DMSCs 三維培養(yǎng)方法及其在組織再生和疾病治療中應(yīng)用的研究進展

［摘要］ 牙源性間充質(zhì)干細胞（DMSCs） 是來源于神經(jīng)嵴外胚層的間充質(zhì)干細胞，具有優(yōu)越的自我更新和多向分化的能力，被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究。利用三維培養(yǎng)方法可對DMSCs進行大量體外擴增以滿足研究和治療的需要。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方法比較，三維培養(yǎng)技術(shù)可更有效地模擬干細胞在體內(nèi)所處的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，從時間和空間上共同調(diào)控干細胞的增殖及分化。近年來開展的體外三維培養(yǎng)方法較多，懸滴培養(yǎng)法操作簡單，但較難控制培養(yǎng)組織的氣象環(huán)境；微流控芯片可更好地控制細胞參數(shù)，但成本高昂，且存在技術(shù)平臺的難題而難以廣泛應(yīng)用；磁懸浮培養(yǎng)費用低廉，操作簡便，細胞成球速度快，但由于磁化作用難以用來定量分析。其他三維培養(yǎng)方法還包括旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、離心成球培養(yǎng)法、液體覆蓋法和人工支架法等，上述培養(yǎng)方法都存在不同的優(yōu)勢和一定的局限性?，F(xiàn)對體外三維培養(yǎng)DMSCs 的不同方法及其在不同組織再生和疾病治療中的應(yīng)用進行綜述，為DMSCs 功能的精準(zhǔn)調(diào)控和再生醫(yī)學(xué)研究提供參考。

［關(guān)鍵詞］ 牙源性間充質(zhì)干細胞； 球體培養(yǎng)； 干性維持； 組織工程； 再生醫(yī)學(xué)

［中圖分類號］ R780. 2 ［文獻標(biāo)志碼］ A

牙源性間充質(zhì)干細胞（dental mesenchymalstem cells， DMSCs） 包括牙髓干細胞（dentalpulp stem cells， DPSCs）、牙齦干細胞（gingivalfibroblastic stem cells， GFSCs）、牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）、乳牙干細胞（stem cells from human exfoliated teeth，SHED）、牙囊干細胞（dental follicular stem cells，DFSCs） 和牙乳頭干細胞（stem cells from apicalpapilla， SCAP） 等。DMSCs 具有多向分化潛能，且容易獲得，免疫原性低，這些特性使得DMSCs成為再生醫(yī)學(xué)重要的種子細胞，為多種組織相關(guān)疾病的治療提供可能。將組織內(nèi)提取的DMSCs 在體外進行大量擴增，獲取足夠的種子細胞，這對再生醫(yī)學(xué)的研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)技術(shù)，往往缺乏組織特異性結(jié)構(gòu)，難以模擬體內(nèi)生物學(xué)行為和細胞之間的相互作用。與二維培養(yǎng)方法比較，最新的三維球體培養(yǎng)方法可以更好地模擬干細胞在體內(nèi)所處的結(jié)構(gòu)與環(huán)境，且能夠增加細胞間和細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM） 間的相互作用，使干細胞可以更好地維持干性并發(fā)揮更大的分化潛能。

目前綜述類報道［1-2］ 中關(guān)于不同細胞三維培養(yǎng)的方法及其優(yōu)缺點，多針對其他組織來源的干細胞或腫瘤細胞，未見針對DMSCs 不同培養(yǎng)方法及應(yīng)用的報道。本文作者特異性針對DMSCs，系統(tǒng)分析并總結(jié)了近年來DMSCs 不同三維培養(yǎng)的方法及其優(yōu)缺點以及其在組織再生和疾病治療中的作用，為進一步深入研究并探索不同培養(yǎng)方法對DMSCs在組織再生和疾病治療中的應(yīng)用提供參考。

1 DMSCs 的三維培養(yǎng)方法

1. 1 懸滴培養(yǎng)法

三維培養(yǎng)方法中的懸滴培養(yǎng)法是由HARRION 等創(chuàng)立的一種培養(yǎng)組織和器官的方法［3］，利用載有細胞懸滴培養(yǎng)液的表面張力來形成無骨架的三維細胞球體［4-5］。

