安羅替尼對腦膠質(zhì)瘤T98G細胞遷移侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

柳新 張圣林 李青山 董怡 謝云鵬

【摘要】 目的 探究安羅替尼對人腦膠質(zhì)瘤細胞黏附、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞，分為對照組（不做干預(yù)）、實驗組（2.5 μmol·L-1安羅替尼組、5 μmol·L-1安羅替尼組、10 μmol·L-1安羅替尼組）和陽性藥物組（50 mg·L-1 5-氟尿嘧啶），干預(yù)24 h。用活細胞計數(shù)（CCK-8）、細胞黏附實驗、劃痕法、Transwell小室及蛋白免疫印跡（WB）法對細胞增殖活力、黏附、遷移、侵襲能力及EMT相關(guān)蛋白表達量進行分析。結(jié)果 與對照組比較，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼組和陽性藥物組增殖活力顯著降低（P<0.05），實驗組和陽性藥物組T98G細胞黏附、遷移、侵襲能力，纖維粘連蛋白（FN）、波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）蛋白的表達水平呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢（P<0.05），而E-鈣黏蛋白（E-cadherin）蛋白的表達水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢（P<0.05），且濃度越高變化越顯著；與陽性藥物組相比，2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞增殖活力、黏附、遷移、侵襲能力，N-cadherin、Vimentin及FN的蛋白水平上調(diào)（P<0.05），而E-cadherin蛋白水平則下調(diào)（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論 安羅替尼可能是通過抑制EMT進程進而抑制人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的增殖、黏附、遷移、侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】 安羅替尼；腦膠質(zhì)瘤；黏附；遷移；侵襲；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

【中圖分類號】 R739.41? 【文獻標(biāo)志碼】 A? 【文章編號】 1672-7770（2024）03-0286-06

腦膠質(zhì)瘤屬于臨床常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點。腦膠質(zhì)瘤由于其特殊位置，發(fā)病較為隱匿，早期的臨床癥狀不明顯，因此往往發(fā)現(xiàn)時已多為晚期。手術(shù)、放化療是目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要方法；但對于晚期的腦膠質(zhì)瘤患者而言，手術(shù)治療并不適用，且該病術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，并有著較高的原發(fā)耐藥率，導(dǎo)致當(dāng)前總體療效不甚理想［12］。因此探究有效治療腦膠質(zhì)瘤的藥物具有重要意義。安羅替尼可以抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，主要通過抗血管生成作用發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。安羅替尼抗胃癌侵襲作用也有相關(guān)報道［4］。近些年多項研究顯示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的遷移、侵襲及耐藥關(guān)系密切［5］。Guan等［6］研究發(fā)現(xiàn)，敲低視黃醇脫氫酶10的表達能通過調(diào)控相關(guān)信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞的轉(zhuǎn)移，其可能與腫瘤細胞EMT過程相關(guān)，腫瘤細胞發(fā)生EMT，其黏著力、形態(tài)、基質(zhì)性狀會發(fā)生改變，細胞形態(tài)向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，具有更高侵襲力，逐漸入侵周圍的組織、血管及淋巴管等，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移［7］。目前安羅替尼對腦膠質(zhì)瘤細胞黏附、遷移、侵襲及EMT的作用尚未完全闡明，本研究旨在探討安羅替尼對腦膠質(zhì)瘤細胞T98G黏附、遷移、侵襲及EMT進程的影響，為安羅替尼對腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)治療提供體外實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞，購自上海中科院細胞庫。5-氟尿嘧啶［賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司］、安羅替尼（selleckchem公司），胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM-H培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司），活細胞計數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），鼠抗人［波形蛋白（Vimentin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）及β-actin單克隆抗體］、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG多克隆抗體（英國Abcam公司）。BBS-V500型超凈工作臺（濟南卓隆生物技術(shù)有限公司）；WMS-1033型倒置熒光顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司）；TG-21WC離心機購自山東博科公司；Gel Doc2000型凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞培養(yǎng) 將凍存細胞腦膠質(zhì)瘤T98G細胞進行復(fù)蘇后（≥80%密度）接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2，70%～80%濕度培養(yǎng)箱環(huán)境中，在完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM-H）上進行培養(yǎng)。

