基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討黨參防治免疫性血小板減少癥的分子機(jī)制

朱瑞芳 陳雨露 王倩 張珺 張淑文 呂亞茹 韓世范 王宏偉

Molecular mechanism of Codonopsis pilosula in the prevention and treatment of immune thrombocytopenia based on network pharmacology and molecular docking

ZHU Ruifang， CHEN Yulu， WANG Qian， ZHANG Jun， ZHANG Shuwen， LYU Yaru， HAN Shifan， WANG Hongwei

First Hospital of Shanxi Medical University， Shanxi 030001 China

Corresponding Author? WANG Hongwei， E?mail： wanghw68@hotmail.com; HAN Shifan， E?mail： shifan.han@sxmu.edu.cn

Abstract? Objective：To preliminarily elucidate the molecular mechanism of Codonopsis pilosula in the treatment of immune thrombocytopenia （ITP） through network pharmacology，differential gene analysis，and molecular docking.Methods：The main components and corresponding protein targets of Codonopsis pilosula were searched in the TCMSP，TCMID and ETCM.The targets of ITP were collected from the GeneCards，OMIM，and DisGeNET databases.A Venn diagram was constructed to obtain the intersection targets between the compound targets and disease targets，and the qualified targets were imported into the STRING database.The PPI network was constructed using Cytoscape 3.9.1.Subsequently，GO and KEGG enrichment analyses were performed on the intersection targets to explore the relevant signaling pathways of ITP and Codonopsis pilosula.Finally，molecular docking studies were conducted on the key targets and active compounds.Results：A total of 84 potential active compounds，2 354 ITP related targets，257 interaction targets，and 86 intersection targets of Codonopsis pilosula were collected.Through PPI network analysis，15 key targets were identified， with the top five targets ranked by Degree values including VEGFA，SRC，IL2，PPARG，and EGFR.GO and KEGG analyses indicated that Codonopsis's treatment of ITP mainly involves biological processes such as positive regulation of the ERK1 and ERK2 cascade，signal transduction，and protein phosphorylation.The signaling pathways mainly include the PI3K?AKT，cancer， and T?cell signaling pathways.Molecular docking results showed that SRC and PPARG exhibited high binding activity with 1?hydroxyrankinidine.Myristic acid，ethyl α?d?fructofuranoside，and glycitein are important active compounds and were verified through molecular docking simulations.Conclusion：This study clarifies from multiple perspectives that Codonopsis pilosula may exert therapeutic effects on ITP by regulating multiple targets and pathways，providing a scientific basis for further investigating the effects of Codonopsis pilosula on ITP.

Keywords?? ?immune thrombocytopenia； Codonopsis pilosula； network pharmacology； molecular docking； molecular mechanisms

摘要? 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、差異基因分析、分子對接方法初步闡明黨參治療免疫性血小板減少癥（ITP）的分子機(jī)制。方法：在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）、傳統(tǒng)中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）和中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM）中檢索黨參的主要成分和相應(yīng)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。在GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集ITP的靶點，構(gòu)建韋恩圖獲得復(fù)合靶標(biāo)和疾病的交集靶點，并將靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，使用Cytoscape3.9.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。接著對交集靶點進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，以探索ITP與黨參的相關(guān)信號通路，最后對關(guān)鍵靶點和活性化合物進(jìn)行分子對接研究。結(jié)果：共獲得黨參的84種潛在活性化合物、2 354個疾病靶點與257個藥物靶點，并得到86個交集靶點。通過蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）分析確定了15個關(guān)鍵靶點，Degree值排名前5位的靶點包括血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、Src原癌基因（SRC）、白細(xì)胞介素2（IL2）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARG）、表皮生長因子受體（EGFR）。GO和KEGG分析表明，黨參治療ITP主要涉及ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化等生物學(xué)過程，信號通路主要包括PI3K/Akt、癌癥通路、T細(xì)胞信號通路。分子對接結(jié)果表明，SRC、PPARG與11?hydroxyrankinidine具有較高的結(jié)合活性。肉豆蔻酸、乙基α?d果糖呋喃糖苷、黃豆黃素是重要的活性化合物并通過分子對接模擬進(jìn)行驗證。結(jié)論：本研究從多個角度闡明黨參可能通過調(diào)節(jié)多個靶點和多條途徑對ITP產(chǎn)生治療作用，可為進(jìn)一步深入研究黨參對ITP的作用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 免疫性血小板減少癥；黨參；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；分子機(jī)制

