連翹總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗炎活性研究

延永 靳顏顏 張亦琳 程敏 周偉

收稿日期：2023-09-13

基金項目：陜西省重點研發(fā)項目（2024NC-YBXM-065）；陜西省教育廳2023年度服務(wù)地方專項科學研究計劃項目（產(chǎn)業(yè)化培育項目23JC026）；商洛市科技計劃項目（2022-Z0019）；陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院2022年度開放基金項目（23HKY033）；陜西省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（S202311396049）

作者簡介：延 永（1988-），男，陜西綏德人，講師，碩士，主要從事功能植物分子開發(fā)利用研究，（電話）0914-2363187（電子信箱）yananan@yeah.net；通信作者，程 敏（1978-），女，陜西商洛人，教授，博士，主要從事中藥制劑與藥效學相關(guān)研究，（電話）0914-2363187（電子信箱）exitxiaobai@163.com。

延 永，靳顏顏，張亦琳，等. 連翹總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗炎活性研究［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2024，63（5）：156-161．

摘要：通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計，評價浸泡時間、料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間對連翹（Forsythia suspensa）總黃酮提取率的影響，建立數(shù)學模型，得出二次回歸方程，預測連翹總黃酮提取的最佳工藝條件，并對新工藝提取的連翹總黃酮進行小鼠耳廓急性炎癥腫脹抑制效果評價，測試連翹總黃酮提取物的抗炎活性。結(jié)果表明，最佳工藝條件為料液比1∶20、浸泡時間30 min、提取溫度58 ℃、乙醇濃度60%、提取時間79 min。經(jīng)驗證，新工藝的平均提取率為14.54%。新工藝提取的連翹總黃酮提取液處理二甲苯急性致炎的小鼠耳廓的腫脹值為（15.61±2.73）mg，低于生理鹽水處理后的腫脹值（17.21±2.65）mg，體外抗炎試驗表明連翹總黃酮提取物可抑制小白鼠耳廓的炎癥腫脹。引入浸泡環(huán)節(jié)的連翹總黃酮提取工藝具有提取率較高、穩(wěn)定可靠的特點，新工藝提取的連翹總黃酮具有一定的抗炎效果。

關(guān)鍵詞：連翹（Forsythia suspensa）；總黃酮；提取工藝；抗炎

中圖分類號：R284.2???????? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0156-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.028??????????? 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Research on optimization of extraction process and anti-inflammatory activity of total flavonoids from Forsythia suspensa

YAN Yong1，JIN Yan-yan1，ZHANG Yi-lin1，CHENG Min1，2，ZHOU Wei3

（1.School of Biomedicine and Food Engineering， Shangluo University， Shangluo? 726000， Shaanxi， China；2.Shaanxi Qinling Characteristic Biological Resources Industry Technology Research Institute， Shangluo 726000， Shaanxi， China；3.Shaanxi Xiangju Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Shangluo? 726000， Shaanxi， China）

Abstract： The effects of soaking time， solid-liquid ratio， ethanol concentration， extraction temperature and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Forsythia suspensa were evaluated by single factor experiment and response surface experiment design， and a mathematical model was built， which could be used for calculating the quadratic regression equation and predicting the optimal process of extracting total flavonoids from Forsythia suspensa. The inhibition effect of acute inflammatory swelling of mouse auricle with the total flavonoids of Forsythia suspensa extracted by the new process was evaluated， and the anti-inflammatory activity of the total flavonoids of Forsythia suspensa was tested. The results showed that the optimal process condition was solid-liquid ratio of 1∶20， soaking time of 30 min， extraction temperature of 58 ℃， ethanol concentration of 60%， and extraction time of 79 min. It had been verified that the average extraction rate of the new process was 14.54%. The total flavonoids extract of Forsythia suspensa extracted by the new process had a swelling value of （15.61±2.73） mg of the mouse auricle treated with xylene acute to inflammation， which was lower than the swelling value （17.21±2.65） mg after normal saline treatment. The anti-inflammatory in vitro showed that the extract of total flavonoids from Forsythia suspensa could inhibit inflammatory swelling of the mouse auricle. The extraction process of total flavonoids from Forsythia suspensa with the introduction of soaking process had the characteristics of high extraction rate， stability and reliability， and the Forsythia suspensa total flavonoids extracted by the new process had anti-inflammatory effects.

