鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）誘發(fā)小鼠膽汁淤積和肝損傷的作用機(jī)制

張佳怡 余蕓 趙凡 葉露 王建青

摘要： 目的 探討鄰苯二甲酸二 （2-乙基己基） 酯 （DEHP） 誘發(fā)小鼠膽汁淤積和肝損傷機(jī)制研究。方法 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 將成年雌性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組 （玉米油）、 DEHP組 （200 mg·kg?1·d?1）， 共灌胃4周， 建立膽汁淤積模型。收集所有小鼠血液與肝組織， 生化儀檢測(cè)血清、 肝臟總膽汁酸 （TBA） 水平， 酶標(biāo)儀檢測(cè)ALP、 GGT； HE染色觀察肝組織病理變化； 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝臟炎癥因子IL-1β、 IL-6和TNF-α的表達(dá)水平； 液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀 （LC-MS/MS） 檢測(cè)小鼠肝臟膽汁酸譜。體外實(shí)驗(yàn)： 培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞AML-12， 使用DEHP（250 ?mol/L）以及去氧膽酸（DCA）（125 ?mol/L）和鵝去氧膽酸（CDCA）（125 ?mol/L） 處理細(xì)胞24 h， 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞炎性因子IL-1β、 IL-6和TNF-α的mRNA水平。計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)， 多組間比較采用單因素方差分析， 進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示： 與對(duì)照組相比，DEHP組小鼠肝體比， 血清TBA、 ALP、 GGT及肝臟TBA均顯著升高 （t值分別為?4. 396、 ?5. 109、 ?8. 504、 ?3. 792和?7. 974， P值均<0. 05）。與對(duì)照組相比， 肝臟膽汁酸譜中膽酸 （CA）、 CDCA、 ?；蛆Z去氧膽酸 （TCDCA）、 DCA及熊去氧膽酸 （UDCA） 均顯著升高 （t值分別為?2. 802、 ?3. 177、 ?2. 633、 ?2. 874和?2. 311， P值均<0. 05）。DEHP組小鼠肝臟HE染色顯示為匯管區(qū)擴(kuò)大、 膽管變形、 膽管周圍伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)， 且肝臟炎癥因子IL-1β、 IL-6和TNF-α mRNA水平均顯著升高（t值分別為?2. 539、 ?2. 823和?4. 636， P值均<0. 05）。體外實(shí)驗(yàn)顯示： 0～1 000 ?mol/L DEHP處理后肝細(xì)胞活力實(shí)際數(shù)值相差不超過15%， 分別使用125、 250以及500 ?mol/L的DEHP刺激后， 肝細(xì)胞的炎癥因子IL-1β、 IL-6和TNF-α mRNA水平均明顯升高 （P值均<0. 05）。與單獨(dú)使用DEHP刺激相比， CDCA聯(lián)合DEHP刺激上調(diào)了細(xì)胞炎癥因子IL-1β mRNA水平 （P<0. 01）； DCA與DEHP聯(lián)合刺激可顯著增加細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA水平 （P值均<0. 01）。結(jié)論 DEHP暴露導(dǎo)致小鼠膽汁淤積肝病的發(fā)生并誘發(fā)肝臟炎癥， 這可能與其促進(jìn)有毒膽汁酸的產(chǎn)生進(jìn)而加劇炎性因子分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 鄰苯二甲酸二 （2-乙基己基） 酯； 環(huán)境污染物； 膽汁淤積； 膽汁酸類

基金項(xiàng)目： 國家自然科學(xué)基金 （82073566）； 安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目 （gxyq2019014）； 臨床藥學(xué)與藥理學(xué)共建項(xiàng)目 （2020）； 安徽省公共衛(wèi)生臨床中心安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院北區(qū)科研培育基金資助項(xiàng)目 （2023YKJ14， 2023YKJ06， 2023YKJ11）

Mechanism of bis （2-ethylhexyl） ?phthalate in inducing cholestasis and liver injury in mice

ZHANG Jiayi1， YU Yun2， 3， ZHAO Fan1， YE Lu1， WANG Jianqing1， 2， 3.

