響應(yīng)面分析優(yōu)化晉西北酸粥和糜米總酚的提取工藝

王琪 彭佳偉

摘要：以總酚提取量為指標(biāo)，研究自然發(fā)酵的晉西北酸粥和其原材料糜米中總酚的最佳提取工藝，采用福林酚比色法測定總酚提取量。比較不同的單因素對晉西北酸粥和糜米中總酚提取量的影響。在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析，探討不同丙酮濃度、料液比、提取時間和提取溫度對總酚提取量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晉西北酸粥中總酚的最佳提取條件為丙酮濃度58.06%、料液比1∶41.13、提取時間30.57 min和提取溫度41.81 ℃，在此條件下總酚的最大提取量為1.88 mg/g。糜米中總酚的最佳提取條件為丙酮濃度84.78%、料液比1∶44.76、提取時間34.34 min、提取溫度42.11 ℃，在此條件下總酚的最大提取量為1.51 mg/g，而且晉西北酸粥中總酚提取量約是糜米中總酚提取量的1.24倍。

關(guān)鍵詞：晉西北酸粥；糜米；總酚；響應(yīng)面實驗優(yōu)化

中圖分類號：TS201.2 ?????文獻標(biāo)志碼：A ????文章編號：1000-9973（2024）04-0127-07

Optimization of Extraction Process of Total Phenols from Sour Porridge in

Northwestern Shanxi and Milled Nonglutinous Broomcorn Millet

by Response Surface Analysis

WANG Qi， PENG Jia-wei

（School of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030031， China）

Abstract： The optimal extraction process of total phenols from naturally fermented sour porridge in northwestern Shanxi and its raw material milled nonglutinous broomcorn millet is studied with the extraction amount of total phenols as the index， and the extraction amount of total phenols is determined by Folin-Ciocalteu colorimetry. The effects of different single factors on the extraction amount of total phenols from sour porridge in northwestern Shanxi and milled nonglutinous broomcorn millet are compared. On this basis， the effects of different acetone concentrations， solid-liquid ratios， extraction time and extraction temperatures on the extraction amount of total phenols are ?investigated by response surface analysis. The results show that the optimal extraction conditions of total phenols from sour porridge in northwestern Shanxi are as follows： acetone concentration is 58.06%， solid-liquid ratio is 1∶41.13， extraction time is 30.57 min and extraction temperature is 41.81 ℃.Under these conditions， the maximum extraction amount of total phenols is 1.88 mg/g.The optimal extraction conditions of total phenols from milled nonglutinous broomcorn millet are as follows： acetone concentration is 84.78%， solid-liquid ratio is 1∶44.76， extraction time is 34.34 min and extraction temperature is 42.11 ℃. Under these conditions， the maximum extraction amount of total phenols is 1.51 mg/g， and the extraction amount of total phenols from sour porridge in northwestern Shanxi is about 1.24 times that of milled nonglutinous broomcorn millet.

Key words： sour porridge in northwestern Shanxi; milled nonglutinous broomcorn millet; total phenols; optimization by response surface analysis

收稿日期：2023-12-13

基金項目：山西省自然科學(xué)基金面上項目（20210302123464）

作者簡介：王琪（1982—），女，山西忻州人，講師，博士，研究方向：微生物與功能食品。

糜米是北方地區(qū)的一種糧食，是糜子經(jīng)脫殼加工成的初加工產(chǎn)品，不僅營養(yǎng)價值高，而且有一定的藥用價值，是我國的傳統(tǒng)中藥材之一[1-2]。晉西北酸粥以糜米為原料，經(jīng)室溫自然發(fā)酵而成，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值很高，因此深受當(dāng)?shù)厝藗兊南矏?，在晉西北等地已成為主食之一[3]。有研究表明，以谷物為原料的食物中含有大量的多酚類化合物[4-7]，提高谷物中總多酚含量的有效方法之一是發(fā)酵[8]。截至目前，關(guān)于糜米發(fā)酵得到的晉西北酸粥和原料糜米中總酚含量的研究較少。