Key words： Forsythia suspensa； total flavonoids； extraction process； anti-inflammatory

連翹（Forsythia suspensa）是木樨科連翹屬植物，是國家三級藥用價值保護植物，果實可入藥，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性［1-3］，臨床上常用作清熱去火、退腫消結(jié)的藥物［4］，在護膚品［5］和食品產(chǎn)業(yè)［6，7］中也有應(yīng)用價值。連翹中富含黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等物質(zhì)［8］，其中，黃酮類化合物是連翹具備獨特生物活性的重要物質(zhì)。目前，從連翹葉中提取黃酮的方式有超聲波輔助提?。?，10］、微波加熱輔助提?。?1］、超臨界流體提?。?2］、纖維素酶提?。?3］等，由于這些方法對設(shè)備要求高，提取規(guī)模不易過大，導致應(yīng)用范圍相對有限。溶劑加熱提取法具有工藝簡便、設(shè)備要求不高和放大規(guī)模穩(wěn)定的優(yōu)勢，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛［14］。常用的溶劑有醇、醚、水等，文獻報道，乙醇與水的混合溶劑在提取植物中黃酮類化合物時具有較好的效果［15］。但在常規(guī)提取工藝中，較少考慮溶劑浸泡對總黃酮溶出的影響，實際上溶劑浸泡對總黃酮的提取有較大的影響［10］。因此，研究包含溶劑浸泡且高效、穩(wěn)定的連翹總黃酮提取工藝具有重要的意義。

本研究在連翹總黃酮的傳統(tǒng)提取工藝基礎(chǔ)上，增加溶劑浸泡環(huán)節(jié)，將溶劑浸泡時間與提取溫度、乙醇濃度、提取時間、料液比5個因素納入工藝優(yōu)化過程，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化，希望開發(fā)出連翹總黃酮提取的新工藝，有效提升連翹總黃酮提取效率，為研究連翹黃酮提取工藝提供了全新的著力點。并對新工藝提取的連翹總黃酮進行小鼠耳廓急性炎癥腫脹抑制的體外抗炎研究，測試連翹總黃酮提取物的抗炎活性，為促進連翹總黃酮開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)，豐富了連翹總黃酮提取物的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

連翹，采摘于商洛市洛南縣，經(jīng)商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院張亦琳副教授鑒定為連翹Hypericum perforatum Linn.的成熟果實；蘆丁，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇（AR），天津市大茂化學試劑廠；NaOH（AR）、Al（NO3）3（AR）、NaNO2（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；阿司匹林（國藥準字H63020201），青海制藥廠有限公司。

1.2 試驗儀器

HK-02A型粉碎機，廣州旭朗機械設(shè)備有限公司；HH-6型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；UV-755B型紫外可見分光光度計，上海分析儀器總廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 連翹總黃酮提取 連翹晾曬后，置于65 ℃的恒溫干燥箱中烘干，粉碎，過60目篩。稱取2.0 g連翹細粉于250 mL圓底燒瓶中，加入設(shè)定體積的設(shè)定濃度的乙醇溶液，在室溫下浸泡設(shè)定的時間后，將體系置于設(shè)定溫度條件下提取一定時間，冷卻后，將體系轉(zhuǎn)移至離心管，3 000 r/min離心10 min，所得上清液為連翹總黃酮提取原液。

1.3.2 蘆丁標準曲線繪制 蘆丁標準曲線繪制方法參考文獻［16］。

1.3.3 總黃酮提取率測定 提取液中總黃酮提取率的測定方法參考文獻［16］。

1.3.4 連翹總黃酮提取單因素試驗 基礎(chǔ)工藝條件：稱取2.0 g連翹細粉（過60目篩）于250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL 60%乙醇溶液室溫浸泡30 min，在60 ℃條件下提取90 min，冷卻后，將體系轉(zhuǎn)移至離心管，3 000 r/min離心10 min，所得上清液為連翹總黃酮提取液。

單因素工藝條件：將基礎(chǔ)工藝條件中的浸泡時間分別調(diào)整為0、15、30、45、60 min，考察浸泡時間對總黃酮提取率的影響。調(diào)整乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，考察乙醇濃度對連翹總黃酮提取率的影響。調(diào)整連翹提取的料液比為1∶15、???? 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，考察料液比對連翹總黃酮提取率的影響。調(diào)整提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，考察提取溫度對連翹總黃酮提取率的影響。調(diào)整提取時間分別為70、80、90、100、110 min，考察提取時間對連翹總黃酮提取率的影響。

1.3.5 連翹總黃酮提取的響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化 采用Design expert8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計方案，將提取溫度（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）3個因素納入響應(yīng)面試驗設(shè)計進行優(yōu)化，以總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，建立數(shù)學模型，預測連翹總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件。其響應(yīng)面試驗設(shè)計的因素和水平如表1所示。

1.3.6 驗證試驗 以響應(yīng)面試驗設(shè)計得出的連翹總黃酮提取工藝為驗證對象，平行試驗3次，計算平均值，檢查響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果的準確性、穩(wěn)定性。