1.2.2 分組及給藥 將細胞分成對照組、實驗組、陽性藥物組，其中對照組細胞不做干預(yù)，實驗組（2.5 μmol·L-1安羅替尼組、5 μmol·L-1安羅替尼組、10 μmol·L-1安羅替尼組）分別以2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼進行干預(yù)。陽性藥物組以50 mg·L-1 5-氟尿嘧啶進行干預(yù)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，后置于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法測定人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的增殖活力 將細胞胰酶消化后用完全細胞培養(yǎng)液重懸，細胞傳代并以5×103個/孔的密度鋪于96孔板中，待各組干預(yù)24 h之后，各孔加入10%（v∶v）CCK8溶液，并在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)2 h，之后在酶標(biāo)儀上檢測各孔細胞在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值。細胞活力（%）=OD（實驗組或陽性藥物組）/OD對照組×100%。

1.2.4 細胞黏附實驗測定T98G細胞黏附數(shù) 用無胎牛血清培養(yǎng)液稀釋重組人纖維連接蛋白后取20 μg·mL-1鋪于96孔板，風(fēng)干后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，每次20 min。取各組干預(yù)24 h細胞，用胰蛋白酶消化細胞，并制成單細胞懸液。取100 μL單細胞懸液，濃度為1×104個/mL，加入鋪膠的96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)1 h，取出96孔板，進行3次洗滌后用甲醇進行相應(yīng)固定，時間為10 min，接著用結(jié)晶紫進行染色，時間為15 min，然后再洗滌3次，最后于50倍顯微鏡下觀察細胞黏附數(shù)。

1.2.5 劃痕法測定T98G細胞的遷移能力 將細胞接種至6孔板，細胞生長密度約為90%后進行劃痕，然后將細胞放置于37 ℃，5% CO2的條件下進行24 h培養(yǎng)。0和24 h的劃痕情況使用顯微鏡進行拍照記錄，S0與S24分別表示0和24 h的劃痕面積。細胞遷移率=（S0-S24）/S0。

1.2.6 Transwell小室法測定T98G細胞的侵襲能力 將基質(zhì)膠濃度用無血清的完全培養(yǎng)基進行稀釋（1 mg/mL）后加入Transwell小室（100 μL），孵育5 h（37 ℃，5% CO2）使其呈干膠狀。各組細胞在藥物干預(yù)24 h后，重懸在無血清的完全培養(yǎng)基中，并將1×105個細胞接種到提前包被基質(zhì)膠的Transwell小室的腔室中，Transwell小室和24孔板之間的腔室中加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。細胞在37 ℃中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小室下表面的細胞與4%組織細胞固定液室溫孵育15 min，再與1%結(jié)晶紫染色液室溫孵育20 min后利用顯微鏡進行拍照。侵襲細胞數(shù)使用Image J圖像分析軟件進行計算。

1.2.7 蛋白免疫印跡（western blotting，WB）法對EMT相關(guān)蛋白表達水平進行檢測 收集各組細胞，提取蛋白并定量，后上樣，進行凝膠電泳，200 mA電流轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，后加入鼠抗人（FN、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin及β-actin）的一抗進行孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌，加顯影液，最后利用凝膠成像系統(tǒng)，進行相應(yīng)的拍照記錄，并用Image J軟件進行蛋白灰度分析，β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示符合正態(tài)分布的計量資料，采用單因素方差和Tukey檢驗進行多組間與組間的兩兩比較，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。用GraphPad Prism 8軟件進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的增殖活力 干預(yù)24 h后，與對照組相比，2.5 μmol·L-1安羅替尼組T98G細胞增殖活力沒有顯著變化（P>0.05），5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼組和陽性藥物組細胞增殖活力顯著降低（P<0.05）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比，細胞增殖活力顯著升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比，細胞增殖活力無顯著差異（P>0.05），見圖1。

2.2 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的黏附能力 實驗組、陽性藥物組的細胞黏附數(shù)較對照組均減少；2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞黏附數(shù)較陽性藥物組增多，10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組趨勢一致（圖2A）。實驗組、陽性藥物組的細胞黏附數(shù)較對照組降低（P<0.05），且實驗組呈劑量依賴性（圖2B）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞黏附數(shù)較陽性藥物組升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組細胞黏附數(shù)較陽性藥物組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的遷移能力 實驗組、陽性藥物組的細胞遷移數(shù)較對照組則明顯減少；2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞遷移數(shù)較陽性藥物組增多，10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組趨勢一致（圖3A）。實驗組、陽性藥物組的細胞遷移率較對照組降低（P<0.05），且實驗組呈劑量依賴性（圖3B）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞遷移率較陽性藥物組升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組細胞遷移率較陽性藥物組無顯著差異（P>0.05）。

