早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦缺血大鼠腦神經(jīng)髓鞘的影響及機(jī)制研究

基金項(xiàng)目：天津市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（專科）建設(shè)項(xiàng)目（TJYXZDXK-060B）；天津市衛(wèi)生健康科技項(xiàng)目重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)（TJWJ2022XK007）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究多元投入基金面上項(xiàng)目（21JCYBJC01610）

作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（郵編300052）

作者簡介：王俊懿（1999），女，碩士在讀，主要從事神經(jīng)康復(fù)方面研究。E-mail：orihara_0504@163.com

△通信作者 E-mail：cwan@tmu.edu.cn

摘要：目的 探討早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對腦缺血大鼠腦神經(jīng)髓鞘損傷的影響。方法 18只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（SHAM）組，大腦中動(dòng)脈閉塞靜息（MCAO-SED）組、大腦中動(dòng)脈閉塞運(yùn)動(dòng)（MCAO-EX）組，每組6只。除SHAM組外，其他各組采用改進(jìn)的Longa線栓塞法制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型。造模后MCAO-EX組大鼠置于跑步機(jī)上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)28 d。采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）評(píng)估神經(jīng)功能，MRI掃描（T2）檢測腦梗死體積，免疫熒光染色檢測髓磷脂堿性蛋白（MBP）表達(dá)，透射電子顯微鏡觀察髓鞘的結(jié)構(gòu)，Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 干預(yù)28 d后，同MCAO-SED組比，MCAO-EX組神經(jīng)功能恢復(fù)良好，梗死體積減少，髓鞘完整性增加，MBP熒光強(qiáng)度表達(dá)增加，MBP的表達(dá)水平增加，同時(shí)轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）、磷酸化肌醇需求酶1（p-IRE1）、磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（p-PERK）、活化的胱天蛋白酶-3（cleaved caspase 3）蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡減少。結(jié)論 早期運(yùn)動(dòng)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦神經(jīng)髓鞘修復(fù)，減少梗死面積，改善神經(jīng)功能。

關(guān)鍵詞：腦缺血；髓鞘；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡；早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)

中圖分類號(hào)：R743.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231795

Effect and mechanism of early exercise intervention on cerebral nerve myelin in rats with cerebral ischemia

WANG Junyi， LI Chen， WU Xinyue， DING Xinyu， WAN Chunxiao△

Department of Physical Medicine and Rehabilitation， Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China

△Corresponding Author E-mail： cwan@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the effect and potential mechanism of early exercise intervention on cerebral myelin in cerebral ischemia rats. Methods A total of 18 SD rats were randomly divided into the sham group， the middle cerebral artery occlusion resting group （MCAO-SED） and the middle cerebral artery occlusion exercise group （MCAO-EX）， with 6 rats in each group. Except the sham group， the middle cerebral artery occlusion model was prepared by modified Longa line embolization method in other groups. After modeling， rats in the MCAO-EX group were placed on a treadmill for exercise intervention for 28 days. Neurological function was assessed by modified neural function deficit score （mNSS）. Infarct volume was detected by MRI scanning （T2）， myelin basic protein （MBP） expression was detected by immunofluorescence. Myelin sheath structure was detected by transmission electron microscopy. Western blot assay was used to detect endoplasmic reticulum stress-related protein expression. Apoptosis was detected by TUNEL staining. Results After 28 days of intervention， compared with the MCAO-SED group， the nerve function recovered well in the MCAO-EX group， infarct volume decreased， myelin integrity increased， MBP fluorescence intensity expression increased and MBP expression level increased. The expression levels of ATF6， p-IRE1， p-PERK and cleaved caspase 3 were significantly decreased， and apoptosis was reduced. Conclusion Early exercise can inhibit endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis， promote cerebral myelin repair， reduce infarct size and improve nerve function.