（1. Department of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China；

2. Department of Pharmacy， The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230012， China； 3. Anhui Public Health Clinical Center， Hefei 230012， China）

Corresponding author： ?WANG Jianqing， ?jianqingwang81@126.com ?（ORCID： ?0000-0002-7935-9520）

Abstract： Objective To investigate the mechanism of bis（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） in inducing cholestasis and liver injury in mice. Methods In the in vivo experiment， adult female ICR mice were randomly divided into control group （corn oil） and DEHP group （200 mg/kg/d）， and a model of cholestasis was established by intragastric administration for 4 weeks. After blood and liver tissue samples were collected from all mice， a biochemical analyzer was used to measure the level of total bile acid （TBA） in serum and the liver， and a microplate reader was used to measure alkaline phosphatase （ALP） and gamma-glutamyl transpeptidase （GGT）； HE staining was used to observe the pathological changes of the liver； RT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of the inflammatory factors interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the liver； liquid chromatography/triple quadrupole mass spectrometry was used to measure the bile acid profile in the liver of mice. In the in vitro experiment， AML-12 mouse hepatocytes were cultured and treated with DEHP （250 ?mol/L）， DCA （125 ?mol/L）， and CDCA （125 ?mol/L） for 24 hours， and RT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of the inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， and TNF- α. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups； a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and the LSD-t test was used for further comparison between two groups. Results The in vivo experiment showed that compared with the control group， the DEHP group had significant increases in the serum levels of TBA， ALP， and GGT and the level of TBA in the liver （the t values are respectively ?4.396， ?5.109， ?8.504， ?3.792 and ?7.974， all P<0.05，） . Compared with the control group， the DEHP group had significant increases in cholic acid， chenodeoxycholic acid， taurocholic acid， deoxycholic acid， and ursodeoxycholic acid （the t values are respectively ?2.802， ?3.177， ?2.633， ?2.874 and ?2.311， all P<0.05） . HE staining of the liver showed that the mice in the DEHP group had enlargement of the portal area， bile duct deformation， inflammatory cell infiltration around the bile duct， and significant increases in the mRNA expression levels of the inflammatory factors IL-1β， IL-6， and TNF-α in the liver （the t values are respectively ? 2.539， ? 2.823 and ? 4.636， all P<0.05） . The in vitro experiment showed that the actual difference in hepatocyte viability after 0-1 000 ?mol/L DEHP treatment does not exceed 15%， but there were significant increases in the mRNA expression levels of the inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， and TNF-α after treatment with DEHP at different concentrations of 125 ?mol/L， 250 ?mol/L， and 500 ?mol/L （all P<0.05） . Compared with DEHP stimulation alone， the combined stimulation of CDCA and DEHP upregulates the cytokine in hepatocyte IL-1β mRNA levels （P<0.01）； the combined stimulation of DCA and DEHP can significantly increase the cytokine in hepatocyte IL-1β and IL-6 mRNA levels （all P<0.01） . Conclusion DEHP exposure can cause cholestasis and induce liver inflammation in mice， possibly by promoting the production of toxic bile acids and the secretion of inflammatory factors.

Key words： Di- （2-Ethylhexyl） Phthalate； Environmental Pollutants； Cholestasis； Bile Acid

Research funding：

National Natural Science Foundation of China （82073566）； The Program of Excellent Young Talents in Universities of Anhui Province （gxyq2019014）； Clinical Pharmacy and Pharmacology （2020）； Anhui Public Health Clinical Center Supported by North District Scientific Research and Cultivation Foundation of the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University （2023YKJ14， 2023YKJ06， 2023YKJ11）

膽汁淤積性肝病是各種原因引起膽酸鹽循環(huán)發(fā)生障礙， 蓄積于肝細(xì)胞而引起肝細(xì)胞毒性［1］ ， 并可導(dǎo)致肝內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)， 損傷膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞， 最終可發(fā)展為肝衰竭和惡性轉(zhuǎn)化［2］ 。膽汁淤積的發(fā)生涉及雌激素、遺傳及環(huán)境等多種因素。

