• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶RNA樣ER激酶(PERK)通路對肝星狀細胞激活及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響

    2024-06-06 10:09:28黎鳳炎劉澤峰夏雨艷王文娟李琪唐利瑕張國
    臨床肝膽病雜志 2024年5期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激膠原

    黎鳳炎 劉澤峰 夏雨艷 王文娟 李琪 唐利瑕 張國

    摘要: 目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶RNA樣ER激酶 (PERK) /真核生物翻譯起始因子2α (eIF2α) 信號通路對肝星狀細胞(HSC) 活化的影響。方法 收集11例肝穿刺病理提示S1~S4肝纖維化患者和9例肝血管瘤、 肝腺瘤患者術(shù)后周圍正常肝組織病理切片, 進一步行組織免疫組化檢測PERK、 eIF2α、 C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白 (CHOP) 表達情況; 使用不同濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素 (0、 125、 250、 500、 1 000 nmol/L) 作用于人HSC-LX2, 使用qRT-PCR檢測PERK mRNA及Western Blot檢測PERK、 肌醇需要酶1(IRE1)、 激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、 CHOP及α平滑肌肌動蛋白(α-SMA) 表達水平。使用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建PERK穩(wěn)定過表達LX-2組及對照組, 并通過qRT-PCR檢測PERK、 eIF2α、 α-SMA mRNA, Western Blot檢測PERK、 p-eIF2α、 α-SMA蛋白表達, 免疫熒光檢測膠Ⅰ型原蛋白 (COL1A1) 表達。符合正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用成組t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析, 進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗; 不符合正態(tài)分布的計數(shù)資料, 兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。結(jié)果 與正常肝組織相比, 肝纖維化患者肝組織中PERK、 eIF2α及CHOP表達升高, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (Z=?3. 56、 t=?5. 75、 Z=?3. 52, P值均<0. 001)。不同濃度毒胡蘿卜素作用后, 與溶媒組相比, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白PERK、 CHOP、 IRE1、 ATF6及α-SMA蛋白表達顯著升高 (P值均<0. 05)。與對照空載慢病毒組相比, PERK穩(wěn)定過表達組PERK mRNA、 eIF2α mRNA、 α-SMA mRNA表達及PERK、 p-eIF2α、 α-SMA蛋白表達明顯升高 (P值均<0. 05)。細胞免疫熒光結(jié)果提示, PERK過表達組COL1A1表達升高 (P<0. 05)。結(jié)論 PERK過表達可誘導(dǎo)LX-2細胞α-SMA、 膠原蛋白COL1A1表達, 提示PERK信號通路可能是HSC活化的重要機制之一。

    關(guān)鍵詞: ?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激; ?真核細胞起始因子2; ?肝星狀細胞; ?膠原Ⅰ型

    基金項目: ?廣西自然科學(xué)基金 (2023GXNSFBA026056); ?廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院青年基金 (QN2020-1)

    Effect of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase pathway in endoplasmic reticulum stress on?hepatic stellate cell activation and collagen type I expression

    LI Fengyan , LIU Zefeng , XIA Yuyan , WANG Wenjuan , LI Qi , TANG Lixia , ZHANG Guo .

    (1. Graduate School, Youjiang Medical University for Nationalities, Bose, Guangxi 533000, China; 2. Department of Gastroenterology, The People s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 3. Department of Gastroenterology, Guangxi Hospital Division of The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Nanning 530022, China)

    Corresponding author: ?ZHANG Guo, ?zhangguogx@hotmail.com ?(ORCID: ?0000-0001-7755-443X)

    Abstract: Objective To investigate the effect of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) /eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) pathway in endoplasmic reticulum stress on the activation of hepatic stellate cells (HSC) . Methods Pathological sections of normal liver tissue after surgery were collected from 11 patients with hepatic fibrosis (S1-S4) and 9 patients with hepatic hemangioma and hepatic adenoma confirmed by liver biopsy, and immunohistochemistry was used to measure the protein expression levels of PERK, eIF2α, and C/EBP homologous protein (CHOP) . Human HSC-LX2 cells were treated with different concentrations of the endoplasmic reticulum stress inducer thapsigargin (0, 125, 250, 500, and 1 000 nmol/L), and qRT-PCR was used to measure the mRNA expression level of PERK, while Western blot was used to measure the protein expression levels of PERK, inositol requiring protein 1 (IRE1), activating transcription factor 6 (ATF6), CHOP, and α-smooth muscle actin (α-SMA) . The method of lentivirus transfection was used to construct a PERK stable overexpression LX-2 group and a control group; qRT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of PERK, eIF2α, and α -SMA, Western blot was used to measure the protein expression levels of PERK, phosphorylated eIF2α (p-eIF2α), and α-SMA, and immunofluorescence assay was used to measure the expression of collagen type I alpha 1 (COL1A1) . The independent samples t-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups; a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. The Mann-Whitney U test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups. Results Compared with normal liver tissue, the liver tissue of patients with hepatic fibrosis had significantly higher expression levels of PERK, eIF2α, and CHOP (Z=?3.56,t=?5.75, Z=?3.52, all P<0.001) . Compared with the solvent group, the groups treated with different concentrations of thapsigargin had significant increases in the expression levels of the endoplasmic reticulum-associated proteins PERK, CHOP, IRE1, ATF6, and α-SMA (all P<0.05) . Compared with the control group, the PERK stable overexpression group had significant increases in the mRNA expression levels of PERK, eIF2α, and α-SMA and the protein expression levels of PERK, p-eIF2α, and α-SMA (all P<0.05), and immunofluorescence assay showed a significant increase in the expression level of COL1A1 in the PERK stable overexpression group (P<0.05) . Conclusion PERK overexpression can induce the expression of α-SMA and COL1A1 in LX-2 cells, suggesting that the PERK signaling pathway might be one of the important mechanisms of HSC activation.

