中小葉種茶酯型兒茶素含量測定及亞細胞定位

滿佳旭 高梓琪 武思敏 王冬雪 趙雪婷 張冬英

摘要：為了明確酯型兒茶素在中小葉種茶葉中的亞細胞空間定位，以十里香、桂綠1號、浙農(nóng)113、福鼎大白茶、浙農(nóng)139共5種中小葉種茶樣為試驗材料，采用高效液相色譜法對5種茶樣中的酯型兒茶素含量進行檢測，采用中性紅染色法對茶樣細胞中液泡進行定位，通過免疫組織化學(xué)法對茶樣中酯型兒茶素進行亞細胞定位。結(jié)果表明，5種中小葉種茶均含有不同含量的酯型兒茶素，其中含量最高的為十里香茶；在中性紅染色情況下，十里香茶樣中液泡呈圓形或橢圓形；免疫組織化學(xué)法染色情況下，5種中小葉種茶酯型兒茶素在亞細胞水平上均定位于液泡中。

關(guān)鍵詞：中小種茶葉； 酯型兒茶素； 免疫組織化學(xué)法； 亞細胞定位； 含量測定

中圖分類號：Q946.84+1???????? 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0098-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.017??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Content determination and subcellular localization of ester catechins of

small and medium-leaf teas

MAN Jia-xua，b， GAO Zi-qia，b， WU Si-mina，b， WANG Dong-xuea，b， ZHAO Xue-tinga，b， ZHANG Dong-yingb

（a.College of Food Science and Technology；b. Key Laboratory of Puer Tea Science，Ministry of Education，Yunnan Agricultural University，

Kunming? 650000， China）

Abstract： In order to clarify the subcellular spatial localisation of ester catechins in small and medium-leaf teas， five small- and medium-leaf tea samples of Shilixiang， Guilv No.1， Zhenong 113， Fuding Dabai Tea and Zhenong 139 were taken as the test materials， and the content of ester catechins in the five tea samples was detected using high-performance liquid chromatography （HPLC）， and the vesicles in the cells of the samples were localised using neutral red staining. Subcellular localisation of ester catechins in tea samples was performed by immunohistochemistry. The results showed that all five types of small and medium-leaf teas contained different levels of ester catechins， with the highest content in Shilixiang tea； under neutral red staining， the vesicles in Shilixiang tea samples were round or oval； under immunohistochemistry staining， the ester catechins of the five types of small and medium-leaf teas were located in the vesicles at the subcellular level.

Key words： small and medium-leaf teas； ester catechins； immunohistochemistry； subcellular localisation； determination of content

收稿日期：2022-11-01

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31760226）

作者簡介：滿佳旭（1998-），女，吉林白山人，在讀碩士研究生，研究方向為皮膚光老化，（電話）18488812842（電子信箱）729241399@qq.com；通信作者，張冬英（1976-），女，教授，博士，主要從事茶及特色植物資源開發(fā)利用研究，（電子信箱）857173887@qq.com。

滿佳旭，高梓琪，武思敏，等. 中小葉種茶酯型兒茶素含量測定及亞細胞定位［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：98-100．

云南省是世界公認的優(yōu)質(zhì)茶源，擁有得天獨厚的地理環(huán)境，適宜茶樹生長，茶葉的生產(chǎn)和加工也在云南省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中有著舉重若輕的地位。茶葉的種類繁多，根據(jù)樹形和成熟后葉片面積進行分類，可分為大葉種、中葉種和小葉種。由于中葉種和小葉種差異不大，也常統(tǒng)稱為中小葉種。目前關(guān)于中小葉種茶研究主要集中在茶多酚、咖啡堿、茶氨酸等茶葉內(nèi)含成分檢測方面［1-6］，而關(guān)于中小葉種酯型兒茶素的亞細胞定位研究較為鮮見［7］。酯型兒茶素主要積累于液泡、葉綠體及柵欄組織中，由于缺乏有效的特異性染色劑，常用的組織化學(xué)定位顯色方法及染色劑無法特異性識別酯型兒茶素，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。免疫組織化學(xué)法通過利用抗原和抗體能夠特異性結(jié)合的優(yōu)勢，能夠直接定位細胞或者組織內(nèi)小分子物質(zhì)的特定表達，就茶葉中酯型兒茶素定位而言，該方法相較于普通的組織化學(xué)染色法更為可靠［8-10］。

