擬南芥細胞膜質(zhì)子泵對硝酸鹽吸收利用的影響

摘要： 【目的】硝態(tài)氮（NO3?-N） 是多數(shù)植物吸收利用的主要氮素形態(tài)之一，NO3?-N 的跨膜運輸需要耦合質(zhì)子共轉(zhuǎn)運，質(zhì)子運轉(zhuǎn)需要細胞膜上的質(zhì)子泵提供質(zhì)子驅(qū)動力。本研究通過分析擬南芥細胞膜質(zhì)子泵AHA1 和AHA2對硝態(tài)氮吸收的信號網(wǎng)絡，以明確硝態(tài)氮吸收過程中的分子調(diào)控機制?！痉椒ā恳砸吧虲ol-0、質(zhì)子泵基因突變體aha1-9、aha2-5 以及恢復系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5 為試驗材料，在不同NO3?-N 濃度（1、10 和20mmol/L） 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 天，觀察其表型，記錄根系生長以及生物量變化，測定根系細胞膜質(zhì)子泵蛋白及其磷酸化水平變化，檢測根系中參與NO3?-N 響應與轉(zhuǎn)運相關基因（NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4 和NLP7） 和生長素響應與轉(zhuǎn)運相關基因（ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57） 的相對表達量?！窘Y果】20 mmol/L NO3?-N 處理下各材料之間的生長無顯著差異。在1 和10 mmol/L NO3?-N 條件下，與野生型相比，aha1-9 和aha2-5 的主根長度、側(cè)根數(shù)量、根部和地上部生物量均顯著降低。1 mmol/L NO3?-N 時，aha1-9 的上述指標與野生型的差異顯著大于aha2-5?；謴拖礎HA1/aha1-9、AHA2/aha2-5 在各個NO3?-N 供應水平下均與野生型差異不顯著。通過分離根系細胞膜發(fā)現(xiàn)，在1、10 mmol/L NO3?-N 條件下，相比野生型，aha1-9 和aha2-5 的細胞膜質(zhì)子泵蛋白水平分別降低了68%、19% 和36%、53%，質(zhì)子泵蛋白磷酸化水平分別降低了83%、43% 和16%、42%；在20 mmol/L NO3?-N 條件下，aha1-9 和aha2-5 的質(zhì)子泵蛋白水平與野生型差異不顯著，但磷酸化水平顯著降低。通過RT-qPCR 測定發(fā)現(xiàn)，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，aha1-9、aha2-5 根系中的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NLP7 表達量相比野生型顯著下調(diào)，10 和20 mmol/L NO3?-N 條件下均沒有顯著差異。此外，在1 和10 mmol/LNO3?-N 條件下aha1-9、aha2-5 中的ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57 表達量顯著上調(diào)，然而在20 mmol/L NO3?-N條件下其表達量沒有顯著差異?！窘Y論】低氮條件下，敲除細胞膜質(zhì)子泵基因不僅降低其自身蛋白的合成和磷酸化水平，同時也影響硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因和生長素相關基因的表達，進而抑制植物的生長。

