苦參堿對(duì)特應(yīng)性皮炎炎癥、氧化應(yīng)激和傷口愈合的影響

摘要：目的 評(píng)估苦參堿對(duì)體外特應(yīng)性皮炎（AD）模型中HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥、氧化和遷移反應(yīng)及傷口愈合的影響。方法 采用MTT法評(píng)估苦參堿的細(xì)胞毒性，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將HaCaT細(xì)胞分為對(duì)照組，模型組，苦參堿0.05、0.1和0.2 mmol/L組，模型組采用10 μg/L腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/干擾素-γ（IFN-γ）刺激HaCaT細(xì)胞24 h，苦參堿0.05、0.1和0.2 mmol/L組分別用相應(yīng)濃度的苦參堿預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用10 μg/L TNF-α/IFN-γ刺激24 h。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測定白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8和IL-1β和胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC）、巨噬細(xì)胞衍生趨化因子（MDC）、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的因子（RANTES）的水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測抗氧化基因表達(dá)水平；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移；免疫組織化學(xué)分析核因子（NF）-κB p65的核易位；Western blot檢測p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和p65蛋白的磷酸化水平。結(jié)果 與模型組比較，苦參堿0.1和0.2 mmol/L組降低IL-6、IL-1β、IL-8和趨化因子的表達(dá)，增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）1、SOD2、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的表達(dá)，并促進(jìn)劃痕愈合率（P＜0.05）。此外，苦參堿0.1和0.2 mmol/L可抑制p38、ERK和p65蛋白的磷酸化及p65的核易位。結(jié)論 苦參堿具有抗炎和抗氧化特性，并刺激角質(zhì)形成細(xì)胞AD模型的傷口閉合。

關(guān)鍵詞：苦參堿；皮炎，特應(yīng)性；炎癥；NF-κB；氧化性應(yīng)激

中圖分類號(hào)：R758.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231689

Effects of matrine on inflammation， oxidative stress and wound healing in atopic dermatitis

WU Bo， ZHU Zhuonong， ZHENG Lijuan， CHEN Junru

Department of Dermatology， Guiyang Maternal and Child Health Hospital， Guiyang 550003， China

Abstract： Objective To evaluate the effects of matrine on the inflammatory， oxidative and migratory responses of HaCaT keratinocytes in an in vitro atopic dermatitis （AD） model. Methods HaCaT cells were divided into the control group （no treatment） and the model group （0.05， 0.1 and 0.2 mmol/L）. HaCaT cells in the model group were stimulated with 10 μg/L tumor necrosis factor-α （TNF-α）/interferon-γ （IFN-γ） for 24 h. Cells in the model group were pretreated with 0.05， 0.1 and 0.2 mmol/L matrine for 1 h and then stimulated with 10 μg/L TNF-α/IFN-γ for 24 h. MTT assay was used to assess the cytotoxicity of matrine. Enzyme-linked immunosorbent （ELISA） assay was performed to determine levels of cytokines （IL-6， IL-8 and IL-1β） and chemokines （TARC， MDC and RANTES）. mRNA expression levels of antioxidant genes were detected by real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. Cell migration was analyzed by scratch closure assay. Immunohistochemistry was commended to analyze the nuclear translocation of NF-κB p65. Western blot assay was used to detect the phosphorylation levels of p38， ERK and p65 proteins. Results Compared with the model group， matrine 0.1 and 0.2 mmol/L significantly decreased the expression levels of IL-6， IL-1β， IL-8 and chemokines， and matrine significantly enhanced the expression levels of superoxide dismutase-1 （SOD1）， SOD2， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GPx）， and promoted scratch wound healing （P＜0.05）. In addition， matrine 0.1 and 0.2 mmol/L inhibited the phosphorylation levels of p38， ERK and p65 proteins and the nuclear translocation of p65. Conclusion Matrine possesses anti-inflammatory and antioxidant properties， and stimulates wound closure in eratinocyte AD model， which may be related to the inhibition of the activation of MAPK and NF-κB pathways.