與其他三維培養(yǎng)方法比較，懸滴培養(yǎng)法操作簡單，有利于細胞間緊密聚合，使細胞間以及細胞與細胞基質(zhì)間的相互作用增強，提高了DMSCs 的分化潛能［6-7］。在音猬因子（sonic hedgehog， SHH）誘導(dǎo)下， DPSCs 可分化成神經(jīng)細胞用于神經(jīng)退行性疾病的治療［7］。研究［6，8］ 表明：利用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)的DPSCs 和PDLSCs 分化能力及礦化能力較應(yīng)用二維貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的細胞更強。MORITANI 等［9］ 基于懸滴培養(yǎng)法設(shè)計了微孔芯片用來培養(yǎng)人牙周韌帶間充質(zhì)干細胞（humanperiodontal ligament mesenchymal stromal cells，hPDLMSCs），發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的細胞與調(diào)節(jié)干性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和mRNA 表達水平均較單層hPDLMSCs 升高，且礦化結(jié)節(jié)明顯增多。

采用懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞也存在一些不足，如培養(yǎng)所需的氣象環(huán)境較難控制， 細胞懸滴易被污染，不易懸掛等。針對懸滴培養(yǎng)法應(yīng)用過程中氣象環(huán)境較難控制的缺點， 李秀群等［3］ 改良了Maximow 雙蓋片法，即在瓶底加入一定量的Hanks緩沖液，利用碳酸氫鈉和水的作用釋放二氧化碳，利用水分蒸發(fā)調(diào)節(jié)相對濕度，進而創(chuàng)造出適宜的氣象環(huán)境。針對細胞懸滴培養(yǎng)液不易懸掛的問題，液滴體積應(yīng)限制在50 μL 以下以保證重力和表面張力達到平衡而形成懸滴［10］。

除此之外，懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)的細胞聚合物容易由于營養(yǎng)物和氧氣的缺乏導(dǎo)致中心壞死，控制細胞接種數(shù)在合適的范圍內(nèi)可避免這種情況的發(fā)生［8］。懸滴培養(yǎng)法可與芯片技術(shù)結(jié)合，如微流體懸滴芯片和超疏水芯片，通過裝置泵不斷更新培養(yǎng)基，補充消耗掉的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，以實現(xiàn)長期培養(yǎng)［10-11］。

1. 2 微流控芯片

微流控芯片是一種由微米級的培養(yǎng)室、通道和微泵等功能元件構(gòu)成的由微流體控制的裝置。這種裝置可實現(xiàn)對細胞、組織和化學(xué)試劑等進行制備、反應(yīng)、分離及檢測等操作［12-13］，主要由水油兩相的兩根微米級通道組成，由于水油不相容，持續(xù)流動的含細胞的水相液體在油相液體中會形成水相多細胞球［14］。

微流控芯片具有以下特點：①可以通過改變動態(tài)參數(shù)來調(diào)控微米級通道中細胞的流動，模擬特定的環(huán)境以滿足多細胞球體的培養(yǎng)需求［15］； ②可以控制多細胞球體的體積，控制剪切應(yīng)力以減小細胞損傷，降低試劑損耗；③可以在相對空間和時間尺度對細胞的微環(huán)境進行干預(yù)調(diào)節(jié)，精確控制物質(zhì)濃度、溶液溫度和pH 值等，更精確地模擬干細胞在體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，在疾病發(fā)病機制研究和藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，微流控芯片被廣泛應(yīng)用于DMSCs 的研究中。微流控芯片可用于監(jiān)測DMSCs 的細胞遷移［13］， RUFAS 等［16］ 采用微流控芯片技術(shù)觀察細胞在補體C3a 梯度下的遷移情況，結(jié)果顯示：牙髓損傷后， 補體C3a 能夠募集DPSCs 和牙髓成纖維細胞（dental pulp fibroblasts，DPFs）。微流控芯片可通過添加物理和化學(xué)刺激因素來研究牙源性細胞的生理及病理活動，如采用該技術(shù)評估氟化二胺銀（silver diammine fluoride， SDF） 對DPSCs 的毒性潛力［17］， 探討根尖SCAP 對微流體中牙科材料的反應(yīng)［18］。研究者［19］ 利用微流控芯片技術(shù)將DPSCs固定在具有生物相容性材料的微膠囊中，為細胞提供三維細胞外基質(zhì)環(huán)境， 通過更好地控制細胞參數(shù)，使細胞保持增殖和神經(jīng)元分化的潛能。