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.09.001

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，由于異常的T細(xì)胞反應(yīng)，特別是由脾濾泡輔助T細(xì)胞支持，刺激自身反應(yīng)性B細(xì)胞增殖和分化^[1]，其特征多以免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多與血小板生成減少為主^[2]，病人出現(xiàn)不同程度的出血傾向，并損害與健康相關(guān)的生活質(zhì)量^[3]。ITP的發(fā)病率為5/10萬～10/10萬，男女發(fā)病率相近，育齡期女性發(fā)病率高于同年齡段男性，60歲以上人群的發(fā)病率為60歲以下人群的2倍。近年來，關(guān)于ITP的發(fā)病機(jī)制研究擴(kuò)展至細(xì)胞免疫和血小板生成障礙方面，研究證實細(xì)胞免疫和抗血小板抗體介導(dǎo)巨核細(xì)胞質(zhì)量異常在ITP發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用^[4]。

黨參（Codonopsis pilosula）是桔?？浦参稂h參的干燥根^[5]，具有補(bǔ)氣、健脾、益肺及養(yǎng)血生津的功效^[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參多糖具有調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)胃腸道功能的作用^[7]。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是根據(jù)中藥成分、靶點和疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)識別小分子調(diào)節(jié)的系統(tǒng)方法。該方法集成了生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)^[8]，它在系統(tǒng)水平上闡明了中藥與疾病的復(fù)雜相互作用，符合中醫(yī)理論的整體和系統(tǒng)觀點。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門以系統(tǒng)生物學(xué)和多方向藥理學(xué)為基礎(chǔ)的新興學(xué)科，可以有效地實現(xiàn)藥物作用機(jī)制的預(yù)測性分析，識別新的藥物靶點，更好地解釋生物活性分子與細(xì)胞通路之間的相互作用機(jī)制。分子對接技術(shù)是現(xiàn)代化研究的有力工具，可以實現(xiàn)藥物的虛擬篩選^[9]。

1? 資料與方法

1.1 資料來源

分別在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）^[10]、傳統(tǒng)中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）^[11]、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM數(shù)據(jù)庫）^[12]中對黨參有效成分進(jìn)行檢索，隨后在小分子生物活性數(shù)據(jù)（PubChem）^[13]檢索成分的SMILES號或2D結(jié)構(gòu)，并將其輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選黨參活性成分及相關(guān)的潛在靶點。查閱相關(guān)資料后，本研究選擇口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%和藥物類藥性（drug?likeness，DL）>0.18為活性成分篩選條件。在TCMID數(shù)據(jù)庫中通過關(guān)鍵詞檢索共獲取有效成分187個。在ETCM數(shù)據(jù)庫中，以“DANG SHEN”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得64個黨參活性成分。將TCMID和ETCM數(shù)據(jù)庫中獲得的黨參有效成分輸入成分靶點數(shù)據(jù)庫（SWISS ADME）篩選。最后，整合3個數(shù)據(jù)庫中所得活性成分，利用PubChem數(shù)據(jù)庫將獲得的藥物黨參有效活性成分一一輸入，點擊SEARCH進(jìn)行檢索，從而檢索化合物標(biāo)準(zhǔn)名稱。去除無法找到的活性成分及非化學(xué)成分的物質(zhì)名稱并整合去重后，最終得到藥物黨參的活性成分共84個。

1.2 收集黨參活性成分對應(yīng)基因靶點

將靶基因輸入PubChem數(shù)據(jù)庫，根據(jù)成分的SMILES號或2D結(jié)構(gòu)在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中搜索，找到對應(yīng)的靶蛋白，并在UniProt數(shù)據(jù)庫^[14?15]中將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。篩選錄入排名前10位且probability>0的靶點，按照上述步驟收集黨參有效成分的靶點，共獲得728個靶點。在Excel表格中完成去重整理后，獲得黨參靶點共257個。

1.3 ITP靶點基因的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫 ^[16]、OMIM數(shù)據(jù)庫^[17]、DisGeNET數(shù)據(jù)庫^[18]中收集ITP的相關(guān)靶點。去除沒有靶標(biāo)的化學(xué)成分，刪除重復(fù)靶標(biāo)。在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）中對數(shù)據(jù)集GSE574進(jìn)行差異基因分析。將疾病?黨參基因靶點及藥物?ITP的基因靶點輸入韋恩作圖工具，構(gòu)建韋恩圖，并尋找黨參與ITP的交集靶點基因。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）的構(gòu)建

將黨參對ITP的有效靶點基因輸入STRING 數(shù)據(jù)庫中，在multiple proteins選項中限定物種為 “Homo sapiens”，獲得蛋白互作圖，在Cytoscape 3.9.1軟件中對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析^[19]，根據(jù)度值（Degree）大小繪制PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建藥物?黨參潛在化合物?潛在靶點基因可視化網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape3.9.1軟件中導(dǎo)入藥物潛在化合物及對應(yīng)靶點基因，進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建黨參化合物?靶點網(wǎng)絡(luò)圖并對交集靶點進(jìn)行排名。

