丹蛭降糖膠囊對肥胖大鼠骨骼肌IRE1α—JNK信號通路的干預(yù)效應(yīng)

趙曉彤等

[摘要] 目的 探討丹蛭降糖膠囊對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERs）相關(guān)因子肌醇需求激酶1α（IRE1α）、磷酸化IRE1α（p-IRE1α）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）表達(dá)的影響。 方法 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為普通飲食組（NC組）、單純高脂飲食組（HF組）、高脂飲食+丹蛭降糖膠囊組（FD組），每組各10只。應(yīng)用全自動生化分析儀測定骨骼肌三酰甘油（TG）含量；Western blot檢測骨骼肌組織IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 ①NC組、HF組以及FD組骨骼肌內(nèi)TG含量分別為（1.87±0.72）、（3.03±0.71）、（2.71±0.58）μmol/g。與NC組比較，HF組大鼠骨骼肌TG含量顯著增高（P = 0.005）；與HF組比較，F(xiàn)D組大鼠骨骼肌TG含量明顯下降（P = 0.024）。②Western blot檢測結(jié)果顯示，HF組p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK較NC組明顯升高（P < 0.05）；FD組p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK較HF組明顯降低（P < 0.05）。③Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大鼠骨骼肌TG含量與HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK均呈正相關(guān)（r = 0.63、0.66、0.57，均P < 0.01）。 結(jié)論 丹蛭降糖膠囊可減輕骨骼肌脂質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)ERs相關(guān)IRE1α-JNK通路，從而改善骨骼肌胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞] 肥胖；骨骼肌；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；肌醇需求激酶1α；c-jun氨基末端激酶；大鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（c）-0009-04

Intervention effect of Danzhi Jiangtang Capsule in IRE1α-JNK signaling pathway of skeletal muscle in obese rats

ZHAO Xiaotong1 CHEN Mingwei1 FANG Zhaohui1 XIA Tongjia2 WANG Youmin1

1.Department of Endocrinology， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Anhui Province， Hefei 230032， China； 2.Department of Endocrinology， the First Affiliated Hospital of Anhui Taditional Medicine University， Anhui Province， Hefei 230031， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Danzhi Jiangtang Capsule on the expressions of endoplasmic reticulum stress（ERs） related factors including IRE1α， p-IRE1α， JNK and p-JNK in skeletal muscle in obese rats fed with high-fat diet. Methods 30 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into basal diet group （NC group， n = 10）， untreated high-fat diet group （HF group， n = 10）， high-fat diet plus Danzhi Jiangtang Capsule （FD group， n = 10）. The contents of triglyceride in skeletal muscle were measured by automatic biochemical analyzer， and protein expression of IRE1α， p-IRE1α， JNK and p-JNK were determined by Western blot analysis. Results ①The contents of triglyceride in skeletal muscle in the NC group， HF group and FD group were （1.87±0.72）， （3.03±0.71）， （2.71±0.58） μmol/g， respectively. Compared with the NC group， the contents of triglyceride in skeletal muscle in the HF group were reduced significantly （P = 0.005）. In addition， the content of triglyceride in skeletal muscle in the FD group was significantly higher than that in the NC group （P = 0.024）. ②Western blot analysis revealed that p-IRE1α/IRE1α and p-JNK/JNK in skeletal muscle in the HF group were significantly higher than those in the NC group （P < 0.05）. Compared with the HF group， p-IRE1α/IRE1α and p-JNK/JNK in skeletal muscle of the FD group were decreased significantly （P < 0.05）. ③Pearson correlation analysis showed that the contents of triglyceride in skeletal muscle were positive correlated with HOMA-IR ， p-IRE1α/IRE1α and p-JNK/JNK （r = 0.63， 0.66， 0.57， all P < 0.01）. Conclusion Danzhi Jiangtang Capsule can reduce lipid deposition in skeletal muscle， regulate ERs related IRE1α-JNK signaling pathway， thus improve skeletal insulin resistance.

[Key words] Obese； Skeletal muscle； Endoplasmic reticulum stress；Inositol requiring enzyme-1α；c-Jun N-terminal kinase； Rats

目前普遍認(rèn)為，外周組織的胰島素抵抗（IR）是2型糖尿?。═2DM）發(fā)病的主要病理生理機(jī)制之一，其中骨骼肌是IR發(fā)生的主要位點(diǎn)[1]。肥胖或T2DM狀態(tài)下，脂質(zhì)在骨骼肌中的異位沉積，可導(dǎo)致骨骼肌IR程度進(jìn)一步加重[2]。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERs）在骨骼肌IR發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸引起人們的關(guān)注[3-4]。有研究認(rèn)為，肌醇需求激酶1α（IRE1α）-c-jun氨基末端激酶（JNK）介導(dǎo)的ERs信號通路參與了IR的發(fā)生及進(jìn)展[5]。