微流控芯片技術(shù)也存在一些不足，如生產(chǎn)成本高昂、制備難度大、核心技術(shù)缺乏規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化以及相關(guān)人才嚴重不足，因此很難廣泛應(yīng)用。

1. 3 磁懸浮培養(yǎng)法

磁懸浮培養(yǎng)法是細胞在磁懸浮系統(tǒng)中與磁顆粒結(jié)合，受磁力作用而保持懸浮狀態(tài)的一種三維培養(yǎng)技術(shù)，通過對磁場的空間控制，可以控制細胞團的幾何形狀，使細胞間接觸、凝集而形成細胞球體［20-21］。磁懸浮培養(yǎng)法由SOUZA 等［21］于2010 年開創(chuàng)， 使細胞攝取由噬菌體顆粒、磁性氧化鐵和金納米顆粒組成的生物無機水凝膠，隨后進行磁懸浮。在此基礎(chǔ)上，有研究者［21］ 提出用金、氧化鐵和聚-l-賴氨酸納米顆粒構(gòu)成的磁性納米顆粒以靜電及非特異性結(jié)合的方式結(jié)合到細胞膜上以磁化細胞。

磁懸浮培養(yǎng)法具有費用低廉，操作簡便，生物兼容性好［20］，且磁懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的細胞活力強，球體核心的壞死少等優(yōu)勢［22］。與常規(guī)三維培養(yǎng)技術(shù)相比，磁懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的細胞球體成形更快，可以形成緊密連接并可自行分泌內(nèi)源性ECM ［23-24］，因此無需使用人工基質(zhì)或?qū)Ｓ媒橘|(zhì)，獲得的球體可以長期培養(yǎng)。CHAN 等［25］ 利用磁懸浮培養(yǎng)人DPSCs （human DPSCs， hDPSCs）， 結(jié)果表明：磁懸浮培養(yǎng)法可快速形成球體，且結(jié)構(gòu)牢固，不損傷細胞， 提高了hDPSCs 用于再生醫(yī)學(xué)的治療效率。磁懸浮培養(yǎng)法的另一個優(yōu)勢是可以通過操縱磁場的強度從而改變細胞培養(yǎng)物的形狀，在組成細胞球體之后，即使去除磁場，細胞球體的完整性仍然保持 ［26］。與其他無磁性培養(yǎng)物比較，磁性三維培養(yǎng)物結(jié)構(gòu)更加緊湊， 具有更多的脂滴和細胞外囊泡，培養(yǎng)的細胞分化能力更強 ［27］。同時，磁懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的球體多系譜分化能力、表面標(biāo)志物和胞外基質(zhì)表達及成骨和血管生成蛋白均高于二維細胞以及三維聚集體。磁懸浮培養(yǎng)法還可以明顯激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase， MAPK） 和核因子κB （nuclear factorkappa B， NF-κB） 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 改善三維培養(yǎng)的細胞凋亡效應(yīng) ［22］。

磁懸浮培養(yǎng)法也存在劣勢：①可能會由于磁體的不均勻磁化、單元大小和聚集程度等因素，使測量區(qū)域定義不明確，從而使定量分析受到影響［27］；②高磁引力條件會使人間充質(zhì)干細胞呈現(xiàn)典型凋亡特征［28］。

1. 4 旋 轉(zhuǎn) 細 胞 培 養(yǎng) 系 統(tǒng)（rotary cell culturesystem， RCCS）

RCCS 又稱轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器，是一種應(yīng)用微載體技術(shù)，通過模擬微重力環(huán)境使細胞、組織和培養(yǎng)液處于類似自由落體的狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生貼壁和懸浮的三維球體細胞，繼而進行細胞大規(guī)模擴增的三維體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)［29-30］。