1.6 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將共同靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）分別進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，P<0.05為閾值，篩選出前10位的生物過程和信號通路，并將結(jié)果收集整理繪圖。利用信息化通路分析單體成分作用于核心靶點的通路機(jī)制，探討相互作用。

1.7 分子對接

使用AutoDuck對PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree排名前6位的核心蛋白與對應(yīng)排名前5位的化合物進(jìn)行對接，初步驗證結(jié)合程度。1）配體準(zhǔn)備：在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載對應(yīng)化合物的3D結(jié)構(gòu)圖。在PyMOL中處理后將pdb格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。2）受體準(zhǔn)備：將靶點基因在PDB數(shù)據(jù)庫^[1]中將篩選條件設(shè)置為pH 6.5～7.5，分辨率≤2.5，種類為“人類”，獲取合適的靶點蛋白結(jié)構(gòu)的sdf格式文件，在Open babel GUI中將SDF格式轉(zhuǎn)化為pdb格式，導(dǎo)入PyMOL中去除雜質(zhì)后，在AutoDock軟件中去水加氫處理后，轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。3）對接：利用AutoDock vina依次將潛在化合物成分與關(guān)鍵靶點蛋白進(jìn)行分子對接并獲得對接分?jǐn)?shù)。

2? 結(jié)果

2.1 篩選黨參活性成分及收集基因靶點

從TCMP、TCMID和ETCM數(shù)據(jù)庫中檢索黨參有效活性成分，經(jīng)過匯總?cè)ブ睾?，最終得到84個有效成分。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索TCMID及ETCM獲得的相應(yīng)靶點，得到黨參作用靶點257個有效化學(xué)成分，包括黃酮類、甾體類、生物堿類、糖苷類、三萜類等。

2.2 ITP靶點篩選

在GeneCards、OMIM、DisGeNET 及GEO數(shù)據(jù)庫收集ITP靶點。由于GeneCards數(shù)據(jù)庫靶點與疾病關(guān)系越密切對應(yīng)的Relevance score值越高，因此，從結(jié)果中留取 Relevance score值≥2倍中位數(shù)（即≥4.69）的靶點作為ITP潛在基因靶點，共獲得1 117個靶點。在OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得106個靶點。在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中檢索獲得186個靶點。將3個數(shù)據(jù)庫所得靶點去重整合得到ITP靶點1 334個靶點。

在GEO數(shù)據(jù)庫中對GSE574數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)集包含6組樣本，分為健康對照組、活動性ITP病人組和緩解中ITP病人組3組。利用R軟件對3組進(jìn)行兩兩比較，并對3組樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析。對3組DEGs設(shè)置篩選條件為P<0.05、|logFC|>3，共得到1 846個差異基因，其中上調(diào)基因998個、下調(diào)基因848個。使用R4.1.2軟件繪制熱圖（見圖1）。將GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫及GEO數(shù)據(jù)庫收集ITP靶點整合去重后，獲得ITP靶點2 354個。

2.3 藥物?活性成分?疾病的交集靶點

將2 354個疾病靶點與257個藥物靶點導(dǎo)入并取交集繪制韋恩圖，并得到86個交集靶點（見圖2）。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

2.4.1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建可視化分析

將獲得的86個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫對蛋白關(guān)系進(jìn)行可視化分析，并在Cytoscape 3.9.1 軟件對Degree值進(jìn)行計算分析，繪制PPI關(guān)系圖，去除無關(guān)聯(lián)的節(jié)點后有83個節(jié)點及498條邊。其中節(jié)點大小及顏色深淺與Degree值呈正相關(guān)，且蛋白間相關(guān)性越強(qiáng)則邊顏色越深，邊的顏色深淺與粗細(xì)與Degree值亦呈正相關(guān)（見圖3）。Degree值排名由高到低依次為血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、Src原癌基因（Src proto?oncogene，SRC）、白細(xì)胞介素2（interleukin?2，IL2）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferator?activated receptor gamma，PPARG）、表皮生長因子受體

（epidermal growth factor receptor，EGFR）、熱休克蛋白90 kDa α亞類1（heat shock protein 90 kDa alpha，class A member 1，HSP90AA1）、低氧誘導(dǎo)因子1α亞單位（hypoxia?inducible factor 1，alpha subunit，HIF1A）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin?endoperoxide synthase 2，PTGS2）、Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）、Fas相關(guān)因子2（fas?associated factor 2，F(xiàn)OF2）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen?activated protein kinase 14，MAPK14）、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1），見圖4。VEGFA是一種血管內(nèi)皮因子A，與血管的通透性、血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖及血管形成相關(guān)^[20]。