環(huán)境污染物鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexyl phthalate， DEHP）是鄰苯二甲酸酯增塑劑之一， 生活中被廣泛應(yīng)用于各種塑料制品中［3］。已有研究［4］ 報(bào)道DEHP在輸液管中浸出造成的毒性增加膽汁淤積的風(fēng)險(xiǎn)。此外， 動(dòng)物研究［5］ 也發(fā)現(xiàn)DEHP可導(dǎo)致小鼠肝臟DNA損傷可能促進(jìn)膽汁淤積的發(fā)生， 本課題組前期研究［6］ 已證實(shí)DEHP暴露可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生膽汁淤積， 但DEHP對(duì)膽汁淤積性肝病炎癥反應(yīng)的作用尚未完全闡明。因此， 本研究探索DEHP暴露導(dǎo)致膽汁淤積性肝病和炎癥損傷的機(jī)制， 為臨床發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡 （26～30 g） 雌性ICR小鼠購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司， 生產(chǎn)許可證編號(hào)： SCXK （京） 2019-0010， 使用許可證編號(hào)： SYXK （皖）2020-001。小鼠飼養(yǎng)在適宜的環(huán)境中： 溫度 （25±1） ℃， 濕度55%±5%， 適應(yīng)性飼養(yǎng)7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1. 2 試劑 總膽汁酸 （TBA） 試劑盒購買于浙江伊利康生物技術(shù)有限公司， ALP和GGT購買于南京建成生物工程研究所； DEHP、 膽酸 （cholic acid， CA）、 甘氨膽酸 （glycocholicacid， GCA）、 ?；悄懰?（taurocholic acid， TCA）、 牛磺鵝去氧膽酸（taurochenodesoxycholic acid， TCDCA）、 鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid， CDCA）、 去氧膽酸（deoxycholicacid， DCA）、 熊去氧膽酸 （ursodeoxycholic acid， UDCA）、甘 氨 鵝 去 氧 膽 酸（glycine chenodeoxycholic acid，GCDCA）、 牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）、 甘氨石膽酸 （glycine cholic acid， GLCA） 和甘氨豬去氧膽酸（glycine hyodeoxycholic acid， GHDCA）購買于美國默克公司； 玉米油購自上海阿拉丁生化有限公司； CCK-8溶液、 DMSO購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 血清購買于浙江天杭生物科技股份有限公司； 胰酶細(xì)胞消化液購買于Biosharp生物科技公司； DMEM培養(yǎng)基購買于Hyclone； 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增試劑盒購買于翌圣生物科技 （上海） 股份有限公司； 實(shí)時(shí)定量PCR引物購買于北京擎科生物科技股份有限公司。

1. 3 動(dòng)物分組與處理 將雌性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、 DEHP組 （200 mg·kg?1·d?1）， 每組8只， 共灌胃4周。取材前禁食6 h， 收集血液和肝組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1. 4 生化檢測(cè) 使用生化分析儀檢測(cè)血清中TBA以及肝臟TBA的含量。

1. 5 肝組織病理學(xué)觀察 將小鼠新鮮肝組織放入4%多聚甲醛溶液中浸泡處理， 室溫放置搖床固定24 h。進(jìn)行脫水包埋并切片固定后， 用蘇木精-伊紅 （HE） 染色， 在顯微鏡下觀察并拍照。

1. 6 液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜 使用液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer， LC-MS/MS）（AB SCIEX 公司， 型號(hào)：TRIPLE QUAD? 4500 SYSTEM） 檢測(cè)小鼠中膽汁酸組分水平。色譜柱： 100 mm×3. 0 mm（Phenomenex公司， 型號(hào)： 00D-4462-Y0、 2. 6 ?m C18 100A）； 流動(dòng)相： A相為含有0. 1%冰乙酸的4 mmol/L乙酸銨溶液， B相為甲醇； 柱溫為40 ℃； 流速為0. 4 mL/min； 進(jìn)樣量為10 ?L。

1. 7 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12細(xì)胞來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。AML-12細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、 5 ?g/mL胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉、 地塞米松40 ng/mL， 青霉素100 U/mL， 鏈霉素100 ?g/mL的DMEM-F12完全培養(yǎng)基中， 并放置于恒溫培養(yǎng)箱中 （37 ℃， 5% CO2） 培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)， 使用胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行傳代。