RCCS 的微重力環(huán)境和低剪切應(yīng)力有利于細胞的增殖及誘導(dǎo)分化［31］。王田田等［32］ 研究顯示：與普通重力培養(yǎng)的細胞比較，模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)的hDPSCs 的體內(nèi)增殖能力更強。侯延華［33］ 研究表明：應(yīng)用微載體與RCCS 相結(jié)合的三維球體培養(yǎng)法在體外培養(yǎng)DPSCs， 較普通二維培養(yǎng)在生長曲線圖上有顯著的差異，可延長細胞的對數(shù)生長期，快速得到大量擴增的DPSCs。RCCS 模擬的微重力環(huán)境可以促進間充質(zhì)干細胞的神經(jīng)向分化，適合神經(jīng)細胞的培養(yǎng)［34-35］。李石［36］ 關(guān)于PDLSCs 的增殖分化能力影響的研究結(jié)果顯示：采用RCCS 培養(yǎng)出的細胞最顯著的優(yōu)點是具有非常高的比表面積，其培養(yǎng)效率極高，培養(yǎng)出的細胞生命力旺盛，在骨誘導(dǎo)條件下，RCCS 所產(chǎn)生的微重力環(huán)境可以促進細胞向成骨方向分化。LI 等［37］ 研究表明：使用RCCS模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)DPSCs 可以提高其增殖和牙源分化能力。

與細胞的靜態(tài)培養(yǎng)比較，RCCS 培養(yǎng)的細胞受到外界機械力小， 受到機械損傷少， 細胞自由度高，易形成三維球體［31］。在RCCS 生物反應(yīng)器中，細胞呈自由落體狀態(tài)，轉(zhuǎn)動和混合不受單個方向重力向量的影響，從而實現(xiàn)細胞向各個方向生長［30］。且由于處于微重力環(huán)境下，細胞內(nèi)部微管的聚合、解聚受影響， 細胞內(nèi)部壓力小， 分子發(fā)生相應(yīng)改變， 因此細胞能夠維持良好的形態(tài)［31］。同時， 細胞額外受到了血液流動產(chǎn)生的剪切力，具有應(yīng)力纖維，延緩細胞的增殖速度，細胞不易快速衰老，可以更好地參與后續(xù)實驗［38］。

RCCS 存在的不足之處：①RCCS 儀器的使用成本較高， 儀器使用和消毒方法較為繁瑣［30］；②根據(jù)RCCS 原理，旋轉(zhuǎn)半徑會受到限制，在一定程度影響其培養(yǎng)規(guī)模［36］。

1. 5 離心成球培養(yǎng)法

離心成球培養(yǎng)法是通過離心增加細胞間黏附，隨后將細胞沉淀重懸于細胞培養(yǎng)基中，再將細胞分配至具有細胞排斥表面的96 孔細胞培養(yǎng)板上獲得三維球體細胞團［39］。

離心成球培養(yǎng)法可以模擬細胞在體內(nèi)的發(fā)育過程， 增加細胞間以及細胞與ECM 的相互聯(lián)系［40］。在細胞聚集成球的過程中，該培養(yǎng)法使用的是非蛋白質(zhì)水溶性基質(zhì)， 因此可以快速地分離細胞球體［39］。與單層細胞培養(yǎng)比較， 通過離心成球培養(yǎng)法構(gòu)建的大鼠DPSCs 的體外三維培養(yǎng)模型的細胞增殖能力無明顯變化， 但細胞中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 活性明顯升高［41］。ALP 可能通過調(diào)節(jié)膠原合成， 促進牙本質(zhì)的高度礦化， 可應(yīng)用于齲病和牙髓病的治療。FERRé 等［42］ 研究表明：利用離心成球培養(yǎng)法培養(yǎng)的人牙齦干細胞（human gingival stem cells，HGSCs） 具有分化為成骨細胞、軟骨細胞和滑膜細胞譜系的能力，因此HGSCs 應(yīng)用于牙周病和骨質(zhì)疏松等疾病治療的研究。

