·h)圖7 不同勻速補(bǔ)糖對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of different rates of glucose supplementation on D-pantothenic acid production

    3 結(jié)論

    通過對(duì)D-泛酸發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行考察,確定5 L發(fā)酵罐的最佳培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、pH 6.8、DO 15%,確定了最佳的β-丙氨酸流加方式,即與葡萄糖溶液混合流加,且β-丙氨酸質(zhì)量濃度最佳為40 g/L。在此基礎(chǔ)上,通過比較脈沖補(bǔ)料和勻速補(bǔ)料方式確定葡萄糖以5~10 g/L的質(zhì)量濃度進(jìn)行脈沖式補(bǔ)料對(duì)于提高D-泛酸的產(chǎn)量效果更好,D-泛酸的最高產(chǎn)量達(dá)到41.5 g/L。后續(xù)需進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間,簡(jiǎn)化發(fā)酵操作流程來提高產(chǎn)量以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

    猜你喜歡
    泛酸丙氨酸補(bǔ)料
    反應(yīng)型冷補(bǔ)料與溶劑型冷補(bǔ)料路用性能對(duì)比研究
    無償獻(xiàn)血采血點(diǎn)初篩丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高的預(yù)防及糾正措施研究
    精補(bǔ)料增重凈能對(duì)西雜肉牛育肥性能和成本的影響
    喝粥泛酸 配點(diǎn)菜
    釀酒酵母產(chǎn)泛酸工程菌株的構(gòu)建與誘變
    本地白山羊和隆林山羊冬春季補(bǔ)料效果對(duì)比試驗(yàn)
    絕非泛泛而為
    ——水溶性維生素泛酸篇
    廢舊鎂鉻磚再生料在RH浸漬管噴補(bǔ)料中的應(yīng)用
    丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶快速檢測(cè)在血站血液采集前應(yīng)用的意義研究
    泛酸激酶及其抑制劑的研究進(jìn)展
    欧美成人午夜精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 色吧在线观看| 国产精品 国内视频| 免费高清在线观看日韩| a级片在线免费高清观看视频| 丁香六月天网| 熟妇人妻不卡中文字幕| av不卡在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 桃花免费在线播放| 伦理电影大哥的女人| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 人妻人人澡人人爽人人| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 男女免费视频国产| 久久国产精品大桥未久av| 看免费成人av毛片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 三上悠亚av全集在线观看| 美女视频免费永久观看网站| videossex国产| 一本大道久久a久久精品| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美精品国产亚洲| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产又色又爽无遮挡免| 涩涩av久久男人的天堂| 激情视频va一区二区三区| 性色avwww在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲欧洲国产日韩| 日本色播在线视频| 交换朋友夫妻互换小说| 男女下面插进去视频免费观看| 波野结衣二区三区在线| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲视频免费观看视频| 少妇精品久久久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇人妻精品综合一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 婷婷色综合www| 黄色毛片三级朝国网站| 男女边吃奶边做爰视频| 十分钟在线观看高清视频www| 一区二区av电影网| freevideosex欧美| 久久99一区二区三区| www.av在线官网国产| 国产成人一区二区在线| 少妇被粗大的猛进出69影院| 丁香六月天网| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 美女福利国产在线| 久久影院123| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 最黄视频免费看| 一级,二级,三级黄色视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 18禁观看日本| 亚洲精品中文字幕在线视频| 香蕉精品网在线| 少妇熟女欧美另类| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av卡一久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品二区激情视频| 久久国产精品大桥未久av| 夫妻性生交免费视频一级片| videosex国产| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产色婷婷99| 男女午夜视频在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲国产色片| 日韩 亚洲 欧美在线| 丰满少妇做爰视频| 国产精品免费视频内射| 嫩草影院入口| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 大话2 男鬼变身卡| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品av久久久久免费| 欧美日韩综合久久久久久| 看十八女毛片水多多多| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲精品一二三| 精品视频人人做人人爽| 久久精品国产亚洲av天美| av在线老鸭窝| 国产成人欧美| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲图色成人| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 波野结衣二区三区在线| 99国产综合亚洲精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 波野结衣二区三区在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品一二三| 男人添女人高潮全过程视频| 男女午夜视频在线观看| 成年av动漫网址| 久久精品久久久久久久性| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 少妇 在线观看| 国产精品免费视频内射| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 好男人视频免费观看在线| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 高清av免费在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人91sexporn| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产av新网站| 精品一区二区免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩大片免费观看网站| 国产国语露脸激情在线看| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区三区精品91| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 性色avwww在线观看| 午夜老司机福利剧场| 丰满少妇做爰视频| 亚洲成人手机| av卡一久久| 亚洲国产最新在线播放| 日本欧美国产在线视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品日本国产第一区| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜激情av网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 国产日韩欧美亚洲二区| 