    Key words: Endoplasmic Reticulum Stress; Eukaryotic Initiation Factor-2; Hepatic Stellate Cells; Collagen Type I

    Research funding: Guangxi Natural Science Foundation Project (2023GXNSFBA026056); The People s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region Youth Fund project (QN2020-1)

    肝纖維化是許多慢性肝病的共同表現(xiàn), 各種不良因素持續(xù)刺激造成肝臟結(jié)構(gòu)和功能改變, 病變持續(xù)發(fā)展將最終引起肝硬化、 肝癌等嚴重并發(fā)癥[1] 。全球健康負擔數(shù)據(jù)[2] 顯示, 肝硬化和其他慢性肝病仍是全球發(fā)病率和病死率的主要原因。因此, 深入研究肝纖維化的發(fā)病機制對疾病早期干預(yù)和阻斷肝纖維化進程意義重大。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊能力失衡, 引起非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔聚集的現(xiàn)象。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能受損時將引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激, 并通過3種不同跨膜蛋白, 即蛋白激酶RNA樣ER激酶 (protein kinase RNA-like endoplasmicreticulum kinase, PERK), 肌醇需要蛋白1 (inositol requiringprotein1, IRE1)及激活轉(zhuǎn)錄因子 6(activating transcriptionfactor 6, ATF6), 啟動非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR) [3]。近年研究[4]發(fā)現(xiàn), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程, 可引起肝細胞凋亡、 促進肝星狀細胞 (HSC) 活化引起肝纖維化發(fā)生發(fā)展; 另一方面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致HSC凋亡, 利于肝纖維化逆轉(zhuǎn)。因此, 本研究聚焦于PERK信號通路對肝纖維化影響, 通過構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激HSC-LX2細胞模型, 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HSC激活及Ⅰ型膠原蛋白 (collagens type Ⅰ,COL1A1) 表達的影響; 同時通過過表達PERK蛋白, 探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路在HSC活化及COL1A1表達中的作用。

    1 材料與方法

    1. 1 實驗細胞及主要試劑 HSC-LX2細胞由紐約西奈山醫(yī)學(xué)院Friedman教授贈送。主要試劑: 毒胡蘿卜素(Thapsigargin, Tg, Sigma公司); 攜帶PERK的Tet-on過表達慢病毒和對照慢病毒 (上海吉凱生物科技有限公司);免疫組化通用二步法試劑盒 (中杉金橋); RNA快速提取試劑盒 (上海奕杉生物); 熒光定量PCR試劑盒、 cDNA逆轉(zhuǎn)錄體系試劑盒 (TaKara生物公司); 一抗: α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(CST 19245S)、 PERK(CST 3192S)、 IRE1(CST 3294S)、 磷酸化真核生物翻譯起始因子2α (phospho eukaryotic initiation factor 2α, p-eIF2α)、 C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白 (C/EBP homologous protein,CHOP)(CST 2895S)、ATF6(CST 65880S);COL1A1 (武漢三鷹 67288-1-lg)、 β-actin (武漢三鷹 10077-1-AP)、 α-Tublin (武漢三鷹 66031-1-lg)、 ATF-4 (武漢三鷹 10835-1-AP); Alexa Fluor 555 (Cell Signaling公司); 山羊抗鼠、 山羊抗兔二抗及增強化學(xué)發(fā)光試劑盒 (Affinity公司); 聚偏二氟乙烯膜 (Millipore公司); 高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco), 澳洲胎牛血清 (Gibco), 4%組織細胞固定液、TritonX-100、 青鏈霉素 (penicillin-streptomycin, PS, Solarbio)qRT-PCR所用引物均由武漢金開瑞公司設(shè)計合成。