1. 8 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞接種于96孔板， 每孔1×104個(gè)細(xì)胞。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組并給藥。培養(yǎng)24 h后， 棄掉上清， 向每孔中添加CCK-8工作溶液110 ?L （CCK-8試劑∶細(xì)胞培養(yǎng)基=1∶10）， 繼續(xù)孵育0. 5～4 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度 （OD） 值， 計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 （%） = （處理組細(xì)胞OD值－陰性對(duì)照組OD值） / （對(duì)照組細(xì)胞OD值－陰性對(duì)照組OD值） ×100%。

1. 9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因 采用TRlzol法提取RNA， 將所有提取的RNA樣品的濃度定量在1 000 ng/?L，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 之后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)， 選取18S （18S ribosomal RNA） 作為內(nèi)參基因， 計(jì)算相應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)水平。相關(guān)引物信息見表1。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x ˉ±s表示， 兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析， 進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)， P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 DEHP暴露導(dǎo)致小鼠膽汁淤積的發(fā)生 與對(duì)照組相比， DEHP組小鼠肝體比顯著增加 （t=?4. 396， P<0. 01）； 血清與肝臟TBA水平顯著升高 （t值分別為?5. 109、 ?7. 974，P<0. 01）； 血清ALP和GGT水平顯著升高（t值分別為?8. 504、 ?3. 792， P值均<0. 05）（圖1）。

2. 2 DEHP暴露對(duì)小鼠肝臟膽汁酸組分的影響 LC-MS/MS結(jié)果顯示與對(duì)照組相比， CA、 CDCA、 TCDCA、 DCA及UDCA均顯著升高 （t值分別為?2. 802、 ?3. 177、 ?2. 633、?2. 874和?2. 311， P值均<0. 05）。其余肝臟膽汁酸組分無明顯變化 （圖2）。

2. 3 DEHP暴露對(duì)肝臟炎癥因子的影響 肝組織HE染色結(jié)果顯示， 對(duì)照組小鼠肝組織完整， DEHP組小鼠肝組織可見匯管區(qū)擴(kuò)大、 膽管變形， 膽管周圍并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)一步對(duì)肝臟炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， DEHP組小鼠炎性因子IL-1β、 IL-6和TNF-α mRNA水平較對(duì)照組顯著升高 （t值分別為?2. 539、 ?2. 823和?4. 636， P值均<0. 05）（圖3）。

2. 4 DEHP暴露對(duì)肝細(xì)胞的影響 結(jié)合肝臟HE染色的結(jié)果， DEHP暴露導(dǎo)致肝臟發(fā)生損傷， 本研究進(jìn)一步在體外探究DEHP暴露對(duì)肝細(xì)胞的影響， 不同濃度的DEHP處理24 h對(duì)肝細(xì)胞存活率與0 ?mol/L相比有顯著性差異 （F=29. 575， P<0. 01）（圖4a）； 進(jìn)一步檢測(cè)肝細(xì)胞炎性因子的表達(dá)情況， 發(fā)現(xiàn)DEHP處理后IL-1β、 IL-6和TNF-α mRNA水平均顯著升高 （P值均<0. 05）（圖4b）， 這與體內(nèi)結(jié)果相一致； 同時(shí)選擇250 ?mol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 5 DEHP聯(lián)合膽汁酸共培養(yǎng)對(duì)肝細(xì)胞的影響 結(jié)合LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果DEHP暴露導(dǎo)致不同組分膽汁酸發(fā)生改變， 進(jìn)一步探究某一種組分改變對(duì)于肝細(xì)胞的影響， 選用CDCA和DCA與DEHP進(jìn)行聯(lián)合刺激肝細(xì)胞， 觀察炎性因子表達(dá)的情況。肝細(xì)胞的存活率隨著CDCA和DCA濃度的增加而降低， 當(dāng)濃度為125 ?mol/L時(shí)， 細(xì)胞存活率均達(dá)到80%以下 （圖5a、 b）， 因此選擇125 ?mol/L的CDCA和DCA分別與DEHP共同培養(yǎng)肝細(xì)胞， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與DEHP組相比， CDCA聯(lián)合DEHP刺激上調(diào)了細(xì)胞炎癥因子IL-1β mRNA水平 （P<0. 01）， 對(duì)IL-6和TNF-α的表達(dá)有促進(jìn)作用， 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （圖5c）； DCA聯(lián)合DEHP刺激可顯著增加細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA水平 （P值均<0. 01）， 同樣可上調(diào)TNF-α的表達(dá)， 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （圖5d）。