Key words： matrine; dermatitis， atopic; inflammation; NF-kappa B; oxidative stress

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是由各種發(fā)病誘因（包括塵螨、吸煙和過敏原）引起的慢性過敏性炎癥性皮膚病［1］。AD特征是皮膚過敏、瘙癢、濕疹、紅斑和復(fù)發(fā)性皮膚損傷［2］。研究顯示，皮膚上皮細(xì)胞的異常分化可導(dǎo)致皮膚屏障缺陷，這些缺陷使過敏原浸潤，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)和全身免疫反應(yīng)［3］。目前，外用類固醇、潤膚劑和口服抗組胺藥為AD的一線治療用藥，但長期應(yīng)用易引發(fā)紅斑、鱗屑等不良反應(yīng)［4］?？鄥A是在槐花中發(fā)現(xiàn)的一種生物堿，國內(nèi)廣泛用于病毒性肝炎、癌癥、心臟病和皮膚?。ㄈ鏏D和濕疹）的治療［5-6］。Huang等［7］通過建立AD小鼠模型和炎癥HaCaT細(xì)胞證實(shí)了苦參堿可以通過抑制Hsp90/核因子（NF）-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸來調(diào)節(jié)Th1/Th2炎癥反應(yīng)，從而緩解AD。然而，其治療AD的潛在機(jī)制尚不明確。本文旨在探究苦參堿在HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞AD模型中對(duì)炎癥、氧化損傷和傷口愈合的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。純度≥98%苦參堿購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素購自美國Gibco公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/干擾素-γ（IFN-γ）購自美國Peprotech公司；胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC）、巨噬細(xì)胞衍生趨化因子（MDC）、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的因子（RANTES）、白細(xì)胞介素（IL）-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自美國Ramp;D Systems公司；IL-6和IL-1β ELISA試劑盒購自美國BD biosciences公司；TRIzol試劑購自美國Thermo Scientific公司；One Step PrimeScriptTM III實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）預(yù)混試劑購自大連寶生物工程有限公司；比辛酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光液和放射免疫沉淀分析（RIPA）緩沖液購自上海碧云天生物科技有限公司；兔源一抗p38、p-p38、p65、p-p65、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、β-actin和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；DAPI溶液購自美國Sigma-Aldrich公司。Synergy HTX多模式讀取器（美國BioTek公司）；Axio Vert A.1倒置顯微鏡（德國蔡司公司）；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；FLUOVIEW FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) HaCaT細(xì)胞在10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HaCaT細(xì)胞以4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。新鮮培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞，0、0.05、0.1、0.2和0.4 mmol/L苦參堿處理細(xì)胞，并分別培養(yǎng)24、48和72 h。然后每孔添加5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜以溶解甲臜鹽，使用Synergy HTX多模式讀取器在490 nm處檢測光密度（OD）值。細(xì)胞存活率=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（處理時(shí)間和濃度無明顯細(xì)胞毒性作用），將HaCaT細(xì)胞分為對(duì)照組，模型組（用10 μg/L TNF-α/IFN-γ處理細(xì)胞24 h），苦參堿0.05、0.1、0.2 mmol/L組。

1.3 ELISA檢測細(xì)胞因子和趨化因子水平 HaCaT細(xì)胞（5×104個(gè)/孔）接種于96孔板中，苦參堿0.05、0.1和0.2 mmol/L組分別用相應(yīng)濃度的苦參堿預(yù)處理細(xì)胞1 h，TNF-α/IFN-γ（10 μg/L）處理細(xì)胞24 h，收集上清液。參照說明書，ELISA法檢測IL-6、IL-1β、IL-8、TARC、MDC和RANTES的水平。

1.4 RT-qPCR檢測基因表達(dá)水平 細(xì)胞接種于12孔板中（1×10? 個(gè)/孔），0.05、0.1和0.2 mmol/L苦參堿預(yù)處理1 h，37 ℃下用10 μg/L TNF-α/IFN-γ刺激24 h。清洗和收集細(xì)胞后，TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA。反應(yīng)體系（20 μL）：SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，Oligo（dT）引物1 μL，dNTP mix 2 μL，5×第一鏈緩沖液4 μL，cDNA模板（RNA）2 μL，無RNA酶水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。引物序列見表1。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃持續(xù)5 s，62.5 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)水平。[基因名稱 引物序列（5′→3′） 產(chǎn)物大小/bp SOD1 上游：ACGGTGGGCCAAAGGATGAA 151 下游：TCATGGACCACCAGTGTGCG SOD2 上游：AGAAGCACAGCCTCCCCGAC 152 下游：GGCCAACGCCTCCTGGTACT CAT 上游：CCAACAGCTTTGGTGCTCCG 180 下游：GGCCGGCAATGTTCTCACAC GPx 上游：TCGGTGTATGCCTTCTCGGC 150 下游：CCGCTGCAGCTCGTTCATCT GAPDH 上游：TTGGTATCGTGGAAGGACTCA 270 下游：TGTCATCATATTTGGCAGGTTT ][Tab.1 RT-qPCR primer sequences