    1. 2 方法

    1. 2. 1 患者分組及組織取樣 收集廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院既往診斷為慢性病毒性肝炎且病理診斷為肝纖維化的患者, 排除HIV或酗酒、 由于其他原因引起的肝損傷及合并肝癌患者。根據(jù)慢性肝炎分級分期標準對患者肝纖維化程度進行分級分期。本研究共收集11例慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者的病理切片, 其中G2S1患者3例, G3S3患者4例, G3S4患者2例, G4S4 2例。此外, 收集了9例行手術(shù)切除肝血管瘤或肝腺瘤周圍的正常肝組織病理切片。

    1. 2. 2 免疫組化 將肝組織經(jīng)過福爾馬林固定、 乙醇脫水、 石蠟包埋、 切片、 烘烤 (68 ℃ 120 min)、 二甲苯脫蠟、 100%~70%梯度乙醇水化、 抗原修復(fù) (檸檬酸鹽高壓修復(fù)4 min)、 封閉、 孵育一抗 (4 ℃過夜)、 孵育二抗、 DAB染色5 min、 蘇木素復(fù)染5 min、 乙醇脫水后使用中性樹脂膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照, 結(jié)果由2位研究者在未知切片信息的情況下進行, 每張切片隨機選取5個高倍視野 (×200), 排除非特異性染色后進行評分; 結(jié)合細胞著色比例及染色顏色強度進行評分: 細胞著色比例<5%為0分; 5%~25%為1分; 26%~50%為2分; 51%~75%為3分; 76%~100%為4分。陽性強度按照如下方式進行打分: 無色記為0分, 淺黃色記1分, 棕黃色記2分, 棕褐色記3分; 將上述2個評分乘積作為該視野得分; 計算2位研究者評出每個視野的平均分, 若評分接近取平均值為最終得分, 若評分相差較遠, 則請第3位研究者進行評分, 再計算平均值。最終獲得3分以上者判斷為陽性表達。

    1. 2. 3 HSC-LX2細胞的分組及干預(yù) 細胞常規(guī)復(fù)蘇后, 用含10%胎牛血清+1%PS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的LX2細胞分5組接種在6孔培養(yǎng)板; 待細胞貼壁生長后, 按溶媒對照組, Tg 125 nmol/L、 Tg 250 nmol/L、 Tg 500 nmol/L、Tg 1 000 nmol/L組加入藥物干預(yù)24 h。

    1. 2. 4 慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將生長良好的LX2細胞培養(yǎng)于6孔板, 接種密度為3×105/孔, 當細胞生長至匯合度30%~40%時感染慢病毒, 同時將培養(yǎng)基更換為不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基, 培養(yǎng)8~16 h后, 更換成完全培養(yǎng)基, 同時設(shè)置對照空載慢病毒 (NC) 組。48 h后加入嘌呤霉素進行篩選, 獲得穩(wěn)定株后, 根據(jù)Tet-on載體要求, 加入多西環(huán)素 (終濃度為0. 6 ?g/mL) 誘導(dǎo)48 h。隨后提取總蛋白及RNA行qRT-PCR及蛋白免疫印跡法 (Western Blot) 驗證。

    1. 2. 5 Western Blot實驗 細胞鋪板干預(yù)24 h結(jié)束后,應(yīng)用高效RIPA裂解液提取總蛋白, 用BCA法測定蛋白濃度, 經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì), 經(jīng)轉(zhuǎn)膜后將分離后的條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上, 用快速封閉液 (碧云天公司) 室溫下封閉15 min, TBST洗膜3次, 每次5 min,4 ℃下孵育一抗過夜。TBST洗膜3次, 每次10 min, 37 ℃孵育二抗1 h, TBST洗膜3次, 每次10 min, 應(yīng)用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描, 以β-actin或α-Tublin為內(nèi)參計算目標蛋白相對表達量。

    1. 2. 6 細胞免疫熒光 將生長良好的PERK過表達及空載病毒組細胞接種于裝有蓋玻片的6孔板內(nèi), 完全貼壁后, 用4%組織細胞固定液固定15 min后PBS洗3次,0. 5% TritonX-100通透30 min, PBS洗3次, 10%山羊血清封閉30 min, 4 ℃下孵育一抗過夜。PBST洗3次, 熒光二抗避光37 ℃孵育1 h, PBST洗3次, 加入DAPI復(fù)染, PBST洗2次, 熒光猝滅劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

    1. 2. 7 qRT-PCR 細胞鋪板干預(yù)24 h后, 按RNA快速提取試劑盒說明書提取細胞總RNA, 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA, 然后以cDNA為模板進行 qRT-PCR, 反應(yīng)體系 TB Green ? Premix Ex Taq ? Ⅱ 10 ?L, 上下引物各0. 8 ?L, dH2O 6 ?L, cDNA 2 ?L。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 擴增40個循環(huán)。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參, 應(yīng)用2-△△Ct法計算目標因子的相對表達量。