液泡廣泛存在于植物、動物、微生物等細胞中，是由單層膜和內(nèi)部細胞液組成的細胞器，其細胞液中存儲著多種物質(zhì)。幼小的植物細胞（分生組織細胞）具有許多小而分散的液泡，在電子顯微鏡下才能看到。在植物細胞中，液泡的體積一般占總體積的70%～80%，隨著細胞的生長，液泡也長大，互相合并，最后在細胞中央形成一個大的中央液泡，其可占據(jù)細胞體積的90%以上。隨著液泡研究的深入，發(fā)現(xiàn)液泡的形態(tài)除了在不同物種中有差異性，更重要的是與其生長周期相關(guān)，也是高度動態(tài)的細胞器，能夠快速對外界環(huán)境因素的變化進行響應(yīng)，參與并調(diào)節(jié)細胞代謝，控制細胞內(nèi)物質(zhì)積累和運輸，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，提高植物適應(yīng)環(huán)境變化和生存的能力。

本試驗通過高效液相色譜法對5種中小葉種茶進行酯型兒茶素含量檢測，利用中性紅染色對液泡進行定位，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對茶樣進行亞細胞定位，該結(jié)果可為中小葉種茶葉酯型兒茶素的生物合成途徑、存儲機制等資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀（安捷倫1260型），安捷倫科技有限公司；低速離心機（中佳 SC-3616型），安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗機（SK-18TC型），上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；冷凍切片機（Leica CM1950型）、熒光顯微鏡（Leica DM2000型），德國徠卡（Leica）儀器有限公司。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈（色譜純），美國TEDIA“天地”公司；三氟乙酸（色譜純），德國默克公司；中性紅，上海源葉生物科技有限公司；OCT包埋劑，美國櫻花；組織固定液，濟南百博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；多聚甲醛（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DAB試劑盒，天根生化科技有限公司；蘇木素，美國Sigma化學(xué)公司；抗酯型兒茶素抗體，自制。

1.1.3 試材 選取十里香、桂綠1號、浙農(nóng)113、福鼎大白茶、浙農(nóng)5種中小種茶一芽兩葉，來源于云南省普洱茶樹良種場，采集時間為2021年4月。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 取5種不同的新鮮中小葉種茶樣，洗凈，擦去水漬后用液氮充分研磨；分別稱取0.2 g（±0.0001 g）試樣于15 mL離心管中，加入70%甲醇溶液（70 ℃水浴中預(yù)熱）5 mL，放入70 ℃水浴鍋中充分浸提10 min（隔5 min渦旋1次），待冷卻至室溫后以3 500 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至?? 15 mL離心管中。用0.45 μm濾膜過濾，取2～10 mL過濾液于容量瓶中，用穩(wěn)定溶液定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，采用高效液相色譜法（HPLC）檢測，HPLC條件參考文獻［11］。

1.2.2 中性紅染色法 取新鮮的十里香茶樣品于福爾馬林中固定24 h，用刀片切成5 mm長的小段，放入OCT包埋劑中包埋，置于-80 ℃冰凍，利用冷凍切片機快速切片，展片。用去離子水清洗，隨后用0.1%濃度的中性紅溶液染色2 min，流水下沖洗?? 30 min，中性樹脂封片后顯微鏡觀察，拍照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法 前處理同中性紅染色，展片后用免疫組化筆劃定抗體鋪放區(qū)域，用4%的多聚甲醛在室溫下固定1 min，利用PBS溶液清洗3次，洗后用0.5%吐溫-20（Tween-20）在室溫下處理1 min，加過氧化物酶阻斷劑B，置于37 ℃恒溫箱20 min，再用PBS溶液清洗5 min，用血清封閉，于37 ℃恒溫箱孵育30 min，吸去血清孵育30 min，重復(fù)用PBS溶液清洗5 min，加ABC試劑于37 ℃孵育30 min，接著用PBS溶液清洗5 min，加過氧化物酶底物（DAB）室溫孵育15 min，用自來水沖洗5 min，用蘇木素染色，再用自來水沖洗15 min后，采用中性樹膠封片，置于60 ℃烘片30 min；使用顯微鏡油鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用HPLC測定茶樣酯型兒茶素含量