国产野战对白在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久狼人影院| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲男人天堂网一区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲第一av免费看| 精品视频人人做人人爽| 国产精品国产av在线观看| 日韩伦理黄色片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 成人国产av品久久久| 9热在线视频观看99| 久久久精品区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| videos熟女内射| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久免费观看电影| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热网站在线观看| 七月丁香在线播放| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品免费大片| 国产亚洲最大av| 人妻人人澡人人爽人人| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美在线黄色| 国产av一区二区精品久久| 精品酒店卫生间| 黄片无遮挡物在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 高清av免费在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| a 毛片基地| 人妻系列 视频| 国产成人精品一,二区| 在线观看人妻少妇| 免费在线观看完整版高清| 亚洲经典国产精华液单| 永久免费av网站大全| 满18在线观看网站| 青草久久国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 水蜜桃什么品种好| 精品亚洲成国产av| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久鲁丝午夜福利片| 免费观看在线日韩| 美女主播在线视频| 久久ye,这里只有精品| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久久国产电影| 在线观看免费视频网站a站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费观看在线日韩| av在线观看视频网站免费| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日韩中文字幕视频在线看片| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久网色| 成人二区视频| 涩涩av久久男人的天堂| 久久亚洲国产成人精品v| 精品福利永久在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品三级大全| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲图色成人| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲经典国产精华液单| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品乱久久久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产一区有黄有色的免费视频| av在线老鸭窝| www.av在线官网国产| 老鸭窝网址在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲av免费高清在线观看| 超碰97精品在线观看| 日韩视频在线欧美| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线观看免费日韩欧美大片| 男女边吃奶边做爰视频| videossex国产| 黄色 视频免费看| 亚洲三级黄色毛片| 91精品三级在线观看| av.在线天堂| 成人手机av| 亚洲综合色网址| 最近中文字幕高清免费大全6| 高清欧美精品videossex| 久久精品久久久久久久性| 波多野结衣av一区二区av| 深夜精品福利| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品视频女| 美女国产视频在线观看| 中国国产av一级| 精品久久久精品久久久| 性色av一级| 亚洲综合色惰| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产在视频线精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产xxxxx性猛交| 黄色一级大片看看| 满18在线观看网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产片内射在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 18禁动态无遮挡网站| 考比视频在线观看| 永久网站在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一级毛片电影观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| av视频免费观看在线观看| 久久影院123| 亚洲欧美清纯卡通| 美女福利国产在线| 人妻人人澡人人爽人人| 日日啪夜夜爽| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美日韩视频精品一区| 丰满乱子伦码专区| 欧美日韩精品网址| 波多野结衣av一区二区av| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲综合色惰| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲国产成人一精品久久久| 九草在线视频观看| 街头女战士在线观看网站| 在线观看三级黄色| 最近手机中文字幕大全| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品久久蜜臀av无| 免费日韩欧美在线观看| 99久久人妻综合| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲精品,欧美精品| 91久久精品国产一区二区三区| 少妇 在线观看| 日本欧美视频一区| 叶爱在线成人免费视频播放| √禁漫天堂资源中文www| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲伊人色综图| 久久女婷五月综合色啪小说| 一区在线观看完整版| 精品国产国语对白av| 老熟女久久久| 国产av码专区亚洲av| 少妇人妻久久综合中文| 嫩草影院入口| videos熟女内射| av.在线天堂| 国产一区二区 视频在线| 韩国av在线不卡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品三级大全| 亚洲av综合色区一区| 1024香蕉在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 色哟哟·www| 久久人人爽人人片av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 丰满乱子伦码专区| 97精品久久久久久久久久精品| 少妇的逼水好多| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲国产精品一区三区| 在线观看www视频免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 观看av在线不卡| 男男h啪啪无遮挡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 色94色欧美一区二区| 一级片'在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人国语在线视频| 亚洲四区av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产免费福利视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 女性被躁到高潮视频| 美女中出高潮动态图| 大话2 男鬼变身卡| √禁漫天堂资源中文www| 狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜福利一区二区在线看| 2022亚洲国产成人精品| 久久热在线av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人午夜福利电影在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产一区二区 