Key words：brain ischemia; myelin sheath; endoplasmic reticulum stress; apoptosis; early exercise intervention

卒中是全球第二大死因，也是導(dǎo)致殘疾的主要原因［1］。卒中通常分為缺血性和出血性，87%的病例屬于缺血性卒中［2］。缺血性卒中是由大腦特定區(qū)域的血流中斷引發(fā)的，其特征是髓鞘損傷和少突膠 質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）死亡［3-4］。OLs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中獨(dú)特的髓鞘形成細(xì)胞，髓鞘可包裹軸突并維持軸突的長期完整性［5］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在腦缺血病理生理中起重要作用，抑制ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有神經(jīng)保護(hù)作用［6］。卒中后早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性［7-8］，還可減輕ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9］。反復(fù)的康復(fù)訓(xùn)練可提高患者的日常生活能力，是卒中后的有效措施［10］。本研究通過觀察早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、梗死體積、髓鞘的形態(tài)變化及ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦缺血后的ERS和髓鞘修復(fù)產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 18只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠（10～15周齡，體質(zhì)量280～320 g）購自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（津）：2016-0012。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h光照/昏暗周期，自由飲水。實(shí)驗(yàn)程序根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室護(hù)理和使用指南進(jìn)行，以盡量減少實(shí)驗(yàn)過程中使用的動(dòng)物數(shù)量和減輕動(dòng)物疼痛，并獲得天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（TMUaMEC2018037）。

主要試劑及儀器：BCA試劑盒、抗體稀釋液（Solarbio，中國），兔抗髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）一抗（Bioss，中國），兔抗轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、磷酸化IRE1（p-IRE1）一抗、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）一抗、活化的胱天蛋白酶-3（cleaved caspase 3）和大鼠抗三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗（Affinity，美國），抗兔二抗、抗大鼠二抗（CST，美國），Alexa Fluor 488二抗（Invitrogen，美國），DAPI（Abcam，英國），TUNEL熒光檢測試劑盒（塞維爾生物，中國），ECL超敏化學(xué)發(fā)光溶液（Millipore，德國），跑步機(jī)（ZS-PT，中國北京中氏迪創(chuàng)公司），磁共振成像設(shè)備（3.0T，MR750，美國通用電氣公司），低溫恒溫器（Leica CM1860，德國），透射電子顯微鏡（日立HT7700，日本），倒置熒光顯微鏡（Olympus IX73，日本）。

1.2 分組與造模 使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)（SHAM）組、大腦中動(dòng)脈閉塞靜息（MCAO-SED）組和大腦中動(dòng)脈閉塞運(yùn)動(dòng)（MCAO-EX）組，每組6只。采用改進(jìn)的Longa線栓塞法制備大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。將大鼠麻醉（戊巴比妥鈉，40 mg/kg，腹腔注射），仰臥位固定后，沿頸動(dòng)脈正中線將皮膚切開。鈍性分離所有組織層，分離左頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)外動(dòng)脈，將有細(xì)硅涂層的醫(yī)用尼龍單絲插入左頸內(nèi)動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈（頸動(dòng)脈分叉遠(yuǎn)端18.0～20.0 mm）血流60 min，然后取出線栓保持動(dòng)脈再灌注。大鼠蘇醒后，將Longa評(píng)分1～3分作為成功建模的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 干預(yù)方法 運(yùn)動(dòng)干預(yù)在MCAO后第1天開始。運(yùn)動(dòng)方案采用本團(tuán)隊(duì)先前的方案［7，11］：MCAO-EX組大鼠在跑步機(jī)（角度為0°，速度為12 m/min）上運(yùn)動(dòng)30 min，每天1次，每周5次，共4周；SHAM組和MCAO-SED組大鼠置于跑步機(jī)上靜止，干預(yù)時(shí)間相同。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 干預(yù)第1、3、7、14、21和28天，采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）評(píng)估動(dòng)物感覺、運(yùn)動(dòng)、平衡和反射等功能。評(píng)分范圍0～18分，得分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5 MRI 在運(yùn)動(dòng)干預(yù)前和干預(yù)第28天，將大鼠麻醉（3%異氟醚，鼻吸入麻醉），進(jìn)行MR T2WI成像（掃描層數(shù)18層，視野6 mm×6 mm，矩陣192 mm×192 mm，重復(fù)時(shí)間 1 000 ms，回波時(shí)間70 ms，層厚2 mm），根據(jù)圖像計(jì)算梗死體積比。梗死體積比=（對側(cè)總體積-同側(cè)非梗死體積）/對側(cè)總體積×100%。