酯型兒茶素包括EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）和ECG（表兒茶素沒食子酸酯），不僅具有酚類化合物抗氧化的性質(zhì)，還具有優(yōu)于其他兒茶素的生物活性，如抗糖尿病、抗腫瘤等作用［11］。試驗以5種不同的中小葉種茶為試樣進行檢測，結(jié)果如表1所示。5種茶樣酯型兒茶素含量表現(xiàn)為十里香>桂綠1號>浙農(nóng)113>福鼎大白茶>浙農(nóng)139，其中，十里香的酯型兒茶素總含量最高，為0.509 g/100 g。

2.2 中性紅染色法定位茶樣液泡

中性紅是低毒性、弱堿性pH指示劑，在弱堿性條件下，活細胞能夠吸收中性紅進入植物細胞液泡中，中性紅在液泡中會呈現(xiàn)出深粉紅色，而原生質(zhì)體和細胞壁通常不著色。本試驗選用0.1%中性紅對茶樣進行染色（圖1），茶葉切片中分布有眾多紅色的圓形或橢圓形、大小不均一的物質(zhì)，為茶葉的液泡。

2.3 茶樣酯型兒茶素的亞細胞定位研究

選取十里香（圖2A）、浙農(nóng)113（圖2B）、桂綠1號（圖2C）、浙農(nóng)139（圖2D）、福鼎大白茶（圖2E）5種中小葉種的茶芽切片進行免疫組織化學(xué)染色。如圖2所示，在油鏡（10×100）下觀察，5種茶樣內(nèi)部剖面略有差別，但酯型兒茶素抗體結(jié)合部位均集中在大量的橢圓形亞細胞器中。與中性紅染色后的液泡對比發(fā)現(xiàn)，5種茶樣的酯型兒茶素亞細胞定位于液泡中。

3 討論

酯型兒茶素是茶樹中主要的次生代謝產(chǎn)物，占茶兒茶素總量的76%，具有抗氧化、抗癌、抗心血管疾病作用，其藥理作用遠強于非酯型兒茶素，是決定茶葉品質(zhì)、加工方式及其功效的重要組分，也是當(dāng)今藥物開發(fā)的主要目標(biāo)。迄今為止，酯型兒茶素的研究多數(shù)為大葉種茶，以中小葉種茶為研究對象的較少，但以大葉種茶聞名的云南省也有許多品質(zhì)極佳的中小葉種茶。免疫組織化學(xué)法被常應(yīng)用于生化研究中，利用抗原和抗體能夠特異性結(jié)合的優(yōu)勢，能夠直接定位細胞或者組織內(nèi)小分子物質(zhì)的特定表達，冷凍切片是常用的對樣品進行免疫組織化學(xué)分析、原位雜交和空間轉(zhuǎn)錄組分析的固定方法，相較于石蠟包埋法，其優(yōu)點在于可以有效保存細胞內(nèi)的有機物質(zhì)，不受外界試劑的刺激和溫度的影響，組織回縮不明顯，內(nèi)部細胞形態(tài)改變較小，在本試驗中更適合選用冷凍切片的方法對嬌嫩脆弱的茶樣進行包埋切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對茶樣中酯型兒茶素進行亞細胞定位，根據(jù)植物學(xué)組織形態(tài)進行判斷，抗體結(jié)合位置與液泡位置重合度較高，說明茶樹中酯型兒茶素在亞細胞水平上主要定位于液泡中。此研究結(jié)果可為中小葉種茶樣酯型兒茶素的生物合成途徑、生理學(xué)功能、選擇育種提供理論基礎(chǔ)，同時也可以為植物中代謝產(chǎn)物的亞細胞定位研究提供思路［12-19］。

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