關鍵詞： 擬南芥； 硝酸鹽； 細胞膜質(zhì)子泵； AHA1； AHA2

氮（N） 是植物生長必需的營養(yǎng)元素，它參與氨基酸、核酸和許多代謝物的合成，對植物生長發(fā)育和新陳代謝至關重要[1]。自然條件下，植物以吸收土壤中的無機氮為主，其中無機氮主要有兩種形態(tài)：硝態(tài)氮（NO3?-N） 和銨態(tài)氮（NH4+-N）。多數(shù)植物主要以吸收NO3?-N 為主[2]，根系細胞中的NO3?經(jīng)過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶迅速還原為NH4+，然后通過谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS） 和谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT） 途徑同化成氨基酸[3]。為適應土壤中氮素濃度的變化，植物根系進化出了高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（high-affinity nitratetransport system，HATS） 與低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（low-affinity nitrate transport system，LATS），前者主要在lt;1 mmol/L NO3?低濃度溶液中發(fā)揮作用，后者在gt;1 mmol/L NO3?時起作用[4]。在擬南芥中，參與硝酸鹽吸收的轉(zhuǎn)運蛋白主要包括兩大類：NRT1 （nitratetransporter 1） 和NRT2 （nitrate transporter 2）[5]。其基因組中有60 個基因編碼NRT 蛋白，包括53 個NRT1家族基因和7 個NRT2 家族基因，其中NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2 和NRT2.4 在NO3?-N 吸收中發(fā)揮主要作用[6]。NRT1.1 主要定位于根表皮、皮層和內(nèi)皮層細胞質(zhì)膜上，對NO3?-N 吸收表現(xiàn)出雙親和性，外界環(huán)境中硝酸鹽濃度和蛋白第101 位點的蘇氨酸磷酸化狀態(tài)決定了NRT1.1 具有低親和或高親和的功能[7?8]。NRT1.1 的表達受到生長素等植物激素的調(diào)控，研究表明生長素IAA 增強了NRT1.1 表達，促進硝酸鹽的吸收[9]。NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4 均為高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，分布于根表皮或皮層細胞質(zhì)膜，其表達受到硝酸鹽的誘導[4， 10?12]。NO3?-N 除了作為礦質(zhì)元素外，它還是一種重要的信號分子，可以誘導許多參與NO3?-N 吸收、代謝等途徑基因的表達[13]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子NLP7 可作為硝態(tài)氮的受體，感受外界環(huán)境中硝酸鹽濃度，進而激活下游NRT2.1、NRT2.2 和硝酸鹽還原相關基因NIR 和NIA1 等的表達[14]。

盡管硝酸鹽的吸收和運輸由硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白負責，但是作為陰離子，其跨膜運輸過程是一種需要質(zhì)子協(xié)同的主動運輸[15?18]，由于氮素是作物吸收最多的一種礦質(zhì)營養(yǎng)，因此維持其吸收需要大量的質(zhì)子驅(qū)動力。但是硝酸鹽吸收與質(zhì)子泵相互之間的作用關系在分子生物學水平上還未得到充分的驗證。

植物細胞膜質(zhì)子泵（plasma membrane H+-ATPase，PMA） 是一類利用水解ATP 產(chǎn)生能量，將細胞質(zhì)中的H+逆濃度泵出細胞的運輸?shù)鞍?。PMA 不僅參與維持細胞內(nèi)pH 穩(wěn)態(tài)、細胞伸長生長、礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收與轉(zhuǎn)運、氣孔運動等生理過程[19?24]，而且在植物逆境響應中也發(fā)揮重要作用，如鹽、低溫、干旱、鋁毒等[25?29]。PMA 是一個由多基因家族編碼的蛋白質(zhì)，在擬南芥中有11 個基因：AHA1～AHA11[30]。不同AHA 基因的表達具有一定的組織特異性和功能特殊性。在擬南芥中，AHA1 和AHA2 的表達量較高，且在各組織器官中廣泛表達，參與氣孔運動、根系生長、下胚軸伸長、逆境響應等過程[31?32]；AHA4 主要在根系皮層中表達，參與調(diào)節(jié)植物的耐鹽性[ 3 3 ]；AHA10 定位于液泡膜，在正在發(fā)育的種子中有較高表達，參與種皮內(nèi)皮中原花青素的形成[34]；AHA3 調(diào)節(jié)花粉發(fā)育[33?35]；AHA6、AHA8 和AHA9 與花粉管生長密切相關[20]。據(jù)報道，PMA 也參與調(diào)控養(yǎng)分缺乏導致的根系構型的改變。AHA2 在根系中受硝態(tài)氮誘導表達，aha2 突變體在不同硝態(tài)氮水平條件下主根和側(cè)根的長度均顯著降低[36]。也有報道表明，AHA2和AHA7 在根表皮細胞中表達占優(yōu)勢，AHA2 驅(qū)動細胞擴張而調(diào)節(jié)根系生長，但AHA2 和AHA7 負向調(diào)節(jié)根毛的伸長[37]。低磷條件下，擬南芥AHA2 和AHA7 在根系的表達上調(diào)，分別調(diào)節(jié)主根和根毛的生長[38]。但是有關PMA 調(diào)控養(yǎng)分脅迫造成的根系構型改變的具體機制并不明確。

