木犀草素聯(lián)合替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤大鼠VEGF表達(dá)的影響

陳俠+唐省三+賴滿香+來慧麗+溫李滔

[摘要]目的研究木犀草素聯(lián)合替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤大鼠VEGF表達(dá)的影響。方法建立大鼠U87-MG腦膠質(zhì)瘤模型，以隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，每組20只。接種14d后給予替莫唑胺組替莫唑胺25mg/（kg·d），木犀草素組木犀草素20mg/（kg·d），聯(lián)合組給予木犀草素20mg/（kg·d）、替莫唑胺25mg/（kg·d），均配置為2mL生理鹽水溶液后腹部注射，空白組每天給予等量生理鹽水。給藥5周后將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞切片染色，免疫組化法檢測各組大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGF水平。結(jié)果聯(lián)合組VEGF陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)數(shù)量之和所占比例為20%，與空白組、木犀草素組、替莫唑胺組85%（x²=16.942）、70%（x²=10.101）、55%（x²=5.227）相比均明顯下降（P<0.05）。結(jié)論木犀草素聯(lián)合替莫唑胺治療U87-MG腦膠質(zhì)瘤，可有效抑制腫瘤VEGF表達(dá)，對腦膠質(zhì)瘤的化療效果起增敏作用。

[關(guān)鍵詞]木犀草素；替莫唑胺；腦膠質(zhì)瘤；VEGF

腦膠質(zhì)瘤為神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，惡性居多且極具浸潤性、侵襲性，治療困難且易復(fù)發(fā)，大多數(shù)患者預(yù)后不良。臨床普遍采用手術(shù)切除聯(lián)合放療、化療等手段的綜合治療策略。盡管目前對腦膠質(zhì)瘤的治療已取得長足進(jìn)步，但治療仍缺乏突破性進(jìn)展。有研究顯示腫瘤血管內(nèi)皮因子（VEGF）在腫瘤生長中起重要作用，因此VEGF的表達(dá)抑制也成為腫瘤治療的重要方向。近年來。替莫唑胺作為一種新型化療藥物已于膠質(zhì)瘤的治療中廣泛應(yīng)用，可明顯延長惡性膠質(zhì)瘤患者進(jìn)展存活時間。但該藥仍存在較重的化療毒副反應(yīng)，且難以通過血腦屏障，治療效果不夠理想。為探究新型化療方案以提升替莫唑胺的化療效果，本研究建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，并應(yīng)用木犀草素、替莫唑胺聯(lián)合治療，觀察VEGF表達(dá)變化，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)所用wistar成年雄性大鼠均由中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，符合臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，月齡18月，體重200～230g，發(fā)育健康。

1.2細(xì)胞株

本研究采用大鼠U87-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3儀器與試劑

CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERAcell 2401）由美國賽默飛公司提供，SW-CJ超凈臺購于蘇州零三凈化設(shè)備有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均從Gibco公司購置，離心機(jī)由美國Sigma公司提供，木犀草素由Sigma-aldrich提供，替莫唑胺為江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（H20040635）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞處理與懸液制備在含有10%FBS的DMEM高塘培養(yǎng)基中培養(yǎng)U87-MG細(xì)胞，在細(xì)胞生長處于對數(shù)期時加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，保持每10μL含1x10⁶個C6細(xì)胞。將懸液離心，取下層細(xì)胞備用。

1.4.2大鼠接種接種前需將大鼠以10%的水合氯醛麻醉處理，固定其頭部于腦立體定位儀并分離顯露顱骨，以大鼠右側(cè)腦尾狀核為注射靶點(diǎn)，保持1μL/min的速度注射10μL C6細(xì)胞懸液。矢狀縫右側(cè)3cm，深5cm。注射完全后以生理鹽水沖洗，縫合切口。接種14d后可開展給藥實(shí)驗(yàn)。

1.4.3分組及用藥方法按照隨機(jī)數(shù)字法將80只大鼠分為四組，每組20只。替莫唑胺組每天給予替莫唑胺25mg/kg，木犀草素組每天給予20mg/kg，聯(lián)合組每天給予木犀草素20mg/kg、替莫唑胺ZSmg/kg。均以生理鹽水配置為2mL溶液，空白組不給予藥物，每天注射生理鹽水100mL/kg，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)給藥兩周。