1.3.7 連翹總黃酮提取率抗炎作用研究 試驗參考文獻［17］，選取體重19～22 g的健康白鼠15只，隨機分成3組，每組5只。每只動物右耳廓內(nèi)外兩面均勻涂抹二甲苯0.1 mL致炎0.5 h，左耳不加處理，各組每只動物右耳廓內(nèi)外兩面分別均勻涂抹0.1 mL各組受試物樣品（生理鹽水組、連翹提取物組、阿司匹林組）。給予受試物1 h后，小白鼠頸椎脫臼處死，剪下兩耳廓，用生理鹽水洗去右耳廓受試物樣品，擦凈，重疊兩耳廓，用內(nèi)徑8 mm的打孔器在同一部位鑿取兩圓耳片，分別稱重，計算腫脹值（右耳片與左耳片的重量差）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

測量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL蘆丁對照品的吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線（圖1），模擬回歸方程為y=1.525x-0.082，R2=0.998 3。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 浸泡時間對連翹總黃酮提取率的影響 由圖2可知，增加溶劑浸泡環(huán)節(jié)，總黃酮的提取率有明顯的提升，表明增加溶劑浸泡有利于連翹總黃酮溶出，當浸泡時間達30 min時，連翹總黃酮的提取率達到最大，繼續(xù)增加浸泡時間對總黃酮提取率增加的影響不大，因此，選擇浸泡時間為30 min作為響應(yīng)面的提取工藝條件，不進行響應(yīng)面分析。

2.2.2 乙醇濃度對連翹總黃酮提取率的影響 由圖3可知，乙醇濃度由40%提高至60%時，連翹總黃酮提取率也相應(yīng)提高，但漲幅不大，乙醇濃度提高至60%時，連翹總黃酮提取率最高，達13.60%。繼續(xù)提高乙醇的濃度，連翹總黃酮得率出現(xiàn)降低趨勢，同時提取液色澤變深。其原因可能為乙醇濃度升高使溶液極性相對降低，有利于極性較低的物質(zhì)溶出，不利于連翹總黃酮提取。根據(jù)連翹總黃酮提取率的高低選擇乙醇濃度為50%、60%、70%進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

2.2.3 料液比對連翹總黃酮提取率的影響 由圖4可知，料液比從1∶15到1∶20時，總黃酮的提取率有明顯的上升，繼續(xù)增大溶劑體積，總黃酮的提取率變化不大。因此，選擇1∶20作為響應(yīng)面的提取工藝條件，不進行響應(yīng)面試驗分析。

2.2.4 提取溫度對連翹總黃酮提取率的影響 由圖5可知，當提取溫度為40 ℃時，提取率為11.39%，隨著提取溫度升高，連翹總黃酮提取率也逐漸增加，可能的原因是溫度升高使分子運動更加劇烈，分子擴散加強有利于黃酮類分子的溶出。當提取溫度達60 ℃時，提取率達13.87%。繼續(xù)增加提取溫度，連翹總黃酮提取率反而降低，可能是由于溫度過高使連翹總黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時更多的其他物質(zhì)溶出速率增加，使總黃酮的提取率相對降低。根據(jù)連翹總黃酮的提取率高低選擇提取溫度為50、60、70 ℃進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

2.2.5 提取時間對連翹總黃酮提取率的影響 由圖6可知，當提取時間由70 min增大到80 min時，連翹總黃酮提取率提高至13.81%，繼續(xù)延長提取時間，連翹總黃酮的提取率逐漸降低，可能是長時間較高溫度的煎煮不利于總黃酮在體系中存在。根據(jù)連翹總黃酮的提取率高低選擇提取時間為70、80、90 min進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與試驗結(jié)果如表2所示。利用該試驗設(shè)計模擬出數(shù)學模型，可得出如下回歸方程：總黃酮的提取率（Y）= -189.022 5 + 1.900 3A + 2.242 0B + 2.062 1C-0.010 0AB+0.000 8AC-0.003 9BC-0.011 8A2-0.011 3 B2-0.011 8C2。

利用該模型對連翹總黃酮的提取工藝條件進行預測，得出連翹總黃酮的提取工藝為提取溫度57.87 ℃、乙醇濃度59.94%、提取時間79.03 min，該工藝預計連翹總黃酮的提取率可達14.74%。