    1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24. 0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x ˉ±s表示, 兩組間比較采用成組t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗; 不符合正態(tài)分布的計量資料以 M(P25~P75)表示, 兩組間比較采用 MannWhitney U秩和檢驗。P<0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2. 1 肝組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白的表達 肝纖維化患者肝組織病理切片中PERK、 eIF2α、CHOP細胞著色比例及染色強度得分均大于非肝纖維化患者 (P值均<0. 001)。與非肝纖維化肝組織相比, 肝纖維化患者肝組織樣本中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白PERK、 eIF2α及CHOP在纖維化擴大的匯管區(qū)HSC細胞漿表達異常升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0. 001)(表2, 圖1), 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與肝纖維化過程。

    2. 2 Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用下HSC-LX2中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達情況 不同濃度Tg在不同時間點干預(yù)后, LX-2細胞形態(tài)變化不明顯, 但LX-2細胞生長速度明顯被抑制, 且作用時間越長, Tg濃度越大, 細胞被抑制越明顯 (圖2a)。Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后行qRT-PCR檢測, 結(jié)果顯示,相較于空白組 (0 nmol/L), 250、 500、 1 000 nmol/L的Tg誘導(dǎo)下跨膜蛋白PERK表達升高, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均<0. 05)(圖2b)。Western Blot結(jié)果顯示, 不同濃度Tg誘導(dǎo)下IRE1、 PERK、 CHOP表達均升高, 500、 1 000 nmol/L的Tg誘導(dǎo)下ATF6表達升高, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均<0. 05), 提示Tg誘導(dǎo)LX2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型構(gòu)建成功 (圖2c、 d)。

    2. 3 Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下HSC-LX2中α-SMA表達情況qRT-PCR結(jié)果顯示, 相較于空白組, 不同濃度的Tg誘導(dǎo)下α-SMA表達水平升高, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均<0. 01)(圖3a)。Western Blot結(jié)果顯示, 不同濃度Tg刺激后LX2細胞α-SMA表達水平升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0. 05)(圖3b), 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與LX2細胞活化過程。

    2. 4 PERK信號通路對HSC-LX2細胞活化的影響 過表達PERK慢病毒轉(zhuǎn)染LX2細胞后, 光學(xué)顯微鏡觀察LX2細胞形態(tài)發(fā)生微小改變, 無細胞區(qū)較對照組增加 (圖4a); qRT-PCR結(jié)果顯示, PERK過表達 (PERK OE) 組中PERK和eIF2αmRNA表達明顯升高 (圖4b、 c); 進一步行Western Blot實驗結(jié)果提示, PERK OE組中PERK及p-eIF2α表達升高 (P<0. 05)(圖4d), 提示PERK信號通路被激活。細胞免疫熒光結(jié)果提示, 與 NC 組相比, 過表達PERK組COL1A1表達升高 (P<0. 05)(圖5a); qRT-PCR及Western Blot結(jié)果提示, PERK信號通路激活后LX2活化指標α-SMA的mRNA和蛋白表達升高(P<0. 05)(圖5b、 c)。提示激活PERK相關(guān)通路能促進LX2細胞的活化及增加COL1A1表達。

    3 討論

    肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝損傷的組織修復(fù)反應(yīng), 持續(xù)的肝纖維化可引起肝細胞功能障礙、 門靜脈高壓等一系列嚴重并發(fā)癥[5] 。肝纖維化的本質(zhì)主要是肝內(nèi)細胞外基質(zhì) (ECM) 過度沉積, 而ECM主要由活化的HSC產(chǎn)生[6]。當肝損傷或體外培養(yǎng)時, HSC被激活分化為肌成纖維細胞, 肌成纖維細胞的大量增殖使ECM生成增加, 加之其降解失衡, 最終發(fā)展為肝纖維化[7]。而ECM相關(guān)成分α-SMA、 COL1A1和Ⅲ型膠原蛋白也隨著纖維化程度加深而表達升高[8]。因此, α-SMA 及COL1A1均可作為HSC的活化標志物。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是生物細胞的重要細胞器, 廣泛參與蛋白質(zhì)合成、 脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)運及Ca2+平衡的維持等重要生物學(xué)過程中。當細胞受到缺氧、 損傷、 炎癥等有害刺激時, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑Tg是SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) 泵特異性抑制劑, 可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶, 阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從細胞質(zhì)中重吸收Ca2+, 導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的消耗, 從而抑制鈣依賴性分子伴侶, 導(dǎo)致錯誤折疊蛋白質(zhì)的累加, 繼而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。目前常用UPR判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[9-10] 。本研究采用Tg誘導(dǎo)LX2細胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細胞模型, 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與HSC活化之間的潛在關(guān)系。結(jié)果表明, 從125~1 000 nmol/L不同濃度Tg刺激下均可明顯增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK/CHOP、 IRE1、 ATF6表達升高, 3條UPR通路激活, 表明Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細胞模型構(gòu)建成功。LX2細胞活化標志物α-SMA表達升高, 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與LX2細胞的活化過程。