1.6 免疫熒光染色 干預(yù)第28天，MRI掃描結(jié)束后將動(dòng)物處死，并用PBS進(jìn)行灌注。使用彎鉗剔除顱骨，取出腦組織。將腦組織在4%多聚甲醛中浸泡12 h后，置于15%和30%蔗糖溶液中完全脫水，用PBS沖洗，吸干水分。在-20 ℃低溫恒溫器上以10 μm厚度進(jìn)行腦組織切片，將切片置于-20 ℃冰箱保存。檢測時(shí)，將冰凍切片復(fù)溫30 min，PBS洗滌4次，用3%牛血清白蛋白溶液（Albumin from bovine serum，BSA）封閉1 h。然后滴加MBP一抗（1∶2 000），在4 ℃條件下過夜。滴加山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。最后滴加DAPI進(jìn)行染色和封片。使用倒置熒光顯微鏡拍攝梗死周圍區(qū)域圖像，并使用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.7 透射電子顯微鏡觀察髓鞘形態(tài) 用大鼠冠狀切片模具將腦組織切成1 mm厚的切片，在梗死周圍外囊部位取1 mm3大小標(biāo)本。將標(biāo)本在2.5%戊二醛低溫浸泡固定24 h，然后在PBS中浸泡3次，1%四氧化鋨固定2 h，PBS浸泡3次，脫水，包埋，將樣品切成50～70 nm的切片，放置在銅槽網(wǎng)格上，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡拍照，觀察髓鞘形態(tài)。

1.8 Western blot 從梗死周圍腦組織中提取總蛋白用于蛋白質(zhì)印跡。使用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白質(zhì)通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，并在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上印跡。將膜與5%脫脂奶粉在室溫下孵育1 h，并用稀釋的MBP、ATF6、IRE1、PERK、cleaved caspase 3（1∶2 000），p-IRE1、p-PERK（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體在4 ℃下過夜。然后，將膜與抗兔二抗或抗大鼠二抗在室溫孵育下1 h。使用ECL超敏化學(xué)發(fā)光溶液在凝膠電泳成像儀上顯影。

1.9 TUNEL染色 按1.6中步驟處理腦組織切片，檢測時(shí)，將冰凍切片復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次，按照試劑盒說明書配制TUNEL檢測液，滴加在樣品上孵育1 h，PBS洗滌4次，滴加DAPI進(jìn)行染色和封片。使用倒置熒光顯微鏡拍攝梗死周圍區(qū)域圖像，并使用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。TUNEL陽性細(xì)胞比例=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI染色細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Shapiro-Wilks檢驗(yàn)以驗(yàn)證數(shù)據(jù)的正態(tài)性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[[x] ±s

]表示。2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，干預(yù)不同時(shí)間mNSS評(píng)分采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響 在干預(yù)過程中，動(dòng)物均無死亡，SHAM組大鼠活動(dòng)正常；MCAO-SED組大鼠食欲較差，活動(dòng)減少；MCAO-EX組大鼠活動(dòng)逐漸正常。神經(jīng)功能評(píng)分顯示，時(shí)間和干預(yù)方式對mNSS評(píng)分均有影響，時(shí)間和干預(yù)方法之間無交互作用，MCAO-EX組的mNSS評(píng)分低于MCAO-SED組（P＜0.05），見表1。[組別 第1天 第3天 第7天 SHAM組 1.66±0.81 0.17±0.41 0.00±0.00 MCAO-SED組 12.33±1.86a 9.50±2.26a 8.33±1.21a MCAO-EX組 12.17±1.60 8.50±1.38 6.33±1.03b ][組別 第14天 第21天 第28天 SHAM組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 MCAO-SED組 6.17±1.33a 5.17±0.98a 4.67±0.82a MCAO-EX組 4.33±1.03b 3.67±0.82b 3.33±0.52b ][Tab.1 Comparison of mNSS scores between three

groups of rats

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分比較][（n=6，分，[x] ±s）

][F時(shí)間=121.674＊＊，F(xiàn)干預(yù)=7.661＊，F(xiàn)交互=1.816，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；b與MCAO-SED組比較，P＜0.05。]

2.2 早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦梗死大鼠腦梗死體積的影響 干預(yù)前，SHAM組大腦未見異常信號(hào)，MCAO-SED組和MCAO-EX組左側(cè)大腦出現(xiàn)彌漫性高信號(hào)影，見圖1。MCAO-EX組的梗死體積比與MCAO-SED組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明MCAO造模穩(wěn)定。干預(yù)第28天，MCAO-EX組較MCAO-SED組左側(cè)大腦的高信號(hào)影體積減小，梗死體積比下降（P＜0.05），見圖2、表2。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image2_1_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image3_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image4_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image5_2.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image6_2.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image4_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image7_2.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image8_1.pnggt;[SHAM組][MCAO-SED組][MCAO-EX組][Fig.1 T2WI imaging of rats before intervention

