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    乳腺癌BAG—1基因表達(dá)與表皮生長因子受體表達(dá)的相關(guān)性

    2015-02-03 16:42:26楊輝徐笑紅
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年36期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株表皮生長因子

    楊輝 徐笑紅

    [摘要] 目的 探討乳腺癌BAG-1基因表達(dá)與表皮生長因子受體(EGFR)表達(dá)的相關(guān)性。 方法 培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株,采用實時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測EGFR(+)和EGFR(-)細(xì)胞株中BAG-1 mRNA的表達(dá)情況,West blot法檢測其蛋白水平。分析BAG-1基因表達(dá)與EGFR表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 MDA-MB-231、T47D細(xì)胞株EGFR mRNA和EGFR蛋白陽性表達(dá),MCF-7、SLBP3細(xì)胞株EGFR mRNA和EGFR蛋白陰性表達(dá)。T47D細(xì)胞株BAG-1 mRNA的表達(dá)水平最高[(29.6±0.4)×10-4],其次為MDA-MB-231細(xì)胞株[(6.9±0.3)×10-4],兩者的表達(dá)水平均顯著高于MCF-7細(xì)胞株[(4.3±0.5)×10-4]、SKBR3細(xì)胞株[(0.3±0.1)×10-4],差異的有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。 結(jié)論 BAG-1表達(dá)與EGFR存在相關(guān)性,可作為乳腺癌靶向治療的潛在靶點。

    [關(guān)鍵詞] 乳腺癌;表皮生長因子受體;B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)抗凋亡基因

    [中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2014)12(c)-0025-05

    Correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer

    YANG Hui1 XU Xiaohong2

    1.Center of Tumor Radiation and Chemotherapy, Yinzhou People's Hospital of Ningbo City, Zhejiang Province, Ningbo 315000, China; 2.The Center of Tumor Radiation, Zhejiang Provincial Tumor Hospital, Zhejiang Province, Hangzhou 310022, China

    [Abstract] Objective To discuss the correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer. Methods Breast cancer cell lines were cultured, BAG-1 mRNA expression was detected by PCR in EGFR (+) and EGFR (-) cell lines. BAG-1 protein expression was detected by West blot. Correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer was analyzed. Results EGFR mRNA and EGFR protein were positive expression in EGFR MDA-MB-231 and T47D cell lines, and negative expression in MCF-7 and SLBP3 cell lines. BAG-1 mRNA expression was highest in T47D cell line [(29.6±0.4)×10-4], followed by MDA-MB-231 cell line [(6.9±0.3)×10-4]. Both expression levels were significantly higher than that of MCF-7 cell line [(4.3±0.5)×10-4] and SKBR3 cell line [(0.3±0.1)×10-4], the differences were statistically significant (P < 0.01). Conclusion Expression of BAG-1 shows correlation with EGFR, which can be used as a potential targets for targeted therapy of breast cancer.

    [Key words] Breast cancer; EGFR; BAG-1

    乳腺癌是外科常見腫瘤,威脅女性的健康。近年來隨著篩查方法的不斷發(fā)展,早期乳腺癌的檢出率和治愈率逐漸升高,患者的生存時間也逐漸延長。綜合治療的發(fā)展極大地提高了乳腺癌的治療效果。乳腺癌靶向治療的分子靶點主要有人類表皮生長因子受體-2(epidermal growth factor receptor,EGFR-2)及EGFR[1-2]。EGFR屬于表皮生長因子家族成員之一,是一種跨膜蛋白,由原癌基因c-erbB編碼,具有抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤血管化、促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用,能夠加快腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[3-4]。BAG-1是一種抗凋亡基因,編碼一種多功能結(jié)合蛋白,與細(xì)胞多種蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、增殖、分化以及凋亡等[5]。BAG-1的過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡,包括放療、化療等誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致癌細(xì)胞對治療耐受。研究顯示采用siRNA技術(shù)降低肺癌中BAG-1的表達(dá),結(jié)果EGFR基因及蛋白的表達(dá)升高,提示二者存在一定的相關(guān)性[6]。本研究分析乳腺癌腫BAG-1基因表達(dá)與EGFR表達(dá)的相關(guān)性,并分析其對乳腺癌靶向治療的影響?,F(xiàn)將結(jié)果報道如下:

    1 材料與方法

    1.1 材料及儀器

    乳腺癌細(xì)胞株EGFR(+)株MDA-MB-231、T47D和EGFR(-)株SKBR3、MCF-7。細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶由Hyclone公司提供。四甲基乙二胺、甘氨酸、預(yù)染蛋白Marker、丙烯酰胺、ECL顯影液、PVDF膜,一抗兔抗BAF-1抗體、抗β-actin抗體、抗EGFR、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國CST公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    從冰箱中取出細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。觀察細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的平底壁時,倒掉培養(yǎng)液,沖洗后,胰蛋白酶消化,37℃孵育3 min,觀察細(xì)胞變圓、間隙變大時,加入RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化,細(xì)胞分瓶培養(yǎng)。

    1.2.2 實時聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測EGFR mRNA和BAG-1 mRNA的表達(dá)

    1.2.2.1 總RNA提取 (5~10)×106個細(xì)胞中加Trizol 1 mL,吹吸裂解后室溫靜置5 min。取出勻漿,加氯仿200 μL,混勻,4℃下12 000 r/min 離心15 min。取上層,加等體積的異丙醇,混勻,室溫下放置10 min,4℃下12 000 r/min離心10 min。棄上清,加75%乙醇1 mL,4℃,7500 r/min離心5 min,棄上清。晾干后加DEPC 20 μL溶解。

    1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系5×PrimeScript Buffer 4 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix1 1 μL,Oligo dT Primer 1 μL,Random 6 mers 1 μL,Total RNA 1 μg,RNase Free dH2O加至反應(yīng)體系體積20 μL,條件37℃,15 min,85℃ 5 s。-20℃冰箱保存。

    1.2.2.3 PCR擴(kuò)增 采用預(yù)混試劑Premis Taq擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 min,BAG-1 57℃退火30 min,EGFR 58℃退火30 min,7℃延伸15 min,72℃延伸10 min,進(jìn)行35個循環(huán)。BAG-1產(chǎn)物片段160 bp,EGFR產(chǎn)物片段163 bp,β-actin產(chǎn)物片段205 bp。1.5瓊脂糖將凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物。

    1.2.2.4 Real-time PCR 反應(yīng)液體系20 μL,2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL,目的基因上游引物0.4 μL, 下游引物0.4 μL,模板cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL。94℃預(yù)變性30 s,94℃變性5 s,57℃退火30 s,變性和退火進(jìn)行39個循環(huán)。溶解曲線65~95℃。分析結(jié)果,根據(jù)實時熒光定量PCR相對定量檢測方法。

    1.2.3 Western blot 法檢測EGFR蛋白和BAG-1蛋白表達(dá)

    倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS液沖洗3次,每孔加裂解液80 μL,在冰面上晃動6孔板10次,細(xì)胞充分裂解,將蛋白吸入到EP管中,100℃水浴10 min,12 000 r/min離心10 min,取上清至EP管內(nèi),檢測蛋白濃度。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,灌注凝膠后,上樣,恒流20 mA電流電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加一抗,4℃過夜,TBST洗5~10 min,重復(fù)3次,加二抗,室溫1 h,TBST洗5~10 min,重復(fù)3次。顯影,曝光。EGFR呈棕黃色顆粒,主要定位在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,不同細(xì)胞株間BAG-1 mRNA、EGFR mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較采用采用F檢驗和t檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同細(xì)胞株EGFR mRNA以及EGFR蛋白表達(dá)情況

    圖1結(jié)果顯示,MDA-MB-231、T47D細(xì)胞株EGFR mRNA陽性表達(dá),MCF-7、SLBP3細(xì)胞株EGFR mRNA不表達(dá)。圖2結(jié)果顯示T47D細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞株EGFR蛋白強(qiáng)表達(dá),MCF-7、SLBP3細(xì)胞株EGFR蛋白陰性表達(dá)。