1.4.4檢測方法5周后將所有小鼠以過量麻醉劑處死，多聚甲醛灌注至動脈血管，并觀察大鼠腦部膠質(zhì)瘤生長狀況。采用免疫組化實(shí)驗(yàn)分別測定四組VEGF表達(dá)水平，將膠質(zhì)瘤組織冠狀切面后DAB染色測定，嚴(yán)格遵循試劑盒操作說明。經(jīng)圖像分析處理以后灰度計算目標(biāo)視野中陽性染色的單位面積。陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有橙黃色顆粒，綜合染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比例確定陰性（一）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）數(shù)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件處理分析，計數(shù)資料的組問比較行X²檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四組VEGF表達(dá)結(jié)果比較

聯(lián)合組陽性與強(qiáng)陽性數(shù)量之和所占比例為20%，與空白組、木犀草素組、替莫唑胺組85%（x²=16.942，P<0.05）、70%（x²=10.101，P<0.05）、55%（x²=5.227，P<0.05）相比均明顯下降，見表1。

2.2VEGF染色圖像比較

四組大鼠于接種4周后出現(xiàn)不同程度的消瘦、反應(yīng)遲緩的腦膠質(zhì)瘤癥狀，至第5周時癥狀加重，并明顯消瘦。膠質(zhì)瘤細(xì)胞染色圖像呈現(xiàn)不同VEGF表達(dá)水平。見圖1。

3討論

膠質(zhì)瘤是一類發(fā)病率較高的惡性實(shí)體腫瘤，腫瘤伴隨豐富的新生血管，具有浸潤性與高復(fù)發(fā)率。臨床研究已經(jīng)證實(shí)，新生血管與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后均有密切關(guān)系，膠質(zhì)瘤的惡性級別越高，血管密度越高。在膠質(zhì)瘤的實(shí)際診療中，腫瘤血管密度是一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是眾多藥物的治療方向。有眾多數(shù)據(jù)顯示，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長及血管通透性的重要調(diào)控因子，通常可在腦膠質(zhì)瘤患者體內(nèi)檢測到VEGF的高表達(dá)，并由此引起腫瘤微血管密度增加。因此，VEGF的表達(dá)可作為膠質(zhì)瘤惡性程度的有效指標(biāo)，其表達(dá)水平越高，證明病情越嚴(yán)重。

隨著對腦膠質(zhì)瘤化療藥物的研究越發(fā)深入，卡莫司汀、洛莫司汀、替莫唑胺等藥物的臨床使用也越來越廣泛，其中又以替莫唑胺的應(yīng)用最多。但近年來研究顯示，替莫唑胺存在難以通過血腦屏障、毒副反應(yīng)重的缺點(diǎn)，加上耐藥性難以克服，都導(dǎo)致化療效果仍不甚理想。因此，新型化療方案的提出勢在必行。木犀草素代表性的天然黃酮類化合物，可從多種植物中提取，具有多種顯著生物活性。近年來有大量的研究發(fā)現(xiàn)木犀草素對結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥有顯著療效，但目前還未有木犀草素應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)報道。本研究嘗試將木犀草素與替莫唑胺聯(lián)合使用于腦膠質(zhì)瘤建模的大鼠，觀察腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平，旨在探究其對化療效果的影響。

國內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)，木犀草素對胃癌BGC-823細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用，并明顯降低腫瘤VEGF的表達(dá)水平；另一項(xiàng)關(guān)于的乳腺癌的研究則表明木犀草素可通過抑制IL-8對內(nèi)皮細(xì)胞的ERK、AKT信號激活作用，進(jìn)而抑制血管生成并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果也顯示，以木犀草素聯(lián)合替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤大鼠化療治療，腫瘤細(xì)胞VEGF陽性與強(qiáng)陽性表達(dá)數(shù)量明顯下降，該百分比與空白組、單藥治療組相比均有明顯差異，表明木犀草素可提高膠質(zhì)瘤對化療藥物的敏感性，增強(qiáng)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。已有資料顯示，在化療過程中，VEGF的表達(dá)也會有所上升并促進(jìn)新生血管的生成，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，這也是影響腫瘤治療效果的中的重要障礙。但另有研究顯示，木犀草素可通過抑制COX-2的合成來減少化療導(dǎo)致的VEGF分泌量，由此抑制腫瘤血管的新生并達(dá)到化療增敏效果，也從側(cè)面證實(shí)了本文結(jié)果。此外，木犀草素還可通過腫瘤血腦屏障，可更直接的完成腫瘤細(xì)胞清除，這也是其較傳統(tǒng)藥物最顯著的優(yōu)勢，因此十分適用于腦膠質(zhì)瘤的治療中。

綜上，本研究證明木犀草素可顯著提升替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤的化療效果，有效降低聯(lián)合組VEGF表達(dá)水平，提示木犀草素在腦膠質(zhì)瘤治療中的良好應(yīng)用前景。但木犀草素對替莫唑胺化療的增敏機(jī)制尚為研究透徹，需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。