有研究認為，植物激素可通過影響PMA 進而調(diào)節(jié)根系構型。例如，外源茉莉酸甲酯誘導萵苣幼苗根毛形成的過程與PMA 活性增強引起的根際酸化有關[39]。研究發(fā)現(xiàn)，生長素通過胞內(nèi)TIR1/AFB 信號途徑引起H+內(nèi)流而使質(zhì)外體堿化，而外源添加生長素可以引起AHA2 倒數(shù)第二個氨基酸殘基（蘇氨酸） 的磷酸化修飾[40]。PMA 的C-末端自抑制域發(fā)生磷酸化或去磷酸化可以改變其活性[41?42]。當C-末端倒數(shù)第二個殘基（蘇氨酸） 發(fā)生磷酸化后與14-3-3 蛋白結合，PMA 活性隨即被激活[43?46]。生長素響應蛋白SAUR9和SAUR19 能夠與磷酸酶PP2C.D 相互作用，通過抑制PP2C.D 活性，使質(zhì)子泵C-末端倒數(shù)第二個蘇氨酸殘基去磷酸化，抑制PMA 活性[47?50]。但是有關硝酸鹽供應是否也會影響PMA 在蛋白水平上發(fā)生磷酸化修飾，進而影響質(zhì)子泵活性和根系生長，則還不清楚。

在本研究中，以擬南芥野生型Col-0 和突變體aha1-9、aha2-5 以及恢復系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5 作為研究對象，通過不同濃度硝態(tài)氮處理，觀察其生長表型，分析PMA 蛋白水平和磷酸化水平變化，以及對硝酸鹽吸收和生長素相關的基因在轉(zhuǎn)錄水平的影響，探究AHA1 和AHA2 與根系吸收NO3?-N 之間可能的相互調(diào)控關系和機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥野生型C o l - 0 （ W T ），突變體a h a 1 - 9（At2g18960： SAIL_1285_D12）、aha2-5 （AT4G30190：SALK_022010），AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5。

1.2 試驗設計

取適量擬南芥種子裝入1.5 mL EP 管中，加入1 mL 次氯酸鈉消毒液進行表面消毒，10 min 后用無菌水清洗干凈。將滅菌后的種子點在1/2 MS 培養(yǎng)基上，4℃ 春化2 天后放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 天后挑選長勢一致的幼苗分別移至1、10、20 mmol/L NO3?-N培養(yǎng)基上繼續(xù)生長10 天。光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：光照強度為100 μmol/（m2·s），溫度為22℃，相對濕度為70%，光照時長為16 h 光照/8 h 黑暗。

對擬南芥野生型Col-0，突變體aha1-9、aha2-5、AHA/1aha1-9、AHA2/aha2-5 進行1、10、20 mmol/LNO3?-N 處理，觀察生長表型，分析質(zhì)子泵蛋白和磷酸化水平變化，檢測相關調(diào)控基因的表達。

1.3 試驗方法

1.3.1 植株生長指標的測定

WT、aha1-9 和aha2-5 以及AHA/1aha1-9 和AHA2/aha2-5 分別在1、10、20 mmol/L NO3?-N 培養(yǎng)基垂直培養(yǎng)10 天后，選取一定數(shù)量長勢相近的植株，分別測量其主根長度和側(cè)根數(shù)量，并對地上和地下部分稱取鮮重。

1.3.2 實時熒光定量PCR

用MagZolTM Reagent（Trizol reagent） 試劑盒（廣州美基生物科技有限公司） 提取根系總RNA，利用HiScript III 1st StrandcDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper） （諾唯贊公司） 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix （諾唯贊公司） 進行熒光定量PCR。引物信息見表1。