表1 RT-qPCR引物序列]

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移 參照文獻(xiàn)［8］，HaCaT細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)24 h后，用無菌0.2 mL移液管尖端刮除細(xì)胞。PBS沖洗，用含0.05、0.1和0.2 mmol/L苦參堿的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h。倒置顯微鏡記錄24 h后細(xì)胞的遷移 。劃痕愈合率=［（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積］×100%。

1.6 免疫組織化學(xué)分析 將HaCaT細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種在12孔板，苦參堿（0.05、0.1和0.2 mmol/L）處理細(xì)胞1 h，TNF-α/IFN-γ（10 μg/L）刺激30 min，4%多聚甲醛固定刺激的HaCaT細(xì)胞，PBS洗滌2次。用0.2%Triton X-100在4 ℃的PBS中滲透HaCaT細(xì)胞10 min，PBS洗滌3次。在4 ℃下將細(xì)胞與一抗NF-κB p65（1∶200）孵育過夜。PBS沖洗HaCaT細(xì)胞3次，抗兔Alexa Fluor 488-結(jié)合二級(jí)抗體（1∶500）在4 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次。在室溫下用DAPI溶液染色10 min。在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.7 Western blot檢測p65、p-p65、p38、p-p38、ERK和p-ERK蛋白表達(dá) 用0.05、0.1和0.2 mmol/L苦參堿預(yù)處理HaCaT細(xì)胞1 h，37 ℃下用10 μg/L IFN-γ/TNF-α孵育24 h，使用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，使用BCA分析試劑盒定量分析上清液中收集的蛋白質(zhì)。取30 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將其電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉溶解在含有0.05%吐溫-20的Tris緩沖液（TBS/T）中，在室溫下封閉PVDF膜1 h。PVDF膜與一抗NF-κB p65、NF-κB p-p65、p38、p-p38、ERK和p-ERK（均為1∶1 000）于4 ℃下孵育過夜。TBS/T洗滌3次后，用HRP結(jié)合的山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育膜1 h。用ECL發(fā)光液對(duì)膜進(jìn)行可視化，在ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)上曝光成像，Image J進(jìn)行量化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism version 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用[[x] ±s

]表示，組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用Dunnett’s法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)水平的比較 MTT檢測結(jié)果顯示，在0.4 mmol/L苦參堿處理HaCaT細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率較對(duì)照組降低（P＜0.05），見圖1，選擇苦參堿0.05、0.1和0.2 mmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-8及趨化因子MDC、TARC和RANTES的水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，苦參堿0.05 mmol/L組各因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而苦參堿0.1和0.2 mmol/L組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子及趨化因子水平均降低（P＜0.05），見表2。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image2_1_1.jpeggt;[細(xì)胞存活率/%][0

][50

][100

][150

][24 h][48 h][72 h][對(duì)照組][0.05 mmol/L組][0.1 mmol/L組][0.2 mmol/L組][0.4 mmol/L組][＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；n＝3，F(xiàn)24 h=0.351，F(xiàn)48 h=3.673＊，F(xiàn)72 h=15.070＊＊，" a與對(duì)照組比較，P＜0.05。

Fig.1 MTT assay for HaCaT cell viability

圖1 MTT檢測HaCaT細(xì)胞活力][a

][a

][組別 趨化因子 MDC TARC RANTES 對(duì)照組 65±7 19±3 11±2 模型組 341±15a 443±20a 151±17a 0.05 mmol/L組 337±18 431±24 147±19 0.1 mmol/L組 208±11b 346±18b 79±13b 0.2 mmol/L組 110±13b 277±15b 38±7b F 271.500＊＊ 291.300＊＊ 68.470＊＊ ][組別 細(xì)胞因子 IL-6 IL-1β IL-8 對(duì)照組 0.82±0.14 31.5±3.3 9.7±1.8 模型組 6.73±0.57a 115.2±6.5a 78.8±6.1a 0.05 mmol/L組 6.48±0.55 107.8±6.7 76.4±5.7 0.1 mmol/L組 5.51±0.42b 72.3±4.8b 49.3±3.8b 0.2 mmol/L組 4.46±0.35b 36.6±3.6b 17.6±2.2b F 91.210＊＊ 169.000＊＊ 168.100＊＊ ][Tab.2 Comparison of cytokines and chemokines in HaCaT cells between five groups