    PERK相關(guān)通路是UPR的經(jīng)典途徑, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,PERK被葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78釋放并激活, 隨后催化eIF2α,使其發(fā)生磷酸化, 抑制翻譯的啟動及抑制蛋白合成, 促進CHOP的轉(zhuǎn)錄和表達[11] 。研究[12] 發(fā)現(xiàn), 相較于輕度肝纖維化組織, 嚴重肝纖維化組織中PERK磷酸化水平升高;在小鼠肝纖維化模型中的PERK磷酸化增加與HSC激活標記的表達升高呈正相關(guān)[13] ; 小分子多肽激素鳶尾素可通過抑制原代HSC內(nèi)PERK/eIF2α/CHOP途徑抑制異質(zhì)核磷酸化A1的降解緩解肝纖維化 [14] 。本研究發(fā)現(xiàn), 相較于非肝纖維化患者, 肝纖維化患者PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白表達升高, 提示PERK通路可能參與肝纖維化發(fā)生。為進一步驗證, 本研究采用慢病毒干擾技術(shù)構(gòu)建PERK過表達的LX2細胞株, 結(jié)果顯示, 相較于空載病毒組, PERK過表達組PERK、 p-eIF2α表達水平升高, PERK通路被激活, 同時HSC活化標志物α-SMA及COL1A1表達水平升高, 提示PERK介導(dǎo)的信號通路參與HSC活化過程及增加Ⅰ型膠原蛋白表達。

    本研究存在一定不足, 未針對Tg誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進一步干預(yù)觀察, 也缺少動物模型上相應(yīng)表型的進一步驗證。綜上所述, 本研究通過對比肝纖維化患者與非肝纖維化患者病理切片免疫組化結(jié)果, 構(gòu)建LX2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型以及構(gòu)建PERK過表達LX2細胞株, 初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路在HSC活化及Ⅰ型膠原蛋白表達中的影響, 為探索肝纖維化發(fā)病機制及臨床尋找逆轉(zhuǎn)肝纖維的治療靶點提供新思路。

    倫理學(xué)聲明: 本研究方案于2022年8月12日經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審批, 批號: KY-KJT-2023-310。

    利益沖突聲明: 本文不存在任何利益沖突。

    作者貢獻聲明: 黎鳳炎負責(zé)設(shè)計論文框架, 實驗實施, 收集數(shù)據(jù), 資料分析, 撰寫論文; 劉澤峰參與課題設(shè)計, 資料分析; 夏雨艷參與實驗實施, 收集數(shù)據(jù); 王文娟參與資料分析; 李琪、 唐利瑕參與統(tǒng)計分析; 張國負責(zé)研究選題, 指導(dǎo)文章撰寫及修改。黎鳳炎、 劉澤峰對本文貢獻等同, 同為第一作者。

    參考文獻:

    [1] HE YH, YAN YJ, ZHANG SF. Quantitative liver surface nodularity score based on imaging for assessment of early cirrhosis in patients with chronic liver disease: A protocol for systematic review and meta-analysis[J]. Medicine, 2021, 100(4): e23636. DOI: 10.1097/MD.0000000000023636.

    [2] GBD 2017 Cirrhosis Collaborators. The global, regional, and national burden of cirrhosis by cause in 195 countries and territories, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet Gastroenterol Hepatol, 2020, 5(3): 245-266. DOI: 10.1016/S2468-1253(19)30349-8.

    [3] ZHANG J, GUO JF, YANG NN, et al. Endoplasmic reticulum stress-mediated cell death in liver injury[J]. Cell Death Dis, 2022, 13(12): 1051. DOI: 10.1038/s41419-022-05444-x.

    [4] XIA SW, WANG ZM, SUN SM, et al. Endoplasmic reticulum stress and protein degradation in chronic liver disease[J]. Pharmacol Res, 2020, 161: 105218. DOI: 10.1016/j.phrs.2020.105218.

    [5] SHAN S, ZHAO LH, MA H, et al. Definition, etiology, and epidemiol?ogy of liver cirrhosis[J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(1): 14-16. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.003.

    單姍, 趙連暉, 馬紅, 等. 肝硬化的定義、病因及流行病學(xué)[J]. 臨床肝膽病雜志, 2021, 37(1): 14-16. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.003.

    [6] XU LY, WEI ST, DONG Y, et al. Regulatory effect of lncRNA MALAT1 on activation of hepatic stellate cell and its mechanism[J]. J Jilin Univ Med Ed, 2023, 49(3): 697-705. DOI: 10.13481/j. 1671-587X.20230319.

    徐菱遙, 魏書堂, 董勇, 等. lncRNA MALAT1對肝星狀細胞活化的調(diào)節(jié)作用及其機制[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2023, 49(3): 697-705. DOI: 10.13481/j.1671-587X.20230319.

    [7] TSUCHIDA T, FRIEDMAN SL. Mechanisms of hepatic stellate cell activation[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14(7): 397-411. DOI: 10.1038/nrgastro.2017.38.