1.3.3 細胞膜質(zhì)子泵蛋白的提取及蛋白和磷酸化水平檢測

WT 和aha1-9、aha2-5 分別在1、10、20mmol/L NO3? -N 培養(yǎng)基上生長10 天后，參照Zhu等[51]的方法提取根系細胞膜蛋白，并用BCA 試劑盒測定蛋白含量。取相同含量的膜蛋白進行Westernblot，分別用Anti-H+-ATPase 和Anti-pThr 抗體（由名古屋大學木下俊則教授惠贈） 檢測細胞膜質(zhì)子泵蛋白量和磷酸化水平變化，同時以Actin 作為內(nèi)參蛋白，內(nèi)參蛋白抗體（Sigma-Aldrich， St. Louis， MO， USA，Cat#057M4548） 稀釋3000 倍，并用ImageJ 進行灰度統(tǒng)計。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2019 和SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理和單因素方差分析，結果采用沃勒–鄧肯法比較不同處理平均值之間差異的顯著性，運用GraphPad Prism 8 進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 AHA1/2 的缺失抑制低氮下植物的生長

WT 和a h a 1 - 9、a h a 2 - 5 分別在含有1、1 0、20 mmol/L NO3?-N 的培養(yǎng)基上生長10 天，觀察其表型，發(fā)現(xiàn)在20 mmol/L NO3?-N 培養(yǎng)條件下，突變體和WT 之間表型差異不顯著，其地上部和地下部生物量，包括主根長和側(cè)根數(shù)量均沒有明顯差異（圖1A～E）。但是在10 mmol/L NO3?-N 條件下，相比于WT，兩個突變體開始都表現(xiàn)出根系生長受抑制，地上部與根系生物量顯著降低，側(cè)根數(shù)顯著減少（圖1A～E，Plt;0.05）。隨著外源硝酸鹽濃度的降低，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，aha1-9 與aha2-5的地上部和根系生長受抑制更為嚴重，且aha1-9 的受抑制程度尤為顯著。具體來看，在1 mmol/L NO3?-N下，與WT 相比，aha1-9 和aha2-5 的地上部鮮重分別降低了55% 和27% （圖1 B，Plt;0.01），根系鮮重分別降低了55% 和31% （圖1C，Plt;0.01），主根長度分別縮短了38% 和11% （圖1D，Plt;0.01），側(cè)根數(shù)分別減少了55% 和33% （圖1E，Plt;0.01）。上述結果說明，在NO3?低于20 mmol/L 情況下，質(zhì)子泵基因突變導致地上部與地下部的生長受到顯著抑制。但在高濃度NO3?供應下，這種抑制情況又會得到解除。

本研究進一步對恢復系AHA1/aha1-9 和AHA2/aha2-5 進行不同濃度NO3?-N 處理，發(fā)現(xiàn)不論在何種NO3?-N 濃度下，恢復系植株的生長均與野生型無異（圖2）。以上結果說明，在1 和10 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 或AHA2 的突變都會抑制植株生物量和根系生長，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 突變引起的生長抑制作用顯著大于AHA2。

2.2 不同硝態(tài)氮濃度下AHA1/2 基因突變對細胞膜質(zhì)子泵蛋白和磷酸化水平的影響

分別提取上述不同濃度NO3?-N 下WT 和aha1-9、aha2-5 的根系膜蛋白，用Anti-H+ -ATPase 和Anti-pThr 抗體通過western blot 方法分別檢測其質(zhì)子泵蛋白量和磷酸化的變化情況。如圖3 所示，在20 mmol/L NO3?-N 下，aha1-9 和aha2-5 的Anti-H+-ATPase 條帶與WT 差異不大，但Anti-pThr 條帶有所減弱，說明磷酸化水平降低；在1、10 mmol/LNO3?-N 條件下，aha1-9、aha2-5 的Anti-H+-ATPase和Anti-pThr 條帶均比WT 弱，表明低氮條件下AHA1 或AHA2 的缺失抑制質(zhì)子泵蛋白的合成和磷酸化修飾。尤其在1 mmol/L NO3?-N 的條件下，aha1-9 的條帶灰度達到最低（圖3A），從灰度統(tǒng)計可看出，aha1-9 的相對磷酸化水平和相對蛋白水平比WT 分別降低了83% 和68% （圖3B 和C，Plt;0.01）。這些結果表明，在1 和10 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 或AHA2 的突變都會降低植株質(zhì)子泵蛋白量和磷酸化水平，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 突變的影響顯著大于AHA2。