圖1 干預(yù)前大鼠的腦T2WI成像]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image9_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image10_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image11_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image12_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image10_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image13.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image14.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image10_1.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image15.pnggt;[SHAM組][MCAO-SED組][MCAO-EX組][Fig.2 T2WI imaging of rats 28 days after intervention

圖2 干預(yù)第28天大鼠的腦T2WI成像

][組別 n 干預(yù)前 干預(yù)第28天 SHAM組 3 0.00±0.00 0.00±0.00 MCAO-SED組 3 41.23±0.87a 30.36±1.40a MCAO-EX組 3 41.42±1.13 22.04±0.21b F 0.053 102.521＊＊ ][Tab.2 Comparison of changes of cerebral infarction volume ratio between three groups

表2 各組大鼠腦梗死體積比變化比較][＊＊P＜0.01；a與SHAM組比較，b與MCAO-SED組比較，P＜0.05。][（%，[x] ±s）

]

2.3 早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦梗死大鼠髓鞘形態(tài)和完整性的影響 SHAM組髓鞘形態(tài)均勻，外觀光滑完整，包繞致密。MCAO-SED組脫髓鞘區(qū)域的髓鞘呈不連續(xù)的斷裂狀，損傷的髓磷脂層分裂膨出，包繞松散。MCAO-EX組脫髓鞘區(qū)域髓鞘完整性增加，包繞更加致密，見圖3。SHAM組、MCAO-SED組和MCAO-EX組缺血半暗帶紋狀體中MBP熒光強(qiáng)度分別為41.26±2.29、17.99±2.64、26.18±1.46，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=87.417，P＜0.01）。MCAO-SED組較SHAM組降低，經(jīng)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，MCAO-EX組的MBP熒光強(qiáng)度較MCAO-SED組增強(qiáng)，見圖4。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image16.pnggt;[SHAM組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image17.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image18.pnggt;[MCAO-SED組][MCAO-EX組][Fig.3 Ultrastructure of myelin integrity of the external capsule indicated by transmission electron microscope at 28 days of

intervention in each group （×6 000）

圖3 透射電鏡下各組干預(yù)第28天外囊髓鞘完整性超微結(jié)構(gòu)（×6 000）]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image19.pnggt;[SHAM組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image20.pnggt;[MCAO-SED組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image21.pnggt;[MCAO-EX組][綠色熒光為MBP，藍(lán)色熒光為DAPI。

Fig.4 MBP immunofluorescence staining of brain

tissue in each group （×200）

圖4 各組大鼠腦組織MBP免疫熒光染色（×200）]

2.4 早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦梗死大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和MBP蛋白表達(dá)的影響 MCAO-SED組與SHAM組比較，缺血半暗帶的總IRE1和PERK蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ATF6、p-IRE1、p-PERK、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平升高，MBP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。MCAO-EX組與MCAO-SED組比較，總IRE1和PERK蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ATF6、p-IRE1、p-PERK、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平降低，MBP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖5、表3。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image22.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image23.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image24.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image25.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image26.pnggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image27_1.tiffgt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image28.tiffgt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image29.pnggt;[58 ku

][110 ku

][110 ku

][140 ku

][140 ku

][21 ku

][14 ku

][15 ku

][ATF6][IRE1][p-IRE1][PERK][p-PERK][MBP][cleaved caspase 3][GAPDH][37 ku

][A" " " " " " "B" " " " " " "C][A：SHAM組；B：MCAO-SED組；C：MCAO-EX組。

Fig.5 Expression levels of ATF6， IRE1， PERK， p-IRE1， p-PERK， cleaved caspase 3 and MBP in each group

圖5 各組大鼠ATF6、IRE1、PERK、p-IRE1、p-PERK、cleaved caspase 3、MBP蛋白表達(dá)水平]