    [8] SUN DL, GUO JB, WANG DD, et al. Effect of exosomes derived from mesenchymal stem cells on the proliferation and activation of hepatic stellate cells in vitro[J]. J Pract Hepatol, 2023, 26(1): 11-14. DOI: 10.3969/j.issn.1672-5069.2023.01.004.

    孫東磊, 郭金波, 王丹丹, 等. 間充質(zhì)干細胞外泌體對體外肝星狀細胞增殖和活化的影響[J]. 實用肝臟病雜志, 2023, 26(1): 11-14. DOI: 10.3969/j.issn.1672-5069.2023.01.004.

    [9] FABRE B, LIVNEH I, ZIV T, et al. Identification of proteins regulated by the proteasome following induction of endoplasmic reticulum stress[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2019, 517(2): 188-192. DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.07.040.

    [10] PETERKOV? L, KMON??KOV? E, RUML T, et al. Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase inhibitors: Beyond anticancer perspective[J]. J Med Chem, 2020, 63(5): 1937-1963. DOI: 10.1021/acs. jmed?chem.9b01509.

    [11] IBRAHIM IM, ABDELMALEK DH, ELFIKY AA. GRP78: A cell's re?sponse to stress[J]. Life Sci, 2019, 226: 156-163. DOI: 10.1016/j.lfs.2019.04.022.

    [12] KOO JH, LEE HJ, KIM W, et al. Endoplasmic reticulum stress in he?patic stellate cells promotes liver fibrosis via PERK-mediated degra?dation of HNRNPA1 and up-regulation of SMAD2[J]. Gastroenterol?ogy, 2016, 150(1): 181-193. e8. DOI: 10.1053/j.gastro.2015.09.039.

    [13] MAIERS JL, MALHI H. Endoplasmic reticulum stress in metabolic liver diseases and hepatic fibrosis[J]. Semin Liver Dis, 2019, 39(2): 235-248. DOI: 10.1055/s-0039-1681032.

    [14] LIAO X, ZHAN W, LI R, et al. Irisin ameliorates endoplasmic reticu?lum stress and liver fibrosis through inhibiting PERK-mediated desta?bilization of HNRNPA1 in hepatic stellate cells[J]. Biol Chem, 2021, 402(6): 703-715. DOI: 10.1515/hsz-2020-0251.