2.3 AHA1 和AHA2 在低氮下調(diào)節(jié)NO3?-N 和生長素轉(zhuǎn)運相關基因的表達

2.3.1 硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因

圖3 顯示，aha1-9、aha2-5 的質(zhì)子泵活性和磷酸化水平在低NO3?-N 條件下被抑制。因此，我們首先分析了硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關基因的轉(zhuǎn)錄情況。如圖4A～D 所示，1 mmol/LNO3?-N 條件下，與WT 相比，突變體aha1-9、aha2-5的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2 表達量顯著下調(diào)，且NRT2.2 下調(diào)倍數(shù)最大，分別下調(diào)了2.67、1.98 倍（Plt;0.01）。10 和20 mmol/L NO3?-N 條件下，與WT比較，突變體aha1-9、aha2-5 的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4 表達量與WT 差異不顯著。另外，NLP7 作為植物硝酸鹽信號的“開關”，能夠感受外界硝酸鹽濃度的變化并將信號轉(zhuǎn)至細胞內(nèi)，調(diào)節(jié)對NO3?-N 的吸收利用。圖4E 顯示，在1 mmol/L NO3?-N的條件下，與WT 比較，突變體aha1-9、aha2-5 的NLP7 的表達量顯著下調(diào)，分別下調(diào)了2.52、1.74 倍（Plt;0.01）。綜上所述，AHA1 或AHA2 的缺失顯著降低了擬南芥NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NLP7 對低氮的響應，從而抑制了NO3?-N 的吸收，導致植物生長受阻。

2.3.2 生長素相關基因

由于AHA1 和AHA2 的突變在低NO3?-N 下明顯抑制了根的生長，所以我們進一步分析了生長素運輸?shù)南嚓P基因ARF11、IAA6、PIN7 和生長素響應基因SAUR57 的轉(zhuǎn)錄情況（圖5）。結果表明，與WT 相比，1 和10 mmol/L NO3?-N 的條件下，aha1-9 和aha2-5 中ARF11、IAA6、PIN7、SAUR57 相對表達量均顯著上調(diào)，1 mmol/L NO3?-N條件下aha1-9 和aha2-5 分別上調(diào)了9.7、3.0、4.2、25.3 倍和17.9、6.0、7.0、31.1 倍（Plt;0.01）；10mmol/L NO3?-N 的條件下aha1-9 和aha2-5 分別上調(diào)了4.2、2.3、3.3、15.4 倍和7.1、3.6、4.8、24.1 倍（Plt;0.01）；在20 mmol/L NO3? -N 的條件下，aha1-9 和aha2-5 突變體與WT 差異不顯著（圖5A～D）。

3 討論

旱地土壤中由于存在硝化作用，植物吸收的氮形態(tài)主要以NO3?-N 為主，然而土壤膠體帶負電，NO3?-N 容易被淋溶損失，造成氮素利用率降低，因此研究植物對NO3?-N 的吸收利用具有重要意義。植物根系細胞吸收土壤中的NO3?主要依賴于NO3?/H+同向轉(zhuǎn)運蛋白NRT，這一過程需要細胞膜質(zhì)子泵提供質(zhì)子驅(qū)動力將NO3?運輸進入細胞內(nèi)。也有報道表明，外源添加細胞膜質(zhì)子泵活性促進劑香豆素能夠顯著促進玉米對NO3?-N 的吸收。此外，在水稻缺氮條件下，NO3?-N 誘導根系細胞膜質(zhì)子泵基因OSA2、OSA7 等表達，然而其中具體的分子調(diào)控機制并不清楚，因此研究細胞膜質(zhì)子泵活性對NO3?-N 吸收利用的調(diào)控機制具有重要意義。