使用插件按照Degree、最大團(tuán)中心性（MCC）、邊緣滲透成分（EPC）、最大鄰域分量（MNC）和最大鄰域分量密度（DMNC）5種方法分別將排名前15位的基因進(jìn)行篩選和重疊，認(rèn)為重疊基因為樞紐基因。繪制Venn圖可視化后得到核心靶點為5個方法重疊基因是VCAM1，Degree/MCC/MNC/EPC 4個方法的共同基因（次核心靶點）有VEGFA、SRC、PTGS2、PPARG、EGFR、HIF1A、HSP90AA1、IL2、ERBB2、NOS3、ICAM1、FGF2。見圖5。

2.4.2 黨參?有效成分?治療靶點可視化分析

將藥物潛在化合物及對應(yīng)靶點基因?qū)隒ytoscape 3.9.1 軟件中，繪制藥物?有效成分?治療靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖6），顏色深淺、節(jié)點大小與Degree值呈正相關(guān)。通過“黨參?有效成分?治療靶點”的網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)1個化合物可能對應(yīng)1個或多個靶點，核心靶點VCAM1對應(yīng)的靶點為血管細(xì)胞黏附蛋白1（Vascular cell adhesion protein 1），對應(yīng)的化合物為肉豆蔻酸（myristicacid）。次核心靶點（VEGFA、SRC、PTGS2、PPARG、EGFR、HIF1A、HSP90AA1、IL2、PERBB2、NOS3、ICAM1、FGF2）對應(yīng)的化學(xué)成分是：VEGFA和FGF2對應(yīng)化合物是乙基α?d果糖呋喃糖苷（ethyl?alpha?d?fructofuranoside），SRC 對應(yīng)化合物是11?羥基蘭金斷腸草堿（11?Hydroxyrankinidine），PTGS2和PPARG對應(yīng)的化合物是二十二烯酸甲酯 11，14 二烯酸酯（methyl icosa?11，14?dienoate），EGFR和IL2 對應(yīng)的化合物是黃豆黃素（glycitein），PERBB2對應(yīng)化合物是脲基甲酸丁酯（N?butyl allophanate），HSP90AA1對應(yīng)的化合物是5?甲氧基甲基糠醛（5?methoxymethyl furfural），HIF1A 對應(yīng)的化合物是DL?丁香樹脂酚（dl?syringaresinol），NOS3對應(yīng)的化合物是吡啶（pyridine），ICAM1對應(yīng)的化合物是肉豆蔻酸。在查閱文獻(xiàn)后在4個方法的重疊基因中選擇5個關(guān)鍵靶點合并與5個方法的重疊基因（VCAM1）后，匹配相應(yīng)的化合物，這些成分可能為黨參治療ITP網(wǎng)絡(luò)中的重要成分。

2.5 GO富集分析結(jié)果

通過GO 富集分析結(jié)果初步檢驗篩選的黨參靶點與ITP的相關(guān)性。GO富集分析主要包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）及分子功能（MF）3個方面，圖中的顏色越深代表著顯著性越強(qiáng)。柱狀圖中依據(jù)顯著性分別按照BP、CC及MF的順序?qū)Ω患Y(jié)果進(jìn)行排列，橫坐標(biāo)表示富集的基因數(shù)目，縱坐標(biāo)為富集結(jié)果名稱。BP富集結(jié)果可知，靶點主要生物過程包括對藥物的反應(yīng)（response to drug）、脂多糖的反應(yīng)（response to lipopaolysaccharide）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)控（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控（intracellular signal transductionpositive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation）、基因表達(dá)的正向調(diào)控（positive regulation of gene expression）、細(xì)胞分化（cell differentiation）。CC富集結(jié)果可知，靶點組成成分包括等離子體膜（plasma membrane）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、質(zhì)膜的組成部分（integral component of plasma membrane）、胞質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞膜（membrane）、細(xì)胞外的外來體（extracellular exosome）、細(xì)胞核（nucleus）、細(xì)胞外空間膜的組成部分（extracellular space integral component of membrane）、核漿（nucleoplasm）。MF富集結(jié)果可知，主要靶點功能包括蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosinekinases activity）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、蛋白激酶活性（protein kinases activity）、蛋白同二聚體活性（protein homodimerization activity）、ATP結(jié)合（ATP binding）、蛋白結(jié)合（protein binding）、鋅離子結(jié)合（zincion binding）、金屬離子結(jié)合（metal ion binding）。詳見圖7。