離心成球培養(yǎng)法的優(yōu)點是操作簡單、可控性強、效益高、成本低，對于少量細胞的培養(yǎng)制備速度較快［43］。該方法的不足之處： 離心分離獲得的細胞團密度過高，缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運輸通道，物質(zhì)交換困難，導(dǎo)致中心壞死或凋亡［10， 44-45］。因此這種方法培養(yǎng)的細胞體積受限，培養(yǎng)周期和藥物處置時間需要控制［10］。

1. 6 液體覆蓋法

液體覆蓋法主要原理是利用非貼壁培養(yǎng)板來抑制細胞與培養(yǎng)板間的低黏性表面吸附，使得細胞與細胞之間開始相互吸引，自發(fā)地聚集形成細胞球體［46］。低黏性表面可由瓊脂、瓊脂糖凝膠或聚甲基丙烯酸甲酯制成，這些材料制成的培養(yǎng)層可有效抑制其對細胞的吸附［46-47］。

液體覆蓋法操作簡單，成本較低，不需要專用設(shè)備；細胞受到的剪切應(yīng)力低，培養(yǎng)過程中容易接觸細胞球， 還可以長期大規(guī)模地獲取球體細胞［47-48］。然而，這種方法也存在以下弊端：①液體覆蓋法屬于靜態(tài)培養(yǎng)法，即培養(yǎng)基內(nèi)物質(zhì)均處于靜止?fàn)顟B(tài)， 代謝產(chǎn)物會隨著培養(yǎng)進程的發(fā)展不斷堆積， 可能會影響細胞的正常生理活動［49］； ②在非貼壁培養(yǎng)板的低吸附表面上，細胞球體的生長狀態(tài)易受影響，可重復(fù)性低［48］。

1. 7 人工支架法

常規(guī)細胞體外培養(yǎng)多缺乏ECM成分，這可能不利于細胞的存活和增殖，特別對于干細胞的培養(yǎng)造成較大的影響。人工支架法可通過模擬天然的ECM 來改善細胞的增殖活性［50］。人工支架法通過將細胞接種在人工基質(zhì)構(gòu)成的支架對細胞進行三維培養(yǎng)，細胞附著于支架后逐漸遷移至支架內(nèi)部，并在支架的間隙中形成細胞球體［48］。

水凝膠是一種常見的用于模擬ECM 的生物材料，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，可為細胞黏附、生長和遷移提供支持 ［10，51］。通過調(diào)整水凝膠的物理特性，或根據(jù)研究目的引入不同功能的官能團，可創(chuàng)造出穩(wěn)定且適合特定細胞生長分化的微環(huán)境［52］。天然水凝膠（膠原蛋白） 具有支撐細胞的作用， 為細胞間物質(zhì)交換提供了良好的空間，且具有可降解和低毒性等優(yōu)點。研究［53］ 表明：膠原蛋白，尤其是Ⅰ型膠原蛋白能較好地促進牙髓干細胞的增殖和礦化。肽段水凝膠材料，即一種含有肽鍵的高分子水凝膠材料，也是現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用的支架材料［51］。

FUKUSHIMA 等［54］ 研究發(fā)現(xiàn)：用水凝膠支架培養(yǎng)的DPSCs 都能夠形成與牙髓相似的結(jié)締組織。納米纖維素-殼聚糖熱敏水凝膠培養(yǎng)的hDPSCs 可用于微創(chuàng)軟骨再生［55］?？愋赖龋?1］ 研究表明：凝膠樣支架常被用于牙髓組織再生。黃健萍等［56］ 研究結(jié)果顯示： 由鈣黏蛋白多肽修飾的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA） 水凝膠可作為牙髓間充質(zhì)干細胞分化的理想支架，有助于牙髓-牙本質(zhì)的再生。 李鑫平制備的改性后的 β - 磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP） /殼聚糖水凝膠可促進DPSCs 的早期黏附、增殖和成骨分化［57］。