3 討論

DEHP作為鄰苯二甲酸酯的一種， 可通過飲食、 吸入、醫(yī)療設(shè)備與生物液體等多種途徑直接接觸攝入體內(nèi)［7-8］ ，引起生殖毒性、 神經(jīng)損傷、 炎癥、 過敏和內(nèi)分泌紊亂等危害［9］ 。因此， 研究DEHP暴露對(duì)于人體所造成的危害具有重要的意義。膽汁淤積性肝病是因膽汁生成、 分泌及排泄障礙導(dǎo)致肝內(nèi)外膽汁淤積的臨床常見疾病， 血清膽汁酸濃度升高是診斷的必要條件， 其中TBA>10 ?mol/L可作為膽汁淤積的診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］ 。因此， 針對(duì)DEHP誘導(dǎo)膽汁淤積動(dòng)物模型對(duì)于深入研究環(huán)境因素與膽汁淤積性肝病之間的關(guān)系和機(jī)制研究具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)， DEHP給小鼠灌胃28天后， DEHP組小鼠肝體比明顯增加且血清TBA、 ALP和GGT水平顯著升高， 表明DEHP暴露可導(dǎo)致膽汁淤積性肝病的發(fā)生。

Gourlay等［11］ 發(fā)現(xiàn)DEHP在人和大鼠的血液中具有促炎作用， 在本研究中也發(fā)現(xiàn)DEHP暴露組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病理變化并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且肝臟中的炎癥因子表達(dá)顯著性升高； 體外DEHP處理肝細(xì)胞后也上調(diào)了肝細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。膽汁酸具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)和脂溶性維生素吸收和代謝的重要功能， 還具有調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂、 能量代謝、 內(nèi)分泌以及解毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)DEHP暴露小鼠肝臟中CA、 CDCA、 TCDCA、 DCA以及UDCA等代謝發(fā)生紊亂。有研究［12］ 表明， 不同的膽汁酸成分損害肝臟的能力存在差異， 本研究中升高的天然膽汁酸成分對(duì)小鼠肝臟毒性強(qiáng)弱程度依次為DCA>CDCA>CA>UDCA。

體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了膽汁酸是否影響DEHP的促炎作用， 選用DCA和CDCA分別與DEHP聯(lián)合作用于肝細(xì)胞， 結(jié)果顯示， 相較于單獨(dú)DEHP暴露， DCA和CDCA分別與DEHP共同刺激可導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥因子IL-1β、 IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高， 這提示毒性膽汁酸可促進(jìn)DEHP的促炎作用。

DEHP作為一種被廣泛使用的塑化劑， 對(duì)人體健康的危害不容忽視。在既往研究［9］ 中， 通過臨床出生隊(duì)列分析發(fā)現(xiàn)DEHP暴露增加了膽汁淤積發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)但并未進(jìn)一步在小鼠模型中進(jìn)行驗(yàn)證。本課題組前期研究［6］首次構(gòu)建DEHP暴露導(dǎo)致小鼠膽汁淤積性肝病的模型，而本研究中進(jìn)一步探究DEHP誘發(fā)小鼠膽汁淤積和肝損傷機(jī)制研究。綜上所述， DEHP暴露可導(dǎo)致小鼠膽汁淤積肝病的發(fā)生并誘發(fā)肝臟炎癥， 這可能與DEHP暴露引起毒性膽汁酸生成進(jìn)而加劇炎性因子分泌有關(guān)。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步探究臨床藥物對(duì)于DEHP導(dǎo)致膽汁淤積性肝病的治療效果， 為臨床治療膽汁淤積性肝病提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

倫理學(xué)聲明： 本研究于2020年5月23日經(jīng)由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批， 批號(hào)： 202000523， 符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明： 王建青、 余蕓、 張佳怡負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)， 資料分析； 張佳怡、 余蕓、 趙凡、 葉露參與收集數(shù)據(jù)， 修改論文；王建青負(fù)責(zé)擬定寫作思路， 指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-08-09； 錄用日期：2023-09-11

本文編輯：王瑩