2.6 KEGG富集分析結(jié)果

KEGG主要對靶點相關(guān)通路進(jìn)行分析。在DAVID數(shù)據(jù)庫中，顯示靶點參與135條KEGG通路，并將Count排名前20條做KEGG富集分析，靶點相關(guān)通路包括：EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、化學(xué)致癌?受體激活（chemical carcinogenesis?receptor activation）、癌癥通路（pathways in cancer）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma?associated herpesvirus infection）、AGE?RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用（AGE?RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、PD?L1在癌癥中的表達(dá)及PD?1檢查點通路（PD?L1 expression and PD?1 checkpoint pathway in cancer）、松弛蛋白信號通路（relaxin signaling pathway）、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、內(nèi)分泌的阻力（endocrine resistance）、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)（inflammatory mediator regulation of TRP channels）、PI3K/Akt 信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）、人類巨細(xì)胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、黏著斑（focal adhesion）、Rap1信號通路（rap1 signaling pathway）、神經(jīng)活性配體?受體相互作用（neuroactive ligand?receptor interaction）、代謝途徑（metabolic pathways）。詳見圖8。

2.7 分子對接驗證

將關(guān)鍵靶點基因（VCAM1、VEGFA、SRC、IL2、PPARG、H1F1A）與對應(yīng)排名前5位化合物（ethyl?alpha?d?fructofuranoside、11?hydroxyrankinidine、glycitein、methyl icosa?11，14?dienoate、5?methoxymethyl furfural、dl?syringaresinol、myristicacid、emodin）進(jìn)行分子對接。自由結(jié)合能是判斷藥物分子與靶蛋白結(jié)合是否緊密的主要條件，氫鍵可以顯示藥物分子與靶蛋白哪些氨基酸殘基之間存在相互作用。自由結(jié)合能絕對值越大則說明對接越緊密，效果越好。一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的藥物分子與靶點具有較好的結(jié)合活性。RMSD值<2則說明分子對接結(jié)果比較可靠。圖中藍(lán)色為化合物，綠色為靶點基因，黃色為殘基與靶點基因形成的氫鍵。其中，SRC、PPARG與11?hydroxyrankinidine具有較高的結(jié)合活性。詳見表1及圖9。

3? 討論

本研究的主要目的是探討黨參治療免疫性血小板減少癥的潛在機(jī)制。通過檢索TCMSP、TCMID、ETCM數(shù)據(jù)庫共收集到84種化學(xué)成分，其中主要化學(xué)成分包括肉豆蔻酸、黃豆黃素、乙基α?d果糖呋喃糖苷，這些主要化學(xué)成分可以與其他活性成分一起作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個靶標(biāo)。在GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集ITP的相關(guān)靶點。根據(jù)STRING構(gòu)建的PPI互作圖可視化分析后，得到關(guān)鍵靶點VCAM1、VEGFA、SRC、PPARG、HIF1A和IL2。

本研究生物分子功能表明，黨參的關(guān)鍵活性成分治療免疫性血小板疾病的靶點主要參與在對藥物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、ERK1和ERK2級聯(lián)的正向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）等，并在蛋白結(jié)合、等離子體膜、細(xì)胞質(zhì)等部位中分布較多。BP富集分析可知，生物過程與細(xì)胞分化相關(guān)，酪氨酸殘基上的蛋白質(zhì)磷酸化（PTP）對正常細(xì)胞信號傳導(dǎo)至關(guān)重要，由于藥物刺激、脂多糖、驗證而導(dǎo)致細(xì)胞或有機(jī)體狀態(tài)或活動（運(yùn)動、分泌、酶產(chǎn)生、基因表達(dá)等）改變，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活或增加由ERK1和ERK2級聯(lián)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率、速率或程度。CC富集分析可知，靶點主要包含離子膜及細(xì)胞相關(guān)組成部分（細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等）。MF富集分析可知，主要靶點功能與催化活性的酶結(jié)合以及與ITP、離子和蛋白結(jié)合有關(guān)。通過KEGG富集分析，對這 20 條通路中與ITP關(guān)系較為密切的通路，即磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶B（PI3K?Akt）信號通路和T細(xì)胞反應(yīng)信號通路核因子?kappaB（NF?κB）信號通路進(jìn)行分析。PI3K/Akt 信號通路是一個重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路，它可以參與細(xì)胞的生長、增殖、分化和遷移^[21]。2023年，Ruan等^[22]在ITP病人中發(fā)現(xiàn)了幾個含有過量罕見破壞性突變的基因：含五聚體結(jié)構(gòu)域蛋白3（PTEN）、胰島素受體（INSR）和凝血因子C同源性（COCH）。有趣的是，這些基因共同參與了PI3K/Akt信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在血小板活化中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