    收稿日期:2023-10-12; 錄用日期:2023-11-30

    本文編輯:邢翔宇

    猜你喜歡
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激膠原
    牛跟腱膠原與草魚皮膠原的結(jié)構(gòu)表征及自組裝行為比較
    白蘆藜醇對糖尿病小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
    蚯蚓活性組分對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致急性肝損傷的保護作用
    原花青素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)對H9C2心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腎臟缺血再灌注和環(huán)孢素A損傷中的作用及研究進展
    膠原無紡布在止血方面的應(yīng)用
    RNA干擾沉默STAT3對膠原誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用
    紅藍光聯(lián)合膠原貼治療面部尋常痤瘡療效觀察
    丹蛭降糖膠囊對肥胖大鼠骨骼肌IRE1α—JNK信號通路的干預(yù)效應(yīng)
    硫化氫抑制葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78減輕6—OHDA誘導(dǎo)的PC12細胞損傷
    日韩人妻高清精品专区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 一级毛片女人18水好多| 一级黄片播放器| 毛片女人毛片| 午夜老司机福利剧场| 中国美女看黄片| 亚洲av第一区精品v没综合| a级毛片a级免费在线| 成人国产综合亚洲| 老司机在亚洲福利影院| av天堂中文字幕网| 成人欧美大片| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 九九在线视频观看精品| 一进一出抽搐动态| 欧美激情在线99| 母亲3免费完整高清在线观看| 中国美女看黄片| 日本免费a在线| 深爱激情五月婷婷| 日韩欧美三级三区| 99视频精品全部免费 在线| 一区二区三区国产精品乱码| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 老鸭窝网址在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久国产乱子伦精品免费另类| 少妇的逼水好多| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产亚洲欧美98| 日韩高清综合在线| 久久久国产精品麻豆| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产视频内射| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 99国产综合亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国内精品久久久久精免费| 看免费av毛片| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久草成人影院| 九九热线精品视视频播放| e午夜精品久久久久久久| 69av精品久久久久久| 国产精品三级大全| 久久久成人免费电影| 精品国产三级普通话版| 男女下面进入的视频免费午夜| av国产免费在线观看| 久久精品人妻少妇| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品一区二区三区人妻视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 男女床上黄色一级片免费看| 免费av观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美一级毛片孕妇| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 精华霜和精华液先用哪个| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费在线观看影片大全网站| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲在线自拍视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 99国产精品一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 狂野欧美激情性xxxx| 给我免费播放毛片高清在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩欧美三级三区| 少妇的逼好多水| 免费高清视频大片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美bdsm另类| 一区福利在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 日韩欧美精品v在线| 无遮挡黄片免费观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 久久精品国产清高在天天线| 午夜福利18| 色吧在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 超碰av人人做人人爽久久 | 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美黄色淫秽网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久国产成人免费| 51国产日韩欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线观看日韩欧美| 色视频www国产| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产97色在线日韩免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久性视频一级片| 成人午夜高清在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 久久久国产成人精品二区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清videossex| 成人一区二区视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美区成人在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 波多野结衣高清无吗| 丁香欧美五月| 色综合亚洲欧美另类图片| 成人特级av手机在线观看| 一个人免费在线观看电影| 日韩高清综合在线| 麻豆国产av国片精品| 一级黄片播放器| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲成av人片在线播放无| h日本视频在线播放| 全区人妻精品视频| 好男人电影高清在线观看| 国产三级中文精品| 久久久成人免费电影| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 色综合站精品国产| 欧美日韩乱码在线| 99精品久久久久人妻精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线看三级毛片| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产精品成人综合色| 两个人视频免费观看高清| а√天堂www在线а√下载| 国产精华一区二区三区| www.www免费av| 午夜福利在线观看吧| 中亚洲国语对白在线视频| 国产黄片美女视频| 欧美区成人在线视频| 无遮挡黄片免费观看| 少妇丰满av| 在线免费观看的www视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产成人影院久久av| 欧美国产日韩亚洲一区| 天堂网av新在线| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美日韩精品网址| 看片在线看免费视频| 日本成人三级电影网站| 日本五十路高清| 88av欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 黄色片一级片一级黄色片| 少妇的丰满在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲成av人片在线播放无| 久久香蕉精品热| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 嫩草影院精品99| 可以在线观看的亚洲视频| 脱女人内裤的视频| 国内精品一区二区在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 最好的美女福利视频网| 午夜免费观看网址| 深爱激情五月婷婷| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久草成人影院| 免费人成在线观看视频色| 网址你懂的国产日韩在线| 91字幕亚洲| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 十八禁人妻一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 在线观看66精品国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成年女人永久免费观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产中年淑女户外野战色| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 18禁美女被吸乳视频| 欧美色视频一区免费| 一级毛片女人18水好多| 精品人妻偷拍中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品久久久久久久久免 | 国产 一区 欧美 日韩| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品影院久久| 草草在线视频免费看| 色综合站精品国产| 欧美3d第一页| 免费看光身美女| 精品国产三级普通话版| 免费高清视频大片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日本在线视频免费播放| 日韩精品中文字幕看吧| 国产成人系列免费观看| 一个人免费在线观看电影| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 色尼玛亚洲综合影院| 熟女电影av网| 五月玫瑰六月丁香| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 香蕉久久夜色| av欧美777| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 91久久精品国产一区二区成人 | 日本黄大片高清| 97超视频在线观看视频| 麻豆国产av国片精品| 午夜日韩欧美国产| 亚洲乱码一区二区免费版| 男女之事视频高清在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品在线美女| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲av一区综合| 免费在线观看亚洲国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区三区视频了| 日本 av在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 色视频www国产| 久久人妻av系列| 波多野结衣巨乳人妻| 手机成人av网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 偷拍熟女少妇极品色| 很黄的视频免费| 9191精品国产免费久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 哪里可以看免费的av片| 国产淫片久久久久久久久 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲国产中文字幕在线视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩精品青青久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线a可以看的网站| 国产成人系列免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 级片在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品一及| 久久久久九九精品影院| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 免费看十八禁软件| 亚洲avbb在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品免费久久久久久久清纯| 少妇人妻精品综合一区二区 | 精品国产亚洲在线| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 香蕉丝袜av| 99热6这里只有精品| av专区在线播放| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品,欧美在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本在线视频免费播放| 在线观看66精品国产| 亚洲自拍偷在线| 久久精品综合一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 两个人的视频大全免费| 有码 亚洲区| 午夜老司机福利剧场| 午夜福利成人在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲,欧美精品.