2.4 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的侵襲能力 實驗組、陽性藥物組的細胞侵襲數(shù)較對照組降低（P<0.05），且實驗組呈劑量依賴性（圖4）。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組細胞侵襲數(shù)較陽性藥物組升高（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組細胞侵襲數(shù)較陽性藥物組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞中EMT相關(guān)蛋白表達量情況 T98G細胞中E-cadherin蛋白水平較對照組發(fā)生上調(diào)（P<0.05），N-cadherin、Vimentin、FN蛋白水平發(fā)生下調(diào)（P<0.05），見圖5A、B。2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組E-cadherin蛋白表達水平較陽性藥物組下調(diào)（P<0.05），而N-cadherin、Vimentin和FN蛋白水平較陽性藥物組上調(diào)（P<0.05）；10 μmol·L-1安羅替尼組EMT相關(guān)蛋白的表達水平較陽性藥物組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤的一半，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見腫瘤。目前臨床治療腦膠質(zhì)瘤主要采用手術(shù)、放化療等治療手段，但腫瘤組織很難徹底清除，且容易復(fù)發(fā)［8］。腦膠質(zhì)瘤細胞在生長過程中具有高度侵襲性，因此研發(fā)抑制腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲性生長的治療藥物具有極重要的理論意義與應(yīng)用價值。安羅替尼屬于臨床上治療晚期非小細胞肺癌的藥物，近年來有很多相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)安羅替尼除能夠抑制肺癌細胞生長外，對其他腫瘤也同樣可以發(fā)揮抑制作用［9］。謝轉(zhuǎn)紅等［10］研究顯示，安羅替尼能夠調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在宮頸癌中，安羅替尼抑制癌細胞的遷移和侵襲也有相關(guān)報道［11］。吳廣銀等［12］通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，安羅替尼對膠質(zhì)瘤有放療增敏作用，且小窩蛋白表達下降調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶磷酸化通路改變可能是其作用機制之一。以上研究提示，安羅替尼可以抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，可為本實驗的開展提供理論支撐。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，5 μmol·L-1、10 μmol·L-1安羅替尼組和陽性藥物組增殖活力顯著降低，而實驗組和陽性藥物組細胞黏附數(shù)、遷移和侵襲能力也明顯降低，且本研究采用臨床上常用的化療藥物5-氟尿嘧啶作為陽性藥物［13］進行相關(guān)研究，結(jié)果顯示2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比增殖活力、黏附、遷移和侵襲能力顯著升高，10 μmol·L-1安羅替尼組與陽性藥物組相比增殖活力、黏附、遷移和侵襲能力無顯著差異，表明高濃度安羅替尼對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用與陽性藥作用相當(dāng)；提示安羅替尼可以抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲。

上皮細胞在一系列生物學(xué)過程中獲得具有遷移性與侵襲性間充質(zhì)表型是EMT進程的典型特征［1415］。腦膠質(zhì)瘤作為具有高度侵襲性的腫瘤細胞，其特性與其本身間質(zhì)性發(fā)生改變具有密切的關(guān)系。在多種癌癥中，均有文獻報道EMT能夠促進癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，并且和癌細胞對化療藥物耐受有密切聯(lián)系［1617］。Nan等［18］的研究也表明EMT能夠促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。在膠質(zhì)瘤細胞中，韓慶亮等［19］研究表明癌細胞的遷移和侵襲受到抑制與大黃酚調(diào)控EMT有關(guān)。張雪等［20］研究指出，在胃癌細胞中EMT相關(guān)蛋白的表達與胃癌細胞侵襲、遷移及黏附能力的增強有關(guān)。王勇等［21］研究顯示，白藜蘆醇能夠抑制EMT進程抑制人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的生長、黏附、遷移及侵襲。這些研究表明，腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長與EMT存在密切聯(lián)系。Song等［22］在對膽管癌的研究表明，安羅替尼可以通過抑制EMT抑制癌細胞的遷移和侵襲。另有研究表明，安羅替尼可顯著抑制人口腔鱗癌細胞的EMT進程［23］。在本研究中，實驗組和陽性藥物組的T98G細胞中E-cadherin蛋白水平較對照組發(fā)生上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、FN蛋白水平發(fā)生下調(diào)，且安羅替尼濃度越高作用越明顯；而相比于陽性藥物組，2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1安羅替尼組的EMT相關(guān)蛋白的表達趨勢則正好相反。以上結(jié)果與上述文獻中報道一致，提示安羅替尼可能通過抑制EMT進程，從而在腦膠質(zhì)瘤T98G細胞增殖、黏附、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，安羅替尼可抑制人腦膠質(zhì)瘤T98G細胞的增殖、黏附、遷移以及侵襲，可能與通過抑制EMT進程有關(guān)。但在其他腦膠質(zhì)瘤細胞系中安羅替尼作用是否相同，且是否涉及相關(guān)信號通路機制尚未明確，需要進一步探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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