NF?κB異常激活與自身免疫疾病相關(guān)，持續(xù)性激活的NF?κB能增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因的轉(zhuǎn)錄^[23]。T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Tregs）有助于維持外周免疫耐受性，其缺陷被認(rèn)為在各種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起作用。在成人和兒童ITP病人中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，Tregs在循環(huán)、骨髓和脾臟中的頻率降低，Tregs功能受損^[24]。通過地塞米松、利妥昔單抗或血小板生成素受體激動劑治療，血小板計數(shù)恢復(fù)后，Tregs失調(diào)得到改善。此外，Tregs在防止抗血小板自身免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用已在缺乏功能性Tregs的小鼠中得到證實。在Tregs缺陷的小鼠中觀察到的血小板減少是通過產(chǎn)生IgG抗血小板自身抗體介導(dǎo)的，這與人類ITP類似。進(jìn)一步研究評估ITP病人Tregs失調(diào)的機(jī)制是必要的，以闡明ITP的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略，抑制抗血小板自身免疫反應(yīng)^[25]。

IL2是抗腫瘤效應(yīng)的重要因子，由T細(xì)胞在抗原或有絲分裂刺激下產(chǎn)生，是T細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的其他重要活動所必需的，可激活多種效應(yīng)細(xì)胞如細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和先天淋巴樣細(xì)胞等^[26]。研究已證實，IL?2具有維持Tregs細(xì)胞控制免疫反應(yīng)，促進(jìn)Foxp3+Tregs細(xì)胞的生成、存活和功能活性，刺激傳統(tǒng)T細(xì)胞促進(jìn)免疫反應(yīng)的功能^[27]。

VEGF家族由6種生長因子（VEGFA?F）組成，通過與其受體VEGFR1?3和神經(jīng)菌素結(jié)合，在血管生成中起著最關(guān)鍵的作用^[20]。VEGFA是引導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵因子，血管生成過程中VEGFA的主要調(diào)節(jié)因子是缺氧誘導(dǎo)因子1。血管生成因子通過直接抑制抗原提呈細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞或通過增強(qiáng)Tregs、髓系源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的作用來驅(qū)動免疫抑制^[28]。PI3K是血管生成的重要調(diào)控因子，VEGFA通過多種途徑激活PI3K，包括FAK、Shb、Gab1、IQGAP1和TSAd/Src/Axl，以及通過VEGFR2中PI3K的pY1175直接結(jié)合。PI3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)下游信號分子的激活，在體內(nèi)、外調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥因子的釋放中起著關(guān)鍵作用^[29]。

黃豆黃素（glycitein）是一種o ?甲基化異黃酮，占大豆食品中總異黃酮的5%～10%^[30]。食用異黃酮可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）和NF?κB信號通路^[31]。其誘導(dǎo)的ERK1/2激活部分依賴于與血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）相關(guān)的酪氨酸激酶活性^[32]。

肉豆蔻化是指將肉豆蔻酸附著在蛋白質(zhì)的N端甘氨酸上，并對其細(xì)胞內(nèi)的定位和功能產(chǎn)生重大影響，胸腺代表了一個具有突出的N?肉豆蔻化活動的器官^[33]。小鼠實驗證明N?肉豆蔻化對于早期和遠(yuǎn)端TCR信號事件如CD3ζ、Zap70和Erk的激活以及細(xì)胞因子如干擾素?γ（IFN?γ）和IL?2的釋放也是不可缺少的。N?肉豆蔻轉(zhuǎn)移酶（Nmt）耗盡會影響T細(xì)胞受體（TCR）信號級聯(lián)的啟動和傳播。蛋白質(zhì)的肉豆蔻化在T細(xì)胞的發(fā)育和激活中是不可缺少的，對它的抑制可能提供一種新的策略來實現(xiàn)免疫抑制^[34]。HIV?1 Nef（Nef）是一種肉豆蔻化的蛋白質(zhì)對TCR的信號傳導(dǎo)有調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致受刺激的T細(xì)胞中IL?2的產(chǎn)生上調(diào)作用。肉豆蔻化的、筏定位的Nef通過增加筏內(nèi)信號分子的水平為靜止的T細(xì)胞提供激活的動力，并且TCR的激活通過Nef促進(jìn)筏融合的能力得到加強(qiáng)^[35]。

據(jù)推測，黨參對ITP的治療作用可能是通過黨參中有效成分黃豆黃素、乙基α?d果糖呋喃糖苷通過PI3K/Akt通路IL2靶點對Tregs起到調(diào)節(jié)作用，并對NF?κB通路的抑制作用，最終對ITP起到緩解作用。

4? 小結(jié)