我們通過對擬南芥野生型、突變體a h a 1 - 9、aha2-5 進行了不同濃度NO3?-N （1、10、20 mmol/L）的培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在1 和10 mmol/L NO3?-N 的條件下，與野生型比，aha1-9 和aha2-5 的生物量顯著降低，且其主根長度和側(cè)根數(shù)量也顯著下降，在1 mmol/LNO3? -N 條件下，aha1-9 的受抑制程度要顯著大于aha2-5 （圖1）?；謴拖礎HA1/aha1-9 和AHA2/aha2-5 在各個氮水平處理下，與野生型差異不顯著，能夠恢復正常生長（圖2）。說明在低氮條件下，AHA1 和AHA2 能夠影響根系細胞膜質(zhì)子泵活性，對硝態(tài)氮吸收利用具有重要作用，尤其是AHA1 影響更顯著，然而在20 mmol/L NO3?-N 條件下可能由于植物處于氮素飽和狀態(tài)，NO3?-N 響應基因和生長素相關基因不受誘導，從而不能夠激活下游細胞膜質(zhì)子泵，因此，在該濃度下，敲除細胞膜質(zhì)子泵AHA1和AHA2 基因?qū)O3?吸收不影響，當然具體信號傳遞路徑需要進一步驗證。M?odzińska 等[36]報道表明，擬南芥根系中AHA2 在根系受硝態(tài)氮誘導表達，aha2敲除的突變體在不同硝態(tài)氮水平條件下主根和側(cè)根的長度均顯著降低。另外，擬南芥AHA2 和AHA7也能通過改變細胞膜質(zhì)子泵活性，將細胞壁酸化調(diào)節(jié)根系生長，但AHA2 和AHA7 負向調(diào)節(jié)根毛的伸長[37]。擬南芥AHA2 和AHA7 也容易受低磷誘導表達，并分別調(diào)節(jié)主根和根毛的生長[ 4 0 ]。在局部NH4+供應下，AHA2 基因敲除能夠降低三級側(cè)根密度以及二級和三級側(cè)根長度[52]。此外，Sperandio 等[53]通過氮饑餓處理，再供應NO3?-N 可以顯著誘導根系細胞膜質(zhì)子泵OsA2、OsA7 和OsA8 基因的表達；同時在低氮條件下，OsA2 基因表達下調(diào)會顯著降低植物體內(nèi)的氮含量。也有報道表明NO3?-N 能夠誘導玉米（MHA3 和MHA4） 和葡萄（VvHA2 和VvHA4） 細胞膜質(zhì)子泵轉(zhuǎn)錄水平的提高來促進NO3?-N 吸收[54]。然而，免疫印跡試驗結果表明，在1 和10 mmol/LNO3?-N 的條件下，與野生型比，aha1-9和aha2-5 的細胞膜質(zhì)子泵蛋白水平和磷酸化水平都顯著降低（圖3），說明在低氮條件下，細胞膜質(zhì)子泵能夠通過蛋白水平和磷酸化水平變化來調(diào)節(jié)其活性，從而保證NO3?-N 吸收利用，當AHA1 或AHA2的功能缺失導致NO3? -N 吸收受到影響，從而導致aha1-9 和aha2-5 的細胞膜質(zhì)子泵蛋白水平和磷酸化水平都顯著降低。此外通過分析擬南芥根系中氮信號通路中相關基因的表達，AHA1 或AHA2 的功能缺失導致低NO3?-N 下根系NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2和NLP7 的表達量顯著降低（圖4A～C 和E）。NLP7 在擬南芥硝酸鹽信號轉(zhuǎn)導中是一個主要的硝酸鹽信號感受器和上游核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并參與初級硝酸鹽反應[55]。在1 mmol/L NO3? -N 條件下，aha1-9 和aha2-5 中NLP7 的表達水平顯著低于野生型，限制了下游高親和轉(zhuǎn)運蛋白基因NRT2.1、NRT2.2 的表達，導致擬南芥生長受到抑制。