2.4 早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)對腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 SHAM組、MCAO-SED組和MCAO-EX組缺血半暗帶中TUNEL陽性細(xì)胞比例（%）分別為1.51±0.31、17.91±0.30、10.40±0.65，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=998.286，P＜0.01）。MCAO-SED組較SHAM組增加，經(jīng)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，MCAO-EX組的TUNEL陽性細(xì)胞比例較MCAO-SED組降低，見圖6。

3 討論

運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以促進(jìn)卒中后的功能恢復(fù)、行走和平衡［12］，是卒中后至關(guān)重要的神經(jīng)康復(fù)方法。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MCAO-SED組相比，MCAO-EX組的mNSS評(píng)分顯著下降，提示早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)在康復(fù)過程中可以促進(jìn)卒中后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。MRI結(jié)果也顯示，干預(yù)前MCAO-SED組與MCAO-EX組間腦梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而干預(yù)后MCAO-EX組較MCAO-SED組梗死體積減小。由此證明早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以促進(jìn)卒中后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

髓鞘再生對于腦損傷后的功能恢復(fù)至關(guān)重要［13］。髓鞘修復(fù)是脫髓鞘后的髓鞘再生反應(yīng)，可恢復(fù)電傳導(dǎo)和功能，并維持軸突健康［14］。為了探究運(yùn)動(dòng)是否也對髓鞘修復(fù)產(chǎn)生積極作用，筆者采用透射電子顯微鏡觀察腦卒中髓鞘的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)腦卒中后髓鞘的完整性降低，出現(xiàn)損傷。蛋白和熒光表達(dá)結(jié)果顯示，腦卒中后MBP的表達(dá)降低。TUNEL檢測和cleaved caspase 3的蛋白結(jié)果顯示，腦卒中后細(xì)胞凋亡增加。運(yùn)動(dòng)干預(yù)后顯著改善了這些表現(xiàn)，表明髓鞘修復(fù)效果較好，細(xì)胞凋亡減少。

Cheng等［15］研究證明，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以促進(jìn)腦卒中后幼鼠神經(jīng)發(fā)生和髓鞘修復(fù)。Li等［9］研究則發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以減輕ERS，減少細(xì)胞凋亡。作為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)生物合成的中心位點(diǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是產(chǎn)生髓鞘蛋白的細(xì)胞器［16］。髓鞘蛋白對于維持髓鞘結(jié)構(gòu)是必需的。髓鞘作為電絕緣體，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突周圍的少突膠質(zhì)質(zhì)膜的螺旋包裹，隨后壓實(shí)形成多層膜結(jié)構(gòu)［17］。因此髓鞘細(xì)胞對分泌途徑的破壞高度敏感，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)［18］。缺血性腦卒中后會(huì)發(fā)生ERS［19］，輕度ERS有助于提高細(xì)胞耐受性，恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；然而，過度或長期的ERS會(huì)導(dǎo)致凋亡通路激活［20］，這也是引起卒中后髓鞘損傷的原因。ERS引起細(xì)胞凋亡是通過上調(diào)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）通路的促凋亡分支而誘導(dǎo)的［21］。UPR的激活是由3種不同的通路（ATF6、IRE1和PERK）觸發(fā)的。本研究結(jié)果顯示，ATF6、p-IRE1、p-PERK、cleaved caspase 3的表達(dá)水平在進(jìn)行MCAO后顯著升高，提示腦缺血后，缺血半暗帶組織ERS增強(qiáng)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)28 d后，MCAO-EX組與MCAO-SED組相比，ATF6、p-IRE1、p-PERK、cleaved caspase 3表達(dá)水平顯著降低，TUNEL陽性細(xì)胞比例降低，證實(shí)了早期運(yùn)動(dòng)康復(fù)可以抑制ERS引起的凋亡，而促進(jìn)髓鞘修復(fù)的機(jī)制可能與抑制ERS有關(guān)。

綜上，大鼠腦缺血后會(huì)損傷半暗帶中的髓鞘，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)可抑制ERS，減輕細(xì)胞凋亡，促進(jìn)大鼠缺血性腦卒中后的髓鞘修復(fù)，促進(jìn)康復(fù)。本研究也為臨床腦卒中患者提供了運(yùn)動(dòng)干預(yù)治療方案的理論支持，并為腦卒中后髓鞘修復(fù)的機(jī)制提供了新的思路。

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（2023-11-20收稿 2023-12-12修回）

（本文編輯 胡小寧）