表2 各組HaCaT細(xì)胞中細(xì)胞因子和趨化因子

表達(dá)水平比較][（n=3，ng/L，[x] ±s）

][＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表3、4同。]

2.2 各組抗氧化能力比較 與對(duì)照組相比，模型組SOD1、SOD2、CAT和GPx mRNA水平均降低（P＜0.05）；與模型組相比，0.1和0.2 mmol/L組SOD1、SOD2、CAT和GPx mRNA水平均升高（P＜0.05），見表3。[組別 SOD1 SOD2 CAT GPx 對(duì)照組 1.00±0.04 1.00±0.05 1.00±0.04 1.00±0.03 模型組 0.51±0.02a 0.42±0.07a 0.27±0.03a 0.30±0.04a 0.05 mmol/L組 0.53±0.03 0.44±0.09 0.30±0.05 0.34±0.02 0.1 mmol/L組 0.88±0.06b 5.85±0.96b 0.52±0.06b 0.56±0.06b 0.2 mmol/L組 1.25±0.09b 12.34±1.28b 0.84±0.08b 1.07±0.09b F 102.800＊＊ 156.500＊＊ 105.500＊＊ 135.000＊＊ ][Tab.3 Comparison of SOD1， SOD2， CAT and GPx mRNA levels in HaCaT cells between five" groups

表3 各組HaCaT細(xì)胞中SOD1、SOD2、CAT和

GPx mRNA的水平比較 ][（n=3，[x] ±s）

]

2.3 各組劃痕愈合率比較 對(duì)照組、模型組、0.05、0.1、0.2 mmol/L組的劃痕愈合率分別為（63±7）%、（31±4）%、（33±5）%、（48±8）%、（64±6）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=19.630，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，模型組劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與模型組比較，苦參堿0.1和0.2 mmol/L組劃痕愈合率升高（P＜0.05），見圖2。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image3.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image5.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image7.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image9.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image11.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image4.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image6.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image8.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image10.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image12.pnggt;[ 0 h][ 24 h][A—E分別為對(duì)照組、模型組、0.05 mmol/L組、0.1 mmol/L組及0.2 mmol/L組。

Fig.2 Cell migration detected by scratch closure assay （×100）

圖2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移（×100）][A][B][C][D][E]

2.4 各組NF-κB p65細(xì)胞表達(dá)定位 對(duì)照組中p65亞基主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在TNF-α/IFN-γ刺激后，p65亞基發(fā)生了明顯的核易位；與模型組相比，苦參堿0.1和0.2 mmol/L預(yù)處理可以減少NF-κB p65的核易位，見圖3。

2.5 各組p38、p-ERK和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組p38、ERK和NF-κB p65的磷酸化水平升高，苦參堿0.1和0.2 mmol/L治療抑制了HaCaT細(xì)胞中TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的p38、p-ERK和NF-κB p65的磷酸化水平（P＜0.05），見圖4、表4。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image28_1.tiffgt;[A][B][C][D][E][p-p38][β-actin][p38][p-ERK][ERK][p-p65][p65][A—E分別為對(duì)照組、模型組、0.05 mmol/L組、0.1 mmol/L組及0.2 mmol/L組。

Fig.4 Phosphorylation of p38， ERK and NF-κB p65 detected by Western blot assay

圖4 Western blot檢測p38、ERK和NF-κB p65的磷酸化][組別 p-p38/p38 p-ERK/ERK p-p65/p65 對(duì)照組 0.08±0.02 0.10±0.03 0.06±0.01 模型組 0.85±0.08a 0.78±0.05a 0.54±0.04a 0.05 mmol/L組 0.81±0.06 0.74±0.07 0.56±0.03 0.1 mmol/L組 0.42±0.04b 0.25±0.03b 0.38±0.05b 0.2 mmol/L組 0.20±0.03b 0.11±0.02b 0.10±0.03b F 141.700＊＊ 178.300＊＊ 140.800＊＊ ][Tab.4 Changes of phosphorylation levels of p38， p-ERK and p65 in HaCaT cells of each group

表4 各組HaCaT細(xì)胞中p38、ERK和p65的

磷酸化水平變化][（n=3，[x] ±s）

]