视频在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 黄片无遮挡物在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产爽快片一区二区三区| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲国产av影院在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 精品一区二区三卡| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产人伦9x9x在线观看 | 男的添女的下面高潮视频| 日韩大片免费观看网站| 色视频在线一区二区三区| 亚洲美女搞黄在线观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久狼人影院| 大香蕉久久成人网| 中文字幕av电影在线播放| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线看a的网站| 有码 亚洲区| 久久久精品区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产麻豆69| 色婷婷久久久亚洲欧美| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品偷伦视频观看了| 91精品国产国语对白视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 看非洲黑人一级黄片| 2021少妇久久久久久久久久久| 宅男免费午夜| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲综合精品二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 两性夫妻黄色片| 最近手机中文字幕大全| 18禁国产床啪视频网站| 欧美bdsm另类| 又黄又粗又硬又大视频| 国产又色又爽无遮挡免| 91国产中文字幕| 高清不卡的av网站| av在线app专区| 1024视频免费在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜日本视频在线| 天堂8中文在线网| 日韩一区二区视频免费看| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品嫩草影院av在线观看| 考比视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 大片免费播放器 马上看| 考比视频在线观看| 日本色播在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 夫妻午夜视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲国产看品久久| 免费在线观看黄色视频的| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 黄色怎么调成土黄色| 精品视频人人做人人爽| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜日本视频在线| 亚洲综合精品二区| 捣出白浆h1v1| 欧美少妇被猛烈插入视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 嫩草影院入口| 尾随美女入室| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品女同一区二区软件| 国产野战对白在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 国产在线视频一区二区| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品久久久av美女十八| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产片内射在线| 一个人免费看片子| 国产精品一国产av| 在现免费观看毛片| 免费高清在线观看日韩| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产深夜福利视频在线观看| 国产极品天堂在线| 国产精品久久久久久av不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| av福利片在线| 国产精品99久久99久久久不卡 | 伦精品一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久久国产电影| 这个男人来自地球电影免费观看 | 精品国产国语对白av| 久久av网站| 国产男女内射视频| 久久久a久久爽久久v久久| 免费在线观看黄色视频的| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费观看无遮挡的男女| 免费看不卡的av| 少妇的丰满在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 午夜日本视频在线| 欧美人与性动交α欧美软件| 成年人免费黄色播放视频| 国产精品三级大全| 伊人久久国产一区二区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 色94色欧美一区二区| 两个人看的免费小视频| 美女午夜性视频免费| 国产一区二区在线观看av| 亚洲三区欧美一区| 在线看a的网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品 国内视频| 高清欧美精品videossex| 国产一区二区激情短视频 | 欧美少妇被猛烈插入视频| av在线老鸭窝| 精品国产一区二区久久| 国产成人欧美| 亚洲av国产av综合av卡| 国产片特级美女逼逼视频| 黑丝袜美女国产一区| 看免费av毛片| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 精品亚洲成国产av| 一区二区av电影网| 飞空精品影院首页| 一区二区三区精品91| 日韩 亚洲 欧美在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 性色avwww在线观看| 看免费成人av毛片| 成人影院久久| 亚洲第一青青草原| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产成人免费无遮挡视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 搡老乐熟女国产| 国产午夜精品一二区理论片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日本91视频免费播放| 桃花免费在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一区二区av电影网| 国产爽快片一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 99热全是精品| 麻豆av在线久日| 人妻少妇偷人精品九色| 成人毛片60女人毛片免费| 女性被躁到高潮视频| 在线看a的网站| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产最新在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 男男h啪啪无遮挡| 精品酒店卫生间| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99国产精品免费福利视频| 亚洲情色 制服丝袜| 熟女av电影| 9色porny在线观看| 熟女av电影| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲第一青青草原| 成人漫画全彩无遮挡| 黄片小视频在线播放| 色视频在线一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 美国免费a级毛片| 亚洲欧美精品自产自拍| 我要看黄色一级片免费的| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲av日韩在线播放| 女性被躁到高潮视频| 电影成人av| av女优亚洲男人天堂| 一区二区三区精品91| 中文字幕制服av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费在线观看黄色视频的| 99久久人妻综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产在线一区二区三区精| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产看品久久| 黑人猛操日本美女一级片| 尾随美女入室| av国产精品久久久久影院| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧美清纯卡通|