| 色视频www国产| 日本黄大片高清| 亚洲av熟女| 中文字幕久久专区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 热99re8久久精品国产| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲,欧美精品.| xxxwww97欧美| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品久久久久久,| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲欧美激情综合另类| 小说图片视频综合网站| 国产精品一区二区三区四区久久| 很黄的视频免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 超碰av人人做人人爽久久 | 精品不卡国产一区二区三区| 有码 亚洲区| 国产精品久久久久久久久免 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日韩欧美精品免费久久 | 国产成人av激情在线播放| 欧美不卡视频在线免费观看| 宅男免费午夜| 欧美一级毛片孕妇| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成年人精品一区二区| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜福利在线观看吧| 色综合婷婷激情| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜亚洲福利在线播放| av黄色大香蕉| 麻豆久久精品国产亚洲av| 69av精品久久久久久| 免费观看精品视频网站| 麻豆成人av在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| xxx96com| 国产高潮美女av| 亚洲七黄色美女视频| 国产欧美日韩精品一区二区| www日本黄色视频网| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| av在线蜜桃| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| x7x7x7水蜜桃| 国内精品美女久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 手机成人av网站| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久色成人| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产视频内射| 欧美av亚洲av综合av国产av| 婷婷丁香在线五月| 日本 av在线| 国产精品永久免费网站| 88av欧美| 看片在线看免费视频| 九九热线精品视视频播放| 久久久久久久久中文| 中文字幕熟女人妻在线| 国产午夜精品论理片| 性色av乱码一区二区三区2| 又黄又粗又硬又大视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 全区人妻精品视频| 日韩亚洲欧美综合| 波多野结衣高清无吗| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 91麻豆av在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人精品一区二区免费| 观看美女的网站| 岛国在线观看网站| 一区二区三区免费毛片| 身体一侧抽搐| 国产成人av教育| 男女午夜视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产av一区在线观看免费| 丰满的人妻完整版| 怎么达到女性高潮| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲国产精品合色在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 动漫黄色视频在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 日韩欧美免费精品| 757午夜福利合集在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 免费av不卡在线播放| 日韩高清综合在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产三级在线视频| 欧美中文综合在线视频| 丁香欧美五月| 桃色一区二区三区在线观看| 成人三级黄色视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜福利在线在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 色吧在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 18禁美女被吸乳视频| 黄色日韩在线| 亚洲av免费高清在线观看| 国产乱人视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久99热这里只有精品18| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品亚洲美女久久久| 91久久精品国产一区二区成人 | 搡老妇女老女人老熟妇| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成年免费大片在线观看| 国产成人系列免费观看| 天堂影院成人在线观看| 长腿黑丝高跟| 欧美日韩国产亚洲二区| 91在线精品国自产拍蜜月 | 日韩有码中文字幕| 91av网一区二区| 99久久成人亚洲精品观看| 国产成年人精品一区二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人午夜高清在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 97碰自拍视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜福利欧美成人| 级片在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲最大成人中文| 国产亚洲av嫩草精品影院| ponron亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲精品成人久久久久久| e午夜精品久久久久久久| av国产免费在线观看| 制服人妻中文乱码| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲avbb在线观看| 热99在线观看视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美大码av| 欧美午夜高清在线| 国产久久久一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 美女大奶头视频| 久久久国产成人精品二区| 午夜福利欧美成人| 两人在一起打扑克的视频| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲欧美98| 亚洲国产精品sss在线观看| 在线观看日韩欧美| 我的老师免费观看完整版| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人永久免费在线观看视频| 欧美性猛交黑人性爽| 中文字幕久久专区| 亚洲18禁久久av| 九色国产91popny在线| 宅男免费午夜| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久久久大av| 国产久久久一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美国产日韩亚洲一区| 一a级毛片在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲美女视频黄频| 日本在线视频免费播放| 一进一出好大好爽视频| 观看免费一级毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本一本二区三区精品| 精品乱码久久久久久99久播| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄片小视频在线播放| 国内精品久久久久精免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久人人精品亚洲av| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美极品一区二区三区四区| 久久这里只有精品中国| 国产高清videossex| 国产91精品成人一区二区三区| xxx96com| 亚洲精品粉嫩美女一区| 在线播放无遮挡| 日本免费a在线| www日本在线高清视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品国产高清国产av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 日韩欧美免费精品| 手机成人av网站| 99riav亚洲国产免费| 1000部很黄的大片| av女优亚洲男人天堂| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99热6这里只有精品| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲人成网站在线播| 一区福利在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产免费av片在线观看野外av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 老司机福利观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 人妻久久中文字幕网| 美女免费视频网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久中文看片网| 国产精品野战在线观看| 欧美性感艳星| 欧美日本视频| or卡值多少钱| 国产探花在线观看一区二区| 久久香蕉国产精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 深夜精品福利| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 色哟哟哟哟哟哟| 少妇人妻精品综合一区二区 | 99热精品在线国产| av在线天堂中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 麻豆久久精品国产亚洲av| 两人在一起打扑克的视频| 草草在线视频免费看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 最新美女视频免费是黄的| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| tocl精华| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美色欧美亚洲另类二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| svipshipincom国产片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 18+在线观看网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费看a级黄色片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 黄色视频,在线免费观看| 不卡一级毛片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品精品国产色婷婷| 日本黄大片高清| 亚洲国产精品久久男人天堂| 偷拍熟女少妇极品色| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品永久免费网站| 亚洲av一区综合| ponron亚洲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲七黄色美女视频| 好男人电影高清在线观看| 观看免费一级毛片| 69av精品久久久久久| 国产av在哪里看| 国产探花在线观看一区二区| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 国产午夜福利久久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 中文字幕熟女人妻在线| av在线蜜桃| 99久久成人亚洲精品观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | eeuss影院久久|