    1為MCF-7細(xì)胞株β-actin;2為MDA-MB-231細(xì)胞株β-actin;3為SLBP3細(xì)胞株β-actin;4為T47D細(xì)胞株β-actin;5為MCF-7細(xì)胞株EGFR mRNA;6為MDA-MB-231細(xì)胞株EGFR mRNA;7為SLBP3細(xì)胞株EGFR mRNA;8為T47D細(xì)胞株EGFR mRNA;EGFR:表皮生長因子受體

    圖1 不同細(xì)胞株EGFR mRNA水平

    1為T47D細(xì)胞株;2為MDA-MB-231細(xì)胞株;3為MCF-7細(xì)胞株;4為SKBR3細(xì)胞株

    圖2 不同細(xì)胞株表皮生長因子受體蛋白水平

    2.2 EGFR(+)和EGFR(-)細(xì)胞株BAG-1 mRNA以及蛋白表達(dá)

    EGFR(+)和EGFR(-)細(xì)胞株BAG-1 mRNA T47D細(xì)胞株BAG-1 mRNA的表達(dá)水平最高,其次為MDA-MB-231細(xì)胞株,兩者的表達(dá)水平均顯著高于MCF-7和SKBR3細(xì)胞株。△CT值:T47D細(xì)胞株與MDA-MB-231及MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較,差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t = 14.8、19.8、36.3,P < 0.01);MDA-MB-231細(xì)胞株與MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較,差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t = 3.7、20.6,P < 0.01);MCF-7細(xì)胞株比與SKBR3細(xì)胞株比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t = 17.4,P < 0.01)。mRNA表達(dá)量:T47D細(xì)胞株與MDA-MB-231、MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較,差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t = 101.5、88.4、158.9,P < 0.01);MDA-MB-231細(xì)胞株與MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較,差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t = 9.9、46.7,P < 0.01);MCF-7細(xì)胞株比與SKBR3細(xì)胞株比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(t = 17.5,P < 0.01)。見表1,圖3、4。

    表1 不同EGFR表達(dá)水平細(xì)胞BAG-1 mRNA表達(dá)量比較

    注:△CT值=BAG-1 CT值-βactin CT值;EGFR:表皮生長因子受體

    1為MDA-MB-231細(xì)胞β-actin;2為MCF-7細(xì)胞β-actin;3為SKBR3細(xì)胞β-actin;4為T47D細(xì)胞β-actin;5為MDA-MB-231細(xì)胞;6為MCF-7細(xì)胞;7為SKBR3細(xì)胞;8為T47D細(xì)胞

    圖3 EGFR(+)和EGFR(-)細(xì)胞株BAG-1 mRNA表達(dá)

    1為MDA-MB-231細(xì)胞株;2為MCF-7細(xì)胞株;3為SKBR3細(xì)胞株;4為T47D細(xì)胞株

    圖4 不同ERGF表達(dá)水平的細(xì)胞株BAG-1蛋白表達(dá)水平

    3 討論

    乳腺癌是臨床常見腫瘤,主要以女性為主,嚴(yán)重威脅女性的生活質(zhì)量及生命健康。隨著檢測方法的不斷發(fā)展,其檢出率在逐漸上升,并且早期乳腺癌的檢出率越來越高,為根治手術(shù)提供了可能。目前,臨床上根治乳腺癌的方法主要是手術(shù)治療,術(shù)后輔以化療以及內(nèi)分泌治療?;熑狈Π邢蛐裕涣挤磻?yīng)較嚴(yán)重,造成醫(yī)療資源的浪費,還可導(dǎo)致耐藥的發(fā)生,甚至產(chǎn)生不可逆的副作用,而導(dǎo)致治療失敗。目前學(xué)界的研究方向是試圖找到在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的分子,通過針對性的靶向治療,提高療效,降低不良反應(yīng)。目前乳腺癌靶向治療的靶點包括催乳素受體(PR)、雌激素受體(ER)、人類表皮受體(Her-2)等。目前針對PR、ER、Her-2的治療已經(jīng)實現(xiàn)了個體化治療,能夠顯著延長患者的無病生存期以及總生存率[7-9]。但是研究顯示,Herceptin單藥治療Her-2陽性的乳腺癌患者的有效率較低,僅為15%~30%[10]。這提示已經(jīng)明確的靶向治療的靶點外,還存在其他與靶點相互作用的分子,影響了靶向治療的效果。