黨參對ITP作用機(jī)制復(fù)雜、作用成分多，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，其作用機(jī)制可能為黃豆黃素、乙基α?d果糖呋喃糖苷、肉豆蔻酸等主要成分通過作用于IL2、VEGFA等核心靶點影響PI3K/Akt、NF?κB等相關(guān)通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分化、酪氨酸殘基上的蛋白質(zhì)磷酸化（PTP）對正常細(xì)胞信號傳導(dǎo)等生物過程，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、催化活性的酶結(jié)合、ITP/離子和蛋白結(jié)合及血管的生成與重塑等，從而實現(xiàn)對ITP的干預(yù)。本研究基于差異基因分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接并查閱文獻(xiàn)后進(jìn)一步提出推測：黨參有效成分黃豆黃素、乙基α?d果糖呋喃糖苷通過PI3K/Akt通路IL2靶點對Treg/Th17平衡模式起到調(diào)節(jié)作用，并對NF?κB通路的抑制作用，最終對ITP起到緩解作用。課題組將會以此為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步體內(nèi)外實驗驗證。此外，本研究存在以下局限性。首先，黨參對抗ITP的潛在機(jī)制涉及多種藥理作用，需要更多的研究來結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等高通量檢測技術(shù)來揭示復(fù)雜的協(xié)同機(jī)制。其次，本研究中沒有解釋活性成分對功效的貢獻(xiàn)以及活性成分之間的協(xié)同作用，將在這方面進(jìn)行進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1]? AUDIA S，MAH?VAS M，SAMSON M，et al.Pathogenesis of immune thrombocytopenia[J].Autoimmunity Reviews，2017，16（6）：620-632.

[2]? 李曉靖，鮑計章，朱文偉，等.中醫(yī)藥治療原發(fā)免疫性血小板減少癥免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2021，50（12）：25-28;59.

LI X J，BAO J Z，ZHU W W，et al.Research progress on the regulation of immune cells in the treatment of primary immune thrombocytopenia with traditional Chinese medicine[J].Journal of Medical Research，2021，50（12）：25-28;59.

[3]? CUKER A，CINES D B，NEUNERT C E.Controversies in the treatment of immune thrombocytopenia[J].Current Opinion in Hematology，2016，23（5）：479-485.

[4]? 王兆鉞.免疫性血小板減少性紫癜的發(fā)病機(jī)制與臨床研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2009，25（12）：1141-1144.

WANG Z Y.Advances in pathogenetic and clinical research of immune thrombocytopenic purpura[J].Chinese Journal of Immunology，2009，25（12）：1141-1144.

[5]? 吉姣姣，戴俊利，李建寬，等.黨參不同組織化學(xué)成分分布及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2023，29（18）：117-125.

JI J J，DAI J L，LI J K，et al.Chemical components distribution and transcriptome analysis of different tissues from Codonopsis pilosula[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2023，29（18）：117-125.

[6]? LUAN F，JI Y F，PENG L X，et al.Extraction，purification，structural characteristics and biological properties of the polysaccharides from Codonopsis pilosula：a review[J].Carbohydrate Polymers，2021，261：117863.

[7]? 涂春蕾，廖樹偉.土黨參的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].藥品評價，2022，19（16）：1022-1024.

TU C L，LIAO S W.Advances in chemical constituents and pharmacological action from roots of Campanumoea javanica[J].Drug Evaluation，2022，19（16）：1022-1024.

[8]? JIASHUO W U，ZHANG F Q，ZHUANGZHUANG L I，et al.Integration strategy of network pharmacology in traditional Chinese medicine：a narrative review[J].Journal of Traditional Chinese Medicine，2022，42（3）：479-486.

[9]? ZHANG B H，LI H，YU K Q，et al.Molecular docking-based computational platform for high-throughput virtual screening[J].CCF Transactions on High Performance Computing，2022，4（1）：63-74.

[10]? RU J L，LI P，WANG J N，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].Journal of Cheminformatics，2014，6（1）：13.

[11]? HUANG L，XIE D L，YU Y R，et al.TCMID 2.0：a comprehensive resource for TCM[J].Nucleic Acids Research，2018，46（D1）：D1117-D1120.

[12]? XU H Y，ZHANG Y Q，LIU Z M，et al.ETCM：an encyclopaedia of traditional Chinese medicine[J].Nucleic Acids Research，2019，47（D1）：D976-D982.

[13]? KIM S.Getting the most out of PubChem for virtual screening[J].Expert Opinion on Drug Discovery，2016，11（9）：843-855.

[14]? CONSORTIUM U.UniProt：the universal protein knowledgebase in 2021[J].Nucleic Acids Research，2021，49（D1）：D480-D489.

[15]? WANG Y，ZHANG Y W，WANG Y J，et al.Using network pharmacology and molecular docking to explore the mechanism of Shan Ci Gu （Cremastra Appendiculata） against non-small cell lung cancer[J].Frontiers in Chemistry，2021，9：682862.