3 討論

AD是一種常見的慢性炎癥性皮膚病。研究發(fā)現(xiàn)，AD可導(dǎo)致皮膚屏障功能障礙和免疫調(diào)節(jié)障礙［9］。目前，治療AD的藥物（如皮質(zhì)醇）和免疫抑制劑對(duì)AD有良好的治療效果，然而，由于這些藥物的不良反應(yīng)，它們可能不適合長期使用［10］?？鄥A作為一種四環(huán)喹啉類生物堿，是苦參的主要成分［11］?？鄥A對(duì)炎癥性皮膚病有較好的藥理作用。研究顯示，苦參堿可以通過抑制樹突狀細(xì)胞分泌多種促炎細(xì)胞因子，緩解小鼠銀屑病樣皮炎［12］。此外，苦參堿可以通過升高Th1細(xì)胞因子的水平來調(diào)節(jié)濕疹中的Th1/Th2平衡，從而緩解濕疹［5］。細(xì)胞因子作為激素遞質(zhì)，負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)，如過敏和免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子可進(jìn)一步細(xì)分為Th1和Th2。Th1細(xì)胞及其分泌的IFN-γ、IL-2和其他促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫，而Th2細(xì)胞因子包括IL-6、IL-1β和IL-8，主要介導(dǎo)體液免疫［13］。本研究結(jié)果顯示，苦參堿0.1和0.2 mmol/L組HaCaT細(xì)胞中IL-6、IL-1β和IL-8的表達(dá)水平較模型組顯著降低，表明苦參堿可抑制細(xì)胞中促炎因子的產(chǎn)生。TARC和MDC是CC趨化因子受體（CC chemokine receptor，CCR）4型配體，在Th2細(xì)胞浸潤AD皮膚病中起重要作用［14］。RANTES也是一種CCR配體，可調(diào)節(jié)包括Th2和肥大細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞，在AD相關(guān)炎癥組織中的浸潤和激活方面發(fā)揮積極作用［14］。TARC、MDC和RANTES在AD患者和小鼠模型中高度表達(dá)［14-15］。本研究結(jié)果顯示，苦參堿0.1和0.2 mmol/L組TARC、MDC和RANTES等趨化因子水平較模型組明顯降低，提示其可能通過抑制細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用。

高水平的氧化應(yīng)激參與AD的病理生理過程，最終導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞損傷并改變其正常功能，細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡和活性氧的積累與角質(zhì)形成細(xì)胞死亡有關(guān)［16］。本研究中，模型組SOD1、SOD2、CAT和GPx mRNA的表達(dá)較對(duì)照組均降低，表明AD會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激；而苦參堿0.1和0.2 mmol/L預(yù)處理能夠恢復(fù)這些抗氧化酶的表達(dá)，表明苦參堿通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而抑制了AD的進(jìn)展。傷口愈合是一種自然的恢復(fù)性反應(yīng)，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)有助于加速傷口愈合。此外，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)升高，使細(xì)胞不僅表現(xiàn)出完整的上皮和間充質(zhì)狀態(tài)，還表現(xiàn)出部分EMT狀態(tài)，且部分EMT狀態(tài)已在許多發(fā)育、傷口愈合、纖維化和癌癥過程中得到證實(shí)［3］。本研究結(jié)果顯示，苦參堿0.1和0.2 mmol/L組劃痕愈合率較模型組顯著升高，表明苦參堿促進(jìn)了角質(zhì)形成細(xì)胞的傷口愈合。

NF-κB在IL-6、IL-8和IL-1β等促炎細(xì)胞因子以及MDC和TARC等趨化因子的產(chǎn)生中起著重要作用［17］。TNF-α能降解IκBα，磷酸化p65，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核［18］。本研究結(jié)果表明，TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中p65被磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，而苦參堿0.1和0.2 mmol/L預(yù)處理可抑制p65的磷酸化和核易位。MAPK通路包括ERK1/2、JNK和p38，對(duì)炎癥反應(yīng)的發(fā)展至關(guān)重要［4］。此外，MAPK是炎癥趨化因子和細(xì)胞過程（如細(xì)胞增殖、分化和凋亡）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器［19］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組p38和ERK的磷酸化水平升高；與模型組比較，苦參堿抑制了p38和ERK磷酸化的增加，表明苦參堿可能通過抑制NF-κB和MAPK的激活來調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞中的炎性因子和氧化應(yīng)激水平。

綜上所述，苦參堿可抑制TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中AD相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化水平，促進(jìn)傷口愈合，其機(jī)制可能與抑制上游NF-κB和MAPK信號(hào)通路激活有關(guān)。后續(xù)的研究將進(jìn)一步確認(rèn)苦參堿在動(dòng)物模型中的作用，以確認(rèn)AD的體內(nèi)效應(yīng)。

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（2023-11-07收稿 2024-01-25修回）

（本文編輯 陸榮展）