響應(yīng)面分析（response surface analysis）是將數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計方法有機地結(jié)合在一起，可以建模和分析響應(yīng)值受多個變量影響的問題，并最終對響應(yīng)值進行優(yōu)化的方法。它利用較少的實驗量和時間對實驗進行綜合研究來解決多變量問題，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系[9-10]。

本實驗根據(jù)Box-Behnken設(shè)計，在晉西北酸粥和糜米總酚提取工藝中，研究提取溶劑濃度、料液比、提取時間和提取溫度及其交互作用對總酚提取量的影響。該結(jié)果不僅可以為提高晉西北酸粥的營養(yǎng)價值提供理論依據(jù)，而且可以為谷物發(fā)酵功能食品的開發(fā)提供參考思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸、福林酚（Folin-Ciocalteu）、無水乙醇、甲醇、丙酮和無水碳酸鈉：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SCJ-20型真空抽濾泵 上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機、SB-5200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZQTY-70振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 樣品的制備

樣品：糜米和糜米自然發(fā)酵后的晉西北酸粥均來自忻州市河曲縣。將樣品于50 ℃烘干、粉碎，過40目篩。每個樣品重復(fù)測定3個。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[11]

將干燥至恒重的沒食子酸10 mg用蒸餾水溶解，定容至50 mL，保存于棕色容量瓶中，即為標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg/mL）。將其依次稀釋成0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL梯度的稀釋液。

取0.8 mL各梯度稀釋液，分別與5.6 mL蒸餾水和0.4 mL福林酚試劑混勻。室溫下靜置6～8 min后再加入飽和碳酸鈉溶液1.2 mL，混勻。暗處靜置2 h后測定其在760 nm處的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。調(diào)零管用蒸餾水代替樣品。

1.5 實驗方法

1.5.1 不同提取方法對總酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取晉西北酸粥和糜米樣品各0.5 g，按料液比1∶40加入80%乙醇后，分別用以下3種方法提取樣品中的總酚：振蕩提?。?7 ℃、150 r/min、2 d）、超聲波清洗機提取（25 ℃、50 kHz、50 min）和超聲波細胞粉碎機提?。?5 kHz、超聲1 s停1 s、50 min）真空抽濾提取后的樣品，濾液用80%乙醇定容至25 mL。采用福林酚法測定樣品中總酚的提取量。

1.5.2 單因素實驗

1.5.2.1 不同提取溶劑對總酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取晉西北酸粥和糜米樣品各0.5 g，按料液比1∶40分別加入80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮、蒸餾水和乙酸乙酯中，旋渦混勻。用超聲波清洗機（50 kHz、37 ℃、50 min）提取樣品中的總酚。提取結(jié)束后抽濾，定容至25 mL，測定總酚提取量。

1.5.2.2 不同濃度提取溶劑對總酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取晉西北酸粥和糜米樣品各0.5 g，按料液比1∶40分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%的丙酮中，旋渦混勻。用超聲波清洗機（50 kHz、37 ℃、50 min）提取樣品中的總酚。提取結(jié)束后抽濾，定容至25 mL，測定總酚提取量。

1.5.2.3 不同料液比對總酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取晉西北酸粥和糜米樣品各0.5 g，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50向酸粥中加入60%丙酮，旋渦混勻；向糜米中加入80%丙酮，旋渦混勻。用超聲波清洗機（50 kHz、37 ℃、50 min）提取樣品中的總酚。提取結(jié)束后抽濾，定容至25 mL，測定總酚提取量。

1.5.2.4 不同提取時間對總酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取晉西北酸粥和糜米樣品各0.5 g，按料液比1∶50向酸粥中加入60%丙酮，向糜米中加入80%丙酮，旋渦混勻。用超聲波清洗機（50 kHz、37 ℃）分別提取10，20，30，40，50 min。提取結(jié)束后抽濾，定容至25 mL，測定總酚提取量。