2.3.2 響應(yīng)面試驗方差分析 由表3可知，響應(yīng)面模型顯著（P<0.000 1），且通過P值可知變量A、B、AB、BC、A2、B2、C2對連翹總黃酮提取的影響非常顯著，說明試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有很大的影響，交互作用對連翹總黃酮的提取影響也比較大。失擬項P=0.241 3>0.05，說明該模型擬合程度良好，CV=1.57%，說明試驗精度良好。變量A、B、C的F值分別為48.34、13.51、8.79，通過比較各因素的F值的大小，判斷出連翹中總黃酮提取率影響最大的因素為提取溫度（A），其次是乙醇濃度（B），影響最小的為提取時間（C）。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 圖7是各因素交互作用對連翹總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖。響應(yīng)面上曲面傾斜程度越大，說明對應(yīng)因素對連翹總黃酮提取的影響越大，在所選擇的因素中，提取溫度（A）對應(yīng)的坡度最大，乙醇濃度（B）次之。響應(yīng)面在底部的投影是該響應(yīng)面相應(yīng)的等高線，橢圓的線間疏密程度反映兩個變量之間的交互作用程度，橢圓形和線間的距離越密集，表示二者直接的交互作用越強，橢圓形和線間的距離越疏松，則表示二者直接的交互作用微弱。由圖7可知，提取溫度（A）、乙醇濃度（B）和提取時間（C）三者之間均有交互作用，與方差分析結(jié)論一致。

2.4 驗證試驗

為了便于操作，將模擬模型給出的最佳提取工藝調(diào)整為提取溫度58 ℃、乙醇濃度60%、提取時間79 min。平行3次驗證試驗的連翹總黃酮的提取率分別為14.65%、14.22%、14.75%，平均值為14.54%，與預測值基本一致。這說明該模型預測的工藝比較穩(wěn)定、可靠，可作為連翹總黃酮提取的工藝。

2.5 體外抗炎作用試驗結(jié)果

如表4所示，生理鹽水處理組小鼠耳廓腫脹平均值為（17.21±2.65）mg，阿司匹林處理組的小鼠耳廓腫脹平均值為（10.21±3.68）mg，連翹總黃酮提取液處理組的小鼠耳廓腫脹平均值為（15.61±2.73）mg。試驗表明，連翹總黃酮提取液處理組能使小白鼠急性炎癥腫脹耳廓重量減輕，說明連翹提取物可抑制小白鼠耳廓的炎癥腫脹，具有一定的抗炎效果，但與阿司匹林相比，效果上的差距比較明顯。

3 討論與結(jié)論

連翹是應(yīng)用廣泛的資源藥用植物，通常以煎煮提取有效成分用于臨床，中藥的提取環(huán)節(jié)是非常復雜的過程，好的工藝能有效提高中藥制劑的質(zhì)量水平，利于藥效的發(fā)揮。本研究在傳統(tǒng)的溶劑加熱提取工藝基礎(chǔ)上，增加溶劑浸泡環(huán)節(jié)，單因素試驗和響應(yīng)面試驗證明溶劑浸泡有利于連翹總黃酮的提取，并預測出連翹總黃酮提取的最佳工藝條件為料液比1∶20、浸泡時間30 min、提取溫度58 ℃、乙醇濃度60%、提取時間79 min。經(jīng)驗證，新工藝總黃酮的平均提取率為14.54%，具有提取率較高、穩(wěn)定可靠的特點。體外抗炎試驗表明，連翹提取物可抑制小白鼠耳廓的炎癥腫脹，具有一定的抗炎效果，采用連翹總黃酮提取液處理二甲苯急性致炎的小鼠耳廓的腫脹值為（15.61±2.73）mg，低于生理鹽水處理后的腫脹值（17.21±2.65）mg。連翹總黃酮提取的新工藝及體外抗炎試驗為連翹的開發(fā)和利用開辟了新的研究路徑，為促進連翹標準制定提供了理論和技術(shù)支持，對推動中藥現(xiàn)代化進程具有重要意義。

市售的連翹均為經(jīng)過晾曬和干燥后的干藥材，黃酮以結(jié)晶、無定型沉淀形式存在于藥物細胞內(nèi)［18］。而直接煎煮會使藥材表面所含的蛋白質(zhì)凝固［19］，不利于黃酮類化合物的滲出，導致提取率低。在提取前先進行溶劑浸泡，藥材會變得膨脹疏松，有利于藥物細胞內(nèi)有效成分的溶出［20，21］。本研究對連翹總黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化，由單因素試驗結(jié)果可以看出，增加溶劑的浸泡環(huán)節(jié)，促進了總黃酮的溶出，但對溶劑浸泡影響提取效率的因素研究還不夠深入，如浸泡過程中體系溫度、攪拌速度、溶劑用量等因素對提取的影響。在后續(xù)的研究工作中，可以將溶劑浸泡作為提取工藝優(yōu)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行篩選。

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