但人工支架法的缺陷在于：①膠原和水凝膠支架法穩(wěn)定性較差，且支架的引入可能會改變細胞的微環(huán)境，干擾細胞與基質(zhì)間的相互作用，并產(chǎn)生有毒小分子［52］。若支架含有動物源成分， 可能干擾研究結(jié)果［48］；②支架材料的濃度控制是一大難點，支架材料濃度較高時， 材料流動性下降， 常會形成氣泡影響后續(xù)的細胞實驗； 支架材料濃度較低時， 材料的彈性受到影響， 進而抑制牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的發(fā)生［51］。③支架外形較為固定， 導(dǎo)致可重復(fù)性低；且細胞僅黏附于支架的表面，細胞培養(yǎng)效率較低，不能形成理想的細胞分布形式［58］。

2 DMSCs 三維培養(yǎng)的應(yīng)用

DMSCs 具有多向分化潛能， 在適當(dāng)條件下可以分化為牙組織細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞、成軟骨細胞和血管內(nèi)皮細胞等。三維培養(yǎng)方法可以誘導(dǎo)其定向分化為多種需要的組織細胞，可以增強干細胞因子分泌的功能，從而實現(xiàn)有效的干細胞治療的目的。

2. 1 牙體組織再生

根管治療目前雖廣泛應(yīng)用于齲病引起的牙髓受損或壞死的治療，但這種療法會導(dǎo)致牙齒活力喪失。而基于DMSCs 的牙髓組織工程利用適當(dāng)?shù)闹Ъ苋S細胞培養(yǎng)以修復(fù)牙髓，保持牙髓活力［59］， 恢復(fù)其正常生理功能。研究［60］ 顯示：將DPSCs 與人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)，在三維培養(yǎng)皿中獲得微球體，再將微球體置于牙根片段內(nèi)，將其植入免疫缺陷鼠背部皮下，4 周后可見血管和牙髓樣組織再生。研究［61］ 表明： 將SHED 和生物支架（Puramatrix ? 或 rhCollagentype Ⅰ） 置入全長根管后移植到裸鼠背部皮下后，SHED 可分化成具有分泌功能的成牙本質(zhì)細胞，并形成與正常牙髓的細胞、血管組分類似的功能性牙髓以及管狀牙本質(zhì)。李欣悅等［62］ 研究顯示：利用PDLSCs 進行三維球體培養(yǎng)，有骨組織和牙周膜類似組織的結(jié)合體形成。研究者［63］ 將支架法培養(yǎng)的DPSCs 進行體內(nèi)種植， 出現(xiàn)了再生牙根， 再生牙根在6 個月后初步具備了牙齒的特征，包括牙本質(zhì)小管狀和功能性牙周韌帶狀結(jié)構(gòu)等。

目前利用DMSCs 可分化為牙本質(zhì)細胞、根尖細胞、神經(jīng)細胞以及血管內(nèi)皮細胞等特定細胞的能力，雖已實現(xiàn)牙髓-牙本質(zhì)再生，但僅局限于異位再生，尚未實現(xiàn)在口腔中的牙髓-牙本質(zhì)再生。

2. 2 骨和軟骨再生

骨組織異常常是因嚴重機械損傷、 炎癥、 先天疾病和腫瘤等導(dǎo)致的［61］，DMSCs 具有向成骨細胞和成軟骨細胞分化的潛能，且不同來源的DMSCs 的各向分化能力有所差異［64］，因此DMSCs 在骨組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。TATSUHIRO 等［65］ 研究顯示： 由細胞、ECM 和鈣化基質(zhì)組成的hDPSC 構(gòu)建體可能成為骨再生無支架材料。JAHANBIN 等［66］ 對SHED進行成骨分化的定向誘導(dǎo)，并與支架膠原蛋白基質(zhì)一并接種于鼠的上頜牙槽骨缺損處，可介導(dǎo)新骨形成，治療效果與自體髂骨移植類似。KHAJEH 等［67］發(fā)現(xiàn)缺氧條件下DPSCs 的軟骨分化能力增強。KIM 等［68］ 研究表明： 體外三維培養(yǎng)的人DSFCs（human DFSCs， hDFSCs） 球體可用作骨組織再生的自體干細胞。目前利用DMSCs 的三維培養(yǎng)已成為提高人工移植物骨再生潛力的重要因素［64］。