丹蛭降糖膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物制劑中心生產(chǎn)的院內(nèi)復(fù)方制劑。本文作者先前研究發(fā)現(xiàn)它可提高肥胖模型大鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)，發(fā)揮胰島素增敏效應(yīng)，具體機(jī)制尚不完全清楚[6]。本實(shí)驗(yàn)首先建立營養(yǎng)性肥胖SD大鼠模型，觀察大鼠骨骼肌組織中三酰甘油（TG）沉積情況，并應(yīng)用丹蛭降糖膠囊進(jìn)行干預(yù)，觀察其對骨骼肌TG沉積以及骨骼肌ERs相關(guān)因子IRE1α、磷酸化IRE1α（p-IRE1α）、JNK、磷酸化JNK（p-JNK）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 肥胖大鼠模型建立、分組及給藥

清潔級4周齡雄性SD大鼠40只，體重（150±30）g，購自安立實(shí)驗(yàn)動物公司。造模前先用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。明暗周期12/12 h，自由攝食、飲水。隨機(jī)挑選10只大鼠作為普通飲食對照組（NC組），給予普通飼料喂養(yǎng)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其余30只給予高脂飼料喂養(yǎng)，作為高脂飲食組（HD組）。12周后20只符合肥胖模型的大鼠則按體重再隨機(jī)分為高脂對照組（HF組）、高脂+丹蛭降糖膠囊組（FD組）各10只，繼續(xù)高脂飲食，同時每組分別給予溶劑（0.9%生理鹽水）2 mL/（kg·d）、丹蛭降糖膠囊470 mg/（kg·d）灌胃。NC組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，給予蒸餾水灌胃。治療持續(xù)4周。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本收集 16周時3組大鼠禁食過夜8 h后，麻醉（10%水合氯醛）狀態(tài)下準(zhǔn)確稱取體重，分離采自下腔靜脈的血樣，離心后獲得的血清置-80℃冰箱保存。迅速分離附睪及腎周脂肪，稱取內(nèi)臟脂肪重量。隨后分離大鼠股四頭肌組織，置于液氮罐中保存以備提取TG。

1.2.2 血液生化指標(biāo)檢測 應(yīng)用強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀檢測空腹血糖（FBG）。應(yīng)用全自動生化分析儀檢測TG、總膽固醇（TC）。放射免疫法檢測血清空腹胰島素（FINS）。銅顯色法測定血清游離脂肪酸（FFA）。

1.2.3 相關(guān)指數(shù)計(jì)算 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）以及腹脂指數(shù)的計(jì)算方法參見作者先前的文獻(xiàn)報(bào)道[7]。

1.2.4 骨骼肌中TG（IMTG）含量的測定 取100 mg大鼠股四頭肌組織，剪碎，制備骨骼肌勻漿[7]，離心半徑為15 cm，6000 r/min低溫離心10 min（Eppendorf 5804），應(yīng)用全自動生化分析儀測定骨骼肌勻漿中IMTG含量。

1.2.5 Western blot法檢測骨骼肌組織中IRE1α、p- IRE1α、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)：制備組織裂解液，冰上裂解股四頭肌組織，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測蛋白含量。提取蛋白經(jīng)100℃ 5 min變性后上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。加入IRE1α（1∶1000）、p-IRE1α（1∶800）、JNK（1∶700）、p-JNK（1∶2000）蛋白一抗，孵育過夜。第2天加入二抗孵育2 h，ECL顯影，曝光，掃描。凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶灰度值，以磷酸甘油醛脫氫酶灰度值作為校正，計(jì)算目的蛋白IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、攝食量、生化指標(biāo)、腹脂指數(shù)和HOMA-IR的比較

HF組的體重、FBG、FINS、TG、TC、腹脂指數(shù)、HOMA-IR、FFA均較NC組明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），攝食量則較NC組明顯降低（P < 0.05）；雖然FD組體重、攝食量、FBG、FINS、TG、TC、腹脂指數(shù)、HOMA-IR、FFA均較HF組有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠IMTG含量的比較

HF組IMTG含量顯著高于NC組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.005）；與HF組比較，F(xiàn)D組大鼠IMTG明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.024）。見表1。

2.3 各組大鼠骨骼肌IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的比較

各組大鼠骨骼肌組織JNK及IRE1α的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與NC組比較，HF組大鼠骨骼肌組織p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與HF組比較，F(xiàn)D組肥胖大鼠骨骼肌組織p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2、圖1。

2.4 骨骼肌內(nèi)TG含量與HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK相關(guān)性分析

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，大鼠IMTG與HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均呈正相關(guān)（r = 0.63、0.66、0.57，均P < 0.01）。