1.5.2.5 不同提取溫度對總酚提取量的影響

準(zhǔn)確稱取晉西北酸粥和糜米樣品各0.5 g，按料液比1∶50向酸粥中加入60%丙酮，向糜米中加入80%丙酮，旋渦混勻。用超聲波清洗機（50 kHz、50 min）分別于20，30，40，50，60 ℃下提取樣品中的總酚。提取結(jié)束后抽濾，定容至25 mL，測定總酚提取量。

1.5.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化晉西北酸粥和糜米中總酚的提取工藝

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken Design方法[13]，以丙酮濃度、提取溫度、料液比和提取時間為實驗因素，以總酚提取量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析，因素和水平見表1和表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總酚提取量，公式如下：

總酚提取量（mg/g）=（y-0.003 9）×50×1008.972 9×m×n。

式中：y表示吸光度；m表示樣品的質(zhì)量（g）；n表示測定用液體的體積（mL）。

2.2 單因素實驗結(jié)果分析

根據(jù)1.5中實驗方法進行實驗，結(jié)果見圖1。

超聲波清洗機不但提取效果好，而且省時省力，晉西北酸粥和糜米中總酚提取量分別為1.676 mg/g和1.367 mg/g。因此，提取方法確定為超聲波清洗機提?。?0 kHz）。

通過比較甲醇、乙醇、丙酮、蒸餾水和乙酸乙酯5種溶劑的提取效果發(fā)現(xiàn)，丙酮提取的晉西北酸粥和糜米中總酚提取量最高，分別為1.825 mg/g和1.554 mg/g，所以選擇丙酮為提取溶劑。

總酚的提取量隨著丙酮濃度的上升均先升后降。當(dāng)丙酮濃度為60%時，晉西北酸粥中總酚提取量最高（2.361 mg/g），而在80%丙酮溶液中糜米的總酚提取量最大（1.520 mg/g），這可能是由于發(fā)酵改變了糜米的性能和植物組分[14]，使酸粥的總酚在低濃度的丙酮溶液中就能被提取到。

隨著料液比的增大，總酚的提取量逐漸增大。但當(dāng)料液比大于1∶30時，總酚提取量不再明顯增加，這可能是由于溶劑擴散達到了平衡。

當(dāng)超聲波提取40 min時，晉西北酸粥的總酚提取量最大（3.863 mg/g），繼續(xù)提取總酚提取量反而降低，這可能是由于長時間的超聲波對總酚結(jié)構(gòu)造成了破壞。在超聲波提取50 min時，糜米的總酚提取量最大（1.494 mg/g），與40 min的提取效果無顯著差異（P>0.05）。

晉西北酸粥和糜米中的總酚都在50 ℃時提取量最大，再升高溫度則總酚提取量降低，這可能是由于高溫破壞了總酚的結(jié)構(gòu)。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

共設(shè)計了29個實驗，采用Box-Behnken對晉西北酸粥的總酚提取量進行了分析，結(jié)果見表3。晉西北酸粥總酚提取回歸模型方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，該模型的P值小于0.000 1，說明差異極顯著；相關(guān)系數(shù)R2為0.865 2，說明實驗誤差較??；變異系數(shù)為5.24，說明該模型能較好地反映真實的實驗值；失擬項的P值為0.010 7（P<0.05），說明實驗誤差較小，可用該模型推測實驗結(jié)果。由P值可知，A、C、A2、B2、D2極顯著影響酸粥的總酚提取量；B、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、C2對酸粥的總酚提取量無顯著影響。綜上，對晉西北酸粥中總酚提取量有影響的因素為丙酮濃度和料液比。晉西北酸粥中總酚提取量與各實驗因素的回歸方程為Y=221.85－10.99A－6.48B＋11.49C＋6.35D＋1.57AB＋2.49AC－5.23AD－0.495 7BC－8.18BD－3.53CD－24.63A2－12.96B2－2.79C2－22.63D2。