[16]? STELZER G，ROSEN N，PLASCHKES I，et al.The GeneCards suite：from gene data mining to disease genome sequence analyses[J].Current Protocols in Bioinformatics，2016，54（1）：123.

[17]? AMBERGER J S，HAMOSH A.Searching Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）：a knowledge base of human genes and genetic phenotypes[J].Current Protocols in Bioinformatics，2017，58（1）：D514-D517.

[18]? PI?ERO J，BRAVO ?，QUERALT-ROSINACH N，et al.DisGeNET：a comprehensive platform integrating information on human disease-associated genes and variants[J].Nucleic Acids Research，2017，45（D1）：D833-D839.

[19]? BISHT A，TEWARI D，KUMAR S，et al.Network pharmacology，molecular docking，and molecular dynamics simulation to elucidate the mechanism of anti-aging action of Tinospora cordifolia[J].Molecular Diversity，2023.doi： 10.1007/s11030-023-10684-w.

[20]? CLAESSON-WELSH L，WELSH M.VEGFA and tumour angiogenesis[J].Journal of Internal Medicine，2013，273（2）：114-127.

[21]? ERSAHIN T，TUNCBAG N，CETIN-ATALAY R.The PI3K/AKT/mTOR interactive pathway[J].Molecular BioSystems，2015，11（7）：1946-1954.

[22]? RUAN J S，SUN R J，WANG J P，et al.Gene mutations in the PI3K/Akt signaling pathway were related to immune thrombocytopenia pathogenesis[J].Medicine，2023，102（7）：e32947.

[23]? QUE W C，WU Z Y，CHEN M H，et al.Molecular mechanism of Gelsemium elegans （gardner and champ） Benth against neuropathic pain based on network pharmacology and experimental evidence[J].Frontiers in Pharmacology，2022，12：792932.

[24]? SEMPLE J W，REBETZ J，MAOUIA A，et al.An update on the pathophysiology of immune thrombocytopenia[J].Current Opinion in Hematology，2020，27（6）：423-429.

[25]? NISHIMOTO T，KUWANA M.CD₄⁺CD₂₅⁺Foxp3+ regulatory T cells in the pathophysiology of immune thrombocytopenia[J].Seminars in Hematology，2013，50（Suppl 1）：S43-S49.

[26]? SPOLSKI R，LI P，LEONARD W J.Biology and regulation of IL-2：from molecular mechanisms to human therapy[J].Nature Reviews Immunology，2018，18：648-659.

[27]? NIE J，LI Y Y，ZHENG S G，et al.FOXP3⁺Treg cells and gender bias in autoimmune diseases[J].Frontiers in Immunology，2015，6：493.

[28]? RAHMA O E，HODI F S.The Intersection between tumor angiogenesis and immune suppression [J].Clin Cancer Res，2019，25（18）：5449-5457.

[29]? XU P，WANG J，YANG Z W，et al.Regulatory roles of the PI3K/Akt signaling pathway in rats with severe acute pancreatitis[J].PLoS One，2013，8（11）：e81767.

[30]? ZHANG B，SU J P，BAI Y，et al.Inhibitory effects of O-methylated isoflavone glycitein on human breast cancer SKBR-3 cells[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（7）：7809-7817.

[31]? ZANG Y Q，F(xiàn)ENG Y Y，LUO Y H，et al.Glycitein induces reactive oxygen species-dependent apoptosis and G0/G1 cell cycle arrest through the MAPK/STAT3/NF-κB pathway in human gastric cancer cells[J].Drug Dev Res，2019，80（5）：573-584.

[32]? CLUBBS E A，BOMSER J A.Glycitein activates extracellular signal-regulated kinase via vascular endothelial growth factor receptor signaling in nontumorigenic （RWPE-1） prostate epithelial cells [J].J Nutr Biochem，2007，18（8）：525-532.

[33]? RIOUX V，P?DRONO F，LEGRAND P.Regulation of mammalian desaturases by myristic acid：N-terminal myristoylation and other modulations[J].Biochim Biophys Acta，2011，1811（1）：1-8.

[34]? RAMPOLDI F，BONROUHI M，BOEHM M E，et al.Immunosuppression and aberrant T cell development in the absence of N-myristoylation[J].J Immunol，2015，195（9）：4228-4243.

[35]? DJORDJEVIC J T，SCHIBECI S D，STEWART G J，et al.HIV type 1 Nef increases the association of T cell receptor（TCR）-signaling molecules with T cell rafts and promotes activation-induced raft fusion[J].AIDS Res Hum Retroviruses，2004，20（5）：547-555.

（收稿日期：2024-03-29；修回日期：2024-04-20）

（本文編輯 崔曉芳）