    EGFR與Her-2均屬于表皮生長因子家族,根據(jù)結(jié)構(gòu)功能分為4種類型,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活。EGFR是一種跨膜蛋白,編碼的蛋白具有酪氨酸激酶活性[11-12]。EGFR分為細(xì)胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)以及細(xì)胞外區(qū)。細(xì)胞外由621個氨基酸殘基,是受體部位,跨膜區(qū)由23個氨基酸殘基,細(xì)胞內(nèi)分為近膜區(qū)與激酶區(qū)。轉(zhuǎn)化生長因子α、表皮生長因子、表皮素等配體與受體部位結(jié)合,相互作用,形成同源二聚體或者異源二聚體,跨膜區(qū)發(fā)生變化,激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶,其與ATP酶結(jié)合,發(fā)生自身磷酸化及轉(zhuǎn)磷酸化從而促使底物水平磷酸化,產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng),信息傳入細(xì)胞核,促進(jìn)腫瘤血管化形成及細(xì)胞增殖,甚至促進(jìn)腫瘤的局部浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[13-15]。EGFR在上皮性腫瘤存在高表達(dá),往往惡性程度高、預(yù)后差。本次研究結(jié)果顯示乳腺癌T47D細(xì)胞株和MDA-MB-231細(xì)胞株中EGFR mRNA以及EGFR蛋白呈現(xiàn)高表達(dá),尤其以T47D細(xì)胞株的表達(dá)最高。

    基底樣型乳腺癌不表達(dá)PR、ER和Her-2/neu,但是表達(dá)EGFR,對患者的預(yù)后具有預(yù)測作用。BLBC亞型缺乏具有針對性的靶點,容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),預(yù)后差。而將EGFR作為靶點可能是有效的治療途徑。EGFR的高表達(dá)與乳腺癌患者針對ER和PR的內(nèi)分泌治療的耐藥具有一定的相關(guān)性[16-18]。而在針對ER和PR的內(nèi)分泌治療中聯(lián)合吉非替尼可延緩耐藥情況的出現(xiàn)。EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑的耐藥機(jī)制可能包括EGFR發(fā)生突變、c-MET擴(kuò)增、Her-2突變、上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、PTEN信號通路作用、胰島素樣生長因子的表達(dá)、KRAS基因發(fā)生突變等。EGFR TK區(qū)發(fā)生突變影響吉非替尼的敏感性。EGFR第20號外顯子的突變與抑制TKIs作用降低有關(guān)。EGFR外顯子20 790密碼子的突變,與EGFR-TKI的耐藥有關(guān)。c-MET的擴(kuò)增依賴Her-3活化的PI3K信號通路。研究顯示,Her-2發(fā)生突變的患者對EGFR TKI耐藥,但對針對Her-2的靶向治療仍然敏感。去除Her-2后,對EGFRTKI的敏感性恢復(fù),說明Her-2的突變與EGFR的靶向治療耐藥有關(guān)。因此在臨床工作中可以考慮聯(lián)合抗Her家族抗體治療。PTEN通路能夠下調(diào)Akt基因,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PTEN功能喪失,Akt呈現(xiàn)過度表達(dá),導(dǎo)致抵抗凋亡,產(chǎn)生針對EGFR TKI的耐藥。胰島素樣生長因子-1的表達(dá)與吉非替尼的敏感性呈負(fù)相關(guān)。KRAS是EGFR信號通路的下游分子,其突變影響EGFR的靶向治療,是導(dǎo)致EGFR TKI的耐藥機(jī)制之一。