采用Box-Behnken對糜米總酚提取量的實驗設(shè)計和結(jié)果見表5。糜米總酚提取回歸模型方差分析結(jié)果見表6。

由表6可知，模型差異極顯著（P<0.000 1），實驗誤差小（R2=0.967 7>0.9），可較好地反映真實的實驗值（變異系數(shù)為3.85），實驗結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好（失擬項的F值為5.07，>0.1），故該模型可以用來推測實驗結(jié)果。由P值可知A、C、A2、B2、D2對糜米總酚提取量的影響極顯著；D、AD對糜米總酚提取量的影響顯著；B、AB、AC、BC、BD、CD、C2對糜米總酚提取量的影響不顯著，這與晉西北酸粥的實驗結(jié)果有明顯差異。對糜米總酚提取量有影響的因素為丙酮濃度、料液比和提取時間。糜米中總酚提取量與各實驗因素的回歸方程為Y=155.26＋18.86A＋1.11B＋15.45C＋4.03D－5.75AB－1.84AC＋6.79AD－1.65BC+1.39BD－1.79CD－22.23A2－11.08B2+1.75C2－21.44D2。

通過Design-Expert 8.05b軟件可知各因素的交互作用下晉西北酸粥和糜米中總酚提取量，見圖2。

由圖2可知，對于晉西北酸粥而言，丙酮濃度與提取溫度、丙酮濃度與料液比、丙酮濃度與提取時間、提取溫度與料液比、提取溫度與提取時間、料液比與提取時間的交互作用的響應(yīng)曲面較平緩，說明這幾個因素的交互作用對晉西北酸粥總酚提取量的影響微乎其微，這一結(jié)果與方差分析結(jié)果相吻合。在丙酮體積分?jǐn)?shù)為58.06%、料液比為1∶41.13、提取時間為30.57 min和提取溫度為41.81 ℃的條件下，晉西北酸粥總酚的提取量最大，為1.88 mg/g。

與晉西北酸粥不同，只有在丙酮濃度與提取時間交互作用時，對糜米的總酚提取量有顯著影響；而其他因素的交互作用對糜米總酚提取量的作用微弱。在丙酮體積分?jǐn)?shù)為84.78%、料液比為 1∶44.76、提取時間為34.34 min和提取溫度為42.11 ℃的條件下，糜米總酚的提取量最大，為1.51 mg/g。經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化提取條件后，晉西北酸粥總酚提取量約是糜米的1.24倍。

3 討論

糜米是我國晉西北地區(qū)較常見的雜糧種類之一。徐元元等[15]將6種常見雜糧的抗氧化性與2種主糧的抗氧化性進行了對比，發(fā)現(xiàn)糜米中含有比大米和小麥更多的總酚。晉西北酸粥是將糜米自然發(fā)酵后得到的，含有一些功能性低聚糖、抗氧化活性成分、降膽固醇和降血壓功效物質(zhì)[16]。Kariluoto等[8]研究表明，發(fā)酵對谷物總多酚含量及其抗氧化活性具有提高作用。本實驗表明糜米經(jīng)發(fā)酵后總酚含量得到了提高。

采用響應(yīng)面法對晉西北酸粥和糜米的總酚提取量進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，丙酮濃度與料液比的交互作用對晉西北酸粥總酚提取量的影響較大。料液比對糜米總酚提取量的影響比對晉西北酸粥總酚提取量的影響大，這進一步證實了Katina等[14]的觀點。不同溶劑和提取方法對晉西北酸粥和糜米總酚的提取量有明顯的影響。所以，選擇合適的溶劑和提取方法非常重要。