2. 3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療

神經(jīng)系統(tǒng)疾病一般較為嚴重，主要由于神經(jīng)元細胞為非再生細胞。神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)能力有限，藥物和手術(shù)等治療方式很難從根本上解決受損神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能重建問題［61］。而DMSCs 不僅擁有強大的多向分化潛能，而且與神經(jīng)細胞均來源于神經(jīng)嵴外胚層，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。研究［69］ 發(fā)現(xiàn)：SHED 可向神經(jīng)細胞系定向分化， SHED 誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)球后， 經(jīng)進一步誘導(dǎo)可形成多巴胺能神經(jīng)元。將SHED 植入損傷的鼠坐骨神經(jīng)，可觀察到神經(jīng)纖維數(shù)量增加［61］ 。 ROOZAFZOON 等［69］ 成功將DPSCs 在三維球體培養(yǎng)系統(tǒng)中分化出視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞，提示其可用于青光眼等神經(jīng)退行性疾病的治療。

2. 4 免疫系統(tǒng)疾病的治療

在我國，牙周病的患病率高于齲病， 隨著對牙周病發(fā)病機制的深入研究，目前認為牙周病的罹患多由宿主的免疫應(yīng)答引起，而非感染的微生物直接引起［70］。王松靈［71］ 通過對生理以及炎癥狀態(tài)下的DMSCs 免疫學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下DMSCs 具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。羅傲翔等［70］ 研究顯示：通過三維培養(yǎng)的PDLSCs 能提高其抗炎特性， 降低宿主免疫應(yīng)答，緩解炎癥反應(yīng)， 提示三維培養(yǎng)的PDLSCs 對牙周炎的治療有一定的應(yīng)用前景。綜上，DMSCs 在牙周炎和自身免疫疾病的治療上具有很大的應(yīng)用潛力。

除了上述疾病的治療應(yīng)用， 利用三維培養(yǎng)的DMSCs 在角膜修復(fù)、肝炎治療、改善糖尿病患者臨床癥狀和肺損傷修復(fù)等領(lǐng)域也得到了不同程度的應(yīng)用［61］。

3 結(jié) 語

隨著組織工程和臨床治療技術(shù)的不斷發(fā)展，對DMSCs 的需求也在不斷增加。三維球體培養(yǎng)的DMSCs 自我更新能力強，多向分化潛能大，在臨床疾病治療、組織再生和器官移植等方面具有良好的應(yīng)用前景。同時，三維球體培養(yǎng)技術(shù)存在一定缺陷，主要是球體中心容易因代謝產(chǎn)物堆積、缺氧及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而發(fā)生壞死。如何解決并消除這一弊端可作為DMSCs 三維球體培養(yǎng)技術(shù)后續(xù)的研究方向之一。

綜上所述，結(jié)合研究需要，選擇合適的方法培養(yǎng)DMSCs，通過不斷改善三維培養(yǎng)方法，以獲得更好的研究效果，并為進一步應(yīng)用于臨床治療奠定基礎(chǔ)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DMSCs 在骨分化、軟骨分化和神經(jīng)分化等方面具有巨大分化潛能，后續(xù)研究可以繼續(xù)向其他分化方向進行探索。此外，DMSCs已應(yīng)用于骨損傷治療等方面，但口腔治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究依然較少，可以期待將具有多向分化能力的DMSCs 更多地應(yīng)用在口腔環(huán)境中的牙髓再生、牙本質(zhì)或牙釉質(zhì)修復(fù)等領(lǐng)域。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：安政雯負責(zé)論文的整體設(shè)計，李國鑫、趙小琳、李晨曦、劉影馳、朱芷墨和袁瑤負責(zé)文獻檢索及論文的撰寫。

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[基金項目] 國家自然科學(xué)基金項目（82270960）；科技部國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFC2504200）；吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目（JCSZ2021893-35）