    BAG-1屬于抗凋亡基因,屬于共分子伴侶家族,其編碼的蛋白與細(xì)胞的多部位靶點結(jié)合,具有多種功能[19-20]。BAG-1 mRNA翻譯的起始點不同,獲得的亞型也不同,不同亞型在結(jié)構(gòu)、功能、細(xì)胞內(nèi)定位等均存在一定的差異。L亞型N端有定位信號,定位于細(xì)胞核,M亞型存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,BAG-1S與p29存在于細(xì)胞質(zhì)中。BAG-1的四個亞型均具有共同的C末端結(jié)構(gòu)域以及泛素樣結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)果對細(xì)胞維持生長發(fā)揮重要的作用。BAG結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)BAG-1和熱休克蛋白(HSP)發(fā)揮作用,恢復(fù)變性蛋白的作用。BAG的結(jié)構(gòu)域還與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相互作用介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)。BAG-1泛素樣結(jié)構(gòu)域在BAG-1蛋白酶復(fù)合物的形成過程中發(fā)揮重要的作用。BAG-1參與抑制細(xì)胞的凋亡以及應(yīng)激反應(yīng),其與不同分子位點結(jié)合而發(fā)揮抗凋亡的作用,其與熱休克蛋白結(jié)合可抑制因放療、化療、細(xì)胞表面死亡分子活化、熱休克等導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[21]。BAG-1屬于共分子伴侶家族成員,直接與分子伴侶HSP70以及HSC70結(jié)合,刺激ATP酶活性,改變HSP70與底物的親和力。BAG蛋白可直接激活RAF-1而傳遞細(xì)胞信號。其還在其他細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用。BAG-1可直接與配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子NHR結(jié)合,并調(diào)節(jié)其功能,影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性。BAG-1還可ER等結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。BAG-1可偶聯(lián)分子伴侶和蛋白酶復(fù)合體,調(diào)節(jié)蛋白折疊和降解平衡。BAG-1與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),其在正常的乳腺組織中并不表達(dá),但是在乳腺癌中卻可高表達(dá)。

    在本次研究中,EGFR(+)的乳腺癌細(xì)胞株BAG-1也存在高表達(dá),而EGFR(-)的乳腺癌細(xì)胞株中BAG-1也呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá),因此推測乳腺癌組織EGFR的表達(dá)與BAG-1的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。理論上BAG-1可以作為治療靶點,通過抑制BAG-1,從而降低其對細(xì)胞凋亡的抑制以及細(xì)胞核激素功能的調(diào)節(jié)作用,從而促使腫瘤細(xì)胞的凋亡,達(dá)到抑制腫瘤的目的。從本次研究結(jié)果也顯示BAG-1與EGFR具有一定的相關(guān)性,而EGFR是重要的靶向治療的靶點,如果將BAG-1作為靶向治療的靶點,可以達(dá)到降低患者耐藥的情況,獲得更好的治療效果。研究顯示,在腸癌中,BAG-1是EGFR的調(diào)節(jié)基因,位于EGFR啟動子部位的DNA復(fù)合物中,用siRNA降低BAG-1的表達(dá),可以顯著提高EGFR的表達(dá)水平,從而增加以EGFR為靶點抗癌藥物的治療效果[22]。有研究在乳腺癌發(fā)現(xiàn)BAG-1與EGFR的表達(dá)具有相關(guān)性,并且通過siRNA技術(shù)降低BAG-1水平,能夠升高EGFR水平,并且該項研究還比較干預(yù)前后細(xì)胞對針對EGFR靶向治療的吉非替尼藥物的治療耐受情況,結(jié)果顯示,干預(yù)后吉非替尼對細(xì)胞的抑制率顯著升高,這也提示,理論上將BAG-1作為靶向治療,降低乳腺癌小中BAG-1的表達(dá),從而升高EGFR的表達(dá),能夠提高靶向治療的效果[23]。

    綜上所述,BAG-1抑制細(xì)胞的凋亡,其表達(dá)與EGFR的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。EGFR陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株中BAG-1也呈現(xiàn)高表達(dá),提示BAG-1可以作為乳腺癌靶向治療耐藥的靶點。本研究因條件有限,對BAG-1與EGFR相互的作用機(jī)制沒有進(jìn)行進(jìn)一步研究,期望在今后的研究中能夠進(jìn)一步明確其相互作用的機(jī)制。

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    (收稿日期:2014-09-26 本文編輯:任 念)

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