總酚含量較高的糜米經(jīng)自然發(fā)酵后得到了總酚含量更高的晉西北酸粥，這可能是由于發(fā)酵改變了谷物中營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)成分的比例[17-18]。有研究表明，結(jié)合酚是谷物酚類化合物的主要存在形式[19-20]，可以通過酸、堿或酶處理釋放[21]。而晉西北酸粥發(fā)酵過程中有眾多酶系產(chǎn)生，促進了結(jié)合態(tài)酚類的釋放，使其總酚含量增加，從而使晉西北酸粥具有抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，這為下一步開發(fā)具有保健作用的傳統(tǒng)谷物食品提供了理論支撐。

參考文獻：

[1]楊聯(lián)芝，臧盛，高清菡，等.糜子皮殼中多酚物質(zhì)的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（21）：11482-11485.

[2]張麗珍，馮耐紅，衛(wèi)天業(yè)，等.糜米低醇飲料的研制[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（1）：111-113.

[3]薛建崗.內(nèi)蒙古西部地區(qū)自然發(fā)酵酸粥化學(xué)成分及微生物組成分析[J].食品科技，2013，38（7）：10-16.

[4]趙國玲，劉承初.植物性食材的酚類化合物及其對機體的抗氧化保護[J].生物技術(shù)通報，2009（Z）：40-45.

[5]劉春麗，楊躍寰.荔枝果肉貯藏過程中酶促褐變物質(zhì)的變化規(guī)律[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：355-356.

[6]賀佳，李多偉，智彩輝，等.茶葉有效成分綜合提取分離生產(chǎn)工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）：247-250.

[7]肖鳳艷，孫立彬.生地黃總多酚超聲法提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：294-295.

[8]KARILUOTO S， AITTAMAA M， KORHOLA M， et al. Effects of yeasts and bacteria on the levels of folates in rye sourdoughs[J].International Journal of Food Microbiology，2006，106（2）：137-143.

[9]BAS D， BOYACI I H. Modeling and optimization I： usability of response surface methodology[J].Journal of Food Engineering，2007，78（3）：836-845.

[10]郭雷，陳宇.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取滸苔多糖的工藝[J].食品科學(xué)，2010，31（16）：117-121.

[11]李斌斌.利用蘆筍老莖栽培姬松茸的研究[D].太原：山西大學(xué)，2011.

[12]DJERIDANE A， YOUSFI M， NADJEMI B， et al. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds[J].Food Chemistry，2006，97（4）：654-660.

[13]VOHRA A， SATYANARAYANA T. Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J].Process Biochemistry，2002，37（9）：999-1004.

[14]KATINA K， LIUKKONEN K H， KAUKOVIRTA-NORJA A， et al. Fermentation-induced changes in the nutritional value of native or germinated rye[J].Journal of Cereal Science，2007，46：348-355.

[15]徐元元，國旭丹，賀麗霞，等.常見6種雜糧與2種主糧的抗氧化活性比較研究[J].食品科學(xué)，2012，33（7）：20-25.

[16]李玉珍，肖懷秋，蘭立新.我國大米發(fā)酵食品研究進展[J].江蘇調(diào)味副食品，2008，25（6）：33-37.

[17]HEINI?R L， KATINA K， WILHELMSON A， et al. Relationship between sensory perception and flavour-active volatile compounds of germinated， sourdough fermented and native rye following the extrusion process[J].Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie，2003，36：533-545.

[18]KATINA K， LAITILA A， JUVONEN R， et al. Bran fermentation as a means to enhance technological properties and bioactivity of rye[J].Food Microbiology，2007，24：175-186.

[19]DYKES L， ROONEY L W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits[J].Cereal Foods World，2007，52（3）：105-111.

[20]VAHER M， MATSO K， LEVANDI T， et al. Phenolic compounds and the antioxidant activity of the bran， flour and whole grain of different wheat varieties[J].Procedia Chemistry，2010，2（1）：76-82.

[21]BARTOLOME B， GOMEZ-CORDOVES C. Barley spent grain： release of hydroxycinnamic acids （ferulic and p-coumaric acids） by commercial enzyme preparations[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79：435-439.