最近的研究表明，生長素通過胞內(nèi)TIR1/AFB 信號途徑引起H+內(nèi)流而使質(zhì)外體堿化，從而抑制根系生長[41]。外源添加生長素可以通過TMK1 將AHA2蛋白C 末端的蘇氨酸磷酸化，從而激活質(zhì)子泵活性，使質(zhì)外體堿化，這個過程與胞內(nèi)生長素信號引起的質(zhì)外體堿化相互拮抗[40]。也有報道表明細胞膜質(zhì)子泵存在多個氨基酸位點受到磷酸化修飾的調(diào)控[40， 56]。磷酸酶PP2C.D 和生長素響應蛋白SAUR 是調(diào)控細胞膜質(zhì)子泵磷酸化的一個關鍵成分，SAUR9和SAUR19 能夠與PP2C.D 相互作用，通過抑制PP2C.D 活性，使質(zhì)子泵C-末端倒數(shù)第二個殘基蘇氨酸去磷酸化[47?49， 51]。我們的免疫印跡試驗結果及生長素相關基因表達分析結果表明，在1 和10 mmol/LNO3?-N 的條件下，與野生型比，aha1-9 和aha2-5 的細胞膜質(zhì)子泵磷酸化水平顯著降低，可能是由于生長素調(diào)節(jié)的相關基因IAA6 和SAUR57 等上調(diào)（圖5），導致細胞膜質(zhì)子泵去磷酸化，活性下降（圖3）。當然，這部分工作需要進一步通過蛋白互作來驗證。同時，Yang 等[57]的研究也表明，生長素可通過上調(diào)ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57 等生長素調(diào)節(jié)相關基因表達來抑制主根的伸長。此外，Miao 等[58]研究表明，干旱條件下，根系合成低濃度ABA 能夠通過與受體PYL8 結合，抑制PP2Cs 磷酸酶活性，細胞膜質(zhì)子泵去磷酸化，提高細胞膜質(zhì)子泵活性，促進主根的伸長來適應水分脅迫條件[59]；而高濃度ABA，可減少擬南芥胞外H+擠出，抑制根生長，Hayashi 等[21]報道，施用20 μmol/L ABA 可誘導AHA中Thr947 的去磷酸化，并以abi1 依賴的方式抑制下胚軸伸長。因此，在1 和10 mmol/L NO3? -N 條件下，植物可通過細胞膜質(zhì)子泵磷酸化，提高細胞膜質(zhì)子泵活性，促進根系氮素吸收和主根的伸長，而敲除細胞膜質(zhì)子泵基因能夠誘導生長素相關基因表達促進生長素合成，進而抑制根系的生長。

4 結論

本研究結果表明，在低氮條件下，細胞膜質(zhì)子泵基因敲除不僅影響其自身蛋白的合成和磷酸化水平，而且也影響硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關基因NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2 和NLP7 的表達，導致氮素的吸收受到影響。同時，敲除質(zhì)子泵基因能夠誘導生長素相關基因ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57 的表達，促進生長素合成，從而導致植物生長受到抑制。但在高氮水平下，雖然突變體中質(zhì)子泵磷酸化水平下降，但未影響硝酸鹽和生長素響應與轉(zhuǎn)運相關基因的表達，植物保持正常生長。

細胞膜質(zhì)子泵與硝態(tài)氮吸收轉(zhuǎn)運存在耦合關系，這種關系受外界硝態(tài)氮供應水平的影響，尤其是在低氮條件下，硝酸鹽吸收不僅依賴于硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，也依賴于質(zhì)子泵提供的質(zhì)子驅(qū)動力。在外界硝態(tài)氮濃度非常高的情況下，硝酸鹽也可以通過細胞膜內(nèi)外的濃度梯度差進入細胞，但是這種情況實際土壤中幾乎不存在。因此，提高作物本身的質(zhì)子泵活性仍然是促進硝態(tài)氮吸收的一個決定性因素。

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基金項目：國家自然科學基金項目 （32102482，42107047）；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目 （2019A1515110070）。