3 討論

在研究人類營養(yǎng)性肥胖發(fā)病機(jī)制過程中常采用高脂誘導(dǎo)的SD肥胖大鼠模型。本研究發(fā)現(xiàn)，該肥胖模型大鼠的內(nèi)臟脂肪堆積、糖脂代謝紊亂明顯，胰島素抵抗程度嚴(yán)重，與過去的報(bào)道一致[8-9]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊、成熟與分泌的重要細(xì)胞器。高脂飲食、缺氧、饑餓、氧化應(yīng)激、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、藥物、自由基侵襲等多種原因可導(dǎo)致ERs的發(fā)生。目前研究認(rèn)為ERs在IR的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演關(guān)鍵角色[3-4]。本研究顯示，高脂飲食組大鼠骨骼肌中TG的含量明顯增高，TG含量與反映胰島素抵抗程度的指標(biāo)HOMA-IR以及ERs狀態(tài)的p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK均呈正相關(guān)。表明在高脂環(huán)境誘導(dǎo)的肥胖大鼠中，骨骼肌中脂質(zhì)沉積增加可能與IR以及ERs的發(fā)生存在內(nèi)在聯(lián)系。

IRE1是介導(dǎo)ERs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜蛋白之一，IRE1α是IRE1的主要結(jié)構(gòu)，在許多組織中皆有表達(dá)，IRE1α經(jīng)自身磷酸化被激活，形成p-IRE1α。當(dāng)ERs長期得不到緩解時，會啟動細(xì)胞凋亡[10]。IRE1α可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的信號分子，可通過其激酶的作用，結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2），并與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶（TNF-dependent apoptosis-signaling kinase 1，ASK1）共同形成TRAF2-ASK1-JNK復(fù)合體，激活JNK通路[11]。JNK是一種絲裂原活化蛋白激酶，一方面可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2，甚至直接激活Bcl家族中Bax基因促進(jìn)凋亡[12]，另一方面，JNK可通過調(diào)節(jié)胰島素受體底物1（IRS1）的磷酸化調(diào)控IR的發(fā)生[13]。為消除總IRE1α蛋白及總JNK蛋白變化對觀察結(jié)果的干擾，本研究采用活化后的蛋白指標(biāo)與相應(yīng)總蛋白指標(biāo)比值，即p-IRE1α/IRE1α和p-JNK/JNK來反映IRE1α-JNK信號通路蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，盡管HF組大鼠骨骼肌組織中IRE1α及JNK的蛋白表達(dá)無顯著改變，但其 p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均明顯升高，表明HF組大鼠骨骼肌組織存在明顯ERs。

丹蛭降糖膠囊是由太子參、丹皮、生地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成的復(fù)方制劑。研究表明，丹蛭降糖膠囊可提高肥胖大鼠網(wǎng)膜脂肪組織中PPAR-γ以及骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 mRNA表達(dá)，具有改善IR的功效[6，14-16]。然而，在本組資料中，筆者未發(fā)現(xiàn)丹蛭降糖膠囊對肥胖大鼠中反映IR狀態(tài)指標(biāo)（FINS、HOMA-IR）的顯著改善效應(yīng)。由于FINS以及HOMA-IR難以準(zhǔn)確反映大鼠IR狀態(tài)，而高胰島素正葡萄糖鉗夾技術(shù)則為測定IR的金標(biāo)準(zhǔn)，因此上述結(jié)果有待進(jìn)一步研究以明確。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，與HF組大鼠比較，應(yīng)用丹蛭降糖膠囊干預(yù)的FD組大鼠中，盡管血清糖脂生化指標(biāo)無顯著改變，但其骨骼肌內(nèi)TG含量卻顯著降低。已有研究發(fā)現(xiàn)，丹蛭降糖膠囊可下調(diào)肥胖大鼠骨骼肌細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）的表達(dá)，降低骨骼肌中TG的含量，從而改善骨骼肌脂質(zhì)沉積和IR[7]。此外，盡管與HF組大鼠比較，F(xiàn)D組大鼠骨骼肌組織IRE1α、JNK蛋白表達(dá)無明顯差異，但p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK卻均顯著降低。上述研究發(fā)現(xiàn)提示丹蛭降糖膠囊可能通過改善肥胖大鼠骨骼肌脂質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)IRE1α-JNK信號通路，緩解ERs，從而改善骨骼肌IR。本研究結(jié)果將為揭示丹蛭降糖膠囊改善骨骼肌IR提供了一個新的機(jī)制認(rèn)識。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)丹蛭降糖膠囊可降低肥胖大鼠骨骼肌中TG的含量，緩解ERs，從而改善骨骼肌IR。

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（收稿日期：